CN103627665A

CN103627665A - 一种基于荧光的全细胞生物传感器镉离子浓度检测方法

Info

Publication number: CN103627665A
Application number: CN201210309670.2A
Authority: CN
Inventors: 陶虎春; 彭智文; 李鹏松; 雷涛; 魏雪艳; 苏捷; 于太安
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-03-12

Abstract

一种基于荧光的全细胞生物传感器镉离子浓度检测方法，本发明提供多种用于镉离子浓度检测的全细胞生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中镉离子浓度的方法。所述的全细胞是指有生物代谢活性的细菌，此发明用的细菌包括大肠杆菌和恶臭假单胞菌。所述生物传感器由转录调控蛋白CadR识别镉离子并与其结合，结合有镉离子的CadR结合操纵子序列（SEQ2），启动荧光蛋白的转录，将镉离子量转化为荧光蛋白的表达量，通过对荧光蛋白荧光强度的检测达到检测镉离子浓度的目的。

Description

一种基于荧光的全细胞生物传感器镉离子浓度检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域,具体为一种利用能合成绿色荧光蛋白的全细胞传感器定量检测水溶液中镉离子浓度的技术。

背景技术

人类的工农业生产活动，使镉以各种形态进入环境中，产生大量含镉废水，对环境造成严重污染。长期以来，水溶液中镉离子浓度的检测分析方法主要依赖于化学和物理手段，包括比色分析法、原子吸收光谱法、电化学极谱法、等离子发射光谱法等。由于以上方法需要昂贵的仪器设备，样品预处理复杂而耗时等，因此，低成本、易操作、快速的定量镉离子检测方法的开发是一个具有实际应用价值的工作。

全细胞生物传感器是以能结合特定待测物质的转录调控蛋白作为感应原件，该转录调控蛋白识别并结合启动子当中或附近的特定DNA序列启动信号蛋白的表达，通过对信号强弱的检测，实现待测物浓度的确定。

相比与传统的检测分析方法，生物传感器具有如下特点：1）灵敏性好，特异性高，精度高；2）无需繁杂的样品预处理过程，操作过程简单，省时方便；3）通过培养可以获得大量生物传感器，易于批量生产；4）成本低，易于普及推广。

MerR家族蛋白是具有结合特定金属离子能力的转录调控蛋白。MerR家族蛋白能结合特定序列的操纵子。MerR家族蛋白结合特定的重金属离子后结构发生变化，改变其对操纵子的结合能力，从而诱导特定序列的表达。CadR蛋白是具有镉离子特异性识别能力的MerR家族蛋白。本发明以CadR调控系统为基础，构建全细胞生物传感器，实现检测镉浓度的目的。

发明内容

本发明的目的是，提供多种用于镉离子浓度检测的全细胞生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中镉离子浓度的方法。

所述的全细胞是指转化有荧光蛋白报告质粒的、具有生物代谢活性的重组细菌。荧光蛋白报告质粒是一个重组质粒，质粒上的核心部件包括转录调控蛋白CadR基因（SEQ 1）、CadR特异结合的操纵子序列（SEQ 2）和该操纵子序列直接调控的绿色荧光蛋白基因。此发明用的宿主细菌包括大肠杆菌和恶臭假单胞菌。

所述生物传感器表达转录调控蛋白CadR， CadR识别并结合镉离子，结合有镉离子的CadR结合操纵子序列，启动绿色荧光蛋白的转录，将镉离子浓度转化为绿色荧光蛋白的表达量，通过对绿色荧光蛋白荧光强度的检测达到检测镉离子浓度的目的。

附图说明

图1是本发明质粒构建示意图

图2是本发明实施例中大肠杆菌全细胞传感器测得的荧光强度随镉离子浓度变化曲线图

图3是本发明实施例中恶臭假单胞菌全细胞传感器测得的荧光强度随镉离子浓度变化曲线图

具体实施方式

恶臭假单胞菌全细胞生物传感器的制备：

利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增镉特异性操纵子序列（见核苷酸序列表）。将所述操纵子序列和绿色荧光蛋白编码基因构建入质粒，使操纵子序列直接调控绿色荧光蛋白的表达（见图1）。

