CN104237193A - 一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法，在未加入焦磷酸酶，只有焦磷酸存在时，焦磷酸与二价铜形成络合物，抗坏血酸钠不能够还原络合的二价铜为一价铜作为催化剂，叠氮香豆素和丙炔醇也不能发生1,3-偶极环加成反应，从而体系的荧光强度很低；但是在同时加入焦磷酸酶的情况下，焦磷酸酶能够水解焦磷酸抑制二价铜络合物的形成，点击化学反应能够继续发生，体系的荧光强度大幅争强且荧光强度与加入的焦磷酸酶的量存在线性关系。该传感器成功地应用于焦磷酸酶抑制剂氟化钠的检测，本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于点击化学的荧光化学传感器检测焦磷酸酶的方法。
背景技术
焦磷酸酶(EC 3.6.1.1)或无机