将构建好的质粒按如下方法转化入恶臭假单胞菌：

1）取生长良好的对数期恶臭假单胞菌菌液，4℃条件下3000×g离心5分钟，弃上清；

2）用1/2体积的预冷的0.1M CaCl₂ 重悬，4℃条件下3000×g离心5分钟，弃上清；

3）用1/10体积的含20%甘油的0.1M CaCl₂ 重悬菌体，制成恶臭假单胞菌感受态细胞；

4）取质粒0.1-0.2μg加入到100μl 感受态细胞，混匀，冰置1小时（多余的感受态细胞可放置-80℃冻存）；

5）42℃水浴热激2分钟；

6）冰置2分钟；

7）加入900μl无菌LB培养基（1% NaCl，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物），30℃温浴60-90分钟；

8）取100-200μl菌液均匀涂布于选择性LB平板。

大肠杆菌全细胞生物传感器的制备：

用上述方法构建大肠杆菌全细胞生物传感器。

镉离子浓度检测方法如下：

1）取转化所述质粒的全细胞菌落，接种于含有40mg/l卡那霉素的M9液体培养基（1L培养基中含：6 g Na₂HPO₄，3 g KH₂PO₄，0.5 g NaCl，1 g NH₄Cl，0.25 g MgSO₄ × 7H₂O，0.01 g CaCl₂，额外添加1 g 葡萄糖和5 g酪蛋白水解物，pH 7.4）；

2）取对数期菌液（OD₆₀₀= 0.6-0.8），用上述M9培养基稀释到OD₆₀₀为0.1；

3）向96孔板中加入稀释后的菌液和已知的镉离子溶液，每个孔添加100μl稀释后菌液和100μl镉离子溶液；

4）30℃无振荡培养2小时后，使用酶标仪检测各菌液的荧光强度，通过计算机绘制出标准曲线，得到曲线方程；

5）通过上述想同的操纵方法，测定待测镉离子溶液的荧光强度，带入标准曲线中的方程计算出该待测液中镉离子浓度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQ 1：

TTAATGCCCGTGGCTTCGCCCTACATGCGAATGCTCGGTTTCCGGCACCGATACCGCCCCGTTCGTCTCCAGTTGCTGCAAGATCGCACACTCCGCCCCTTGTGCATTGCAGCGCCGCCGCAGCTCCACCAGCTGTTCCTGCAACGCCACCAGACCATCGATCCGTGCCTGCACATGCTCGATATGCTCGTCGATCAGCGCATTGACGCTGCCGCACGAATCATCGGGGCTGTCGCGCAGGCGTAGCAGGCTGCGGATTTCATCCAGGGTCATGTCCAGGGTGCGGCAGTTGCGGATGAAGGTAAGCCGCTCGACGTGGGCCTGGGTGTACAGCCGGTAGTTGCCGTCGCTGCGTGCCGGCTCCGGCAGCAGCTGTTCACGCTCGTAGTAGCGGATGGTTTCCACGGCGCAGTCGGTGGCTTTGGCCAGTTCTCCGATCTTCAT

SEQ 2：

CACGAAATTCTCCAGCAAGTGGCTTGACCCTATAGTGGCTACAGGGTGTTCACTTGGCAACAGGCTCAAATTAAGGATGACCCC

Claims

1.多种用于镉离子浓度检测的全细胞生物传感器，以及利用所述生物传感器定量检测水溶液中镉离子浓度的方法。

2.一种镉离子诱导的荧光蛋白报告质粒，其特征在于，是一个由转录调控蛋白CadR基因（SEQ 1）、CadR特异结合的操纵子序列（SEQ 2）和该操纵子序列直接调控的荧光蛋白基因为核心部件组成的重组质粒。

3.权利要求1所述的多种全细胞生物传感器，其特征在于，将荧光蛋白报告质粒转化到活细菌内，得到具有检测功能的重组细菌，宿主细菌包括但不限于大肠杆菌、恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌等。

4.权利要求2所述的荧光蛋白，其特征在于，包括但不限于绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白等。

5.如权利要求2所述的报告质粒，其功能特征在于，转录调控蛋白CadR基因表达的CadR蛋白结合操纵子序列，直接抑制荧光蛋白的表达；当镉离子存在时，镉离子与CadR蛋白结合，改变CadR蛋白结构，即改变其与操纵子序列的结合能力，使其从操作子序列上脱落，荧光蛋白的表达激活，将镉离子浓度信号转化为荧光强度信号。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以已知浓度的镉离子溶液诱导制作荧光强度标准曲线获得曲线方程，将测得的未知溶液荧光强度代入方程，计算得到未知溶液浓度。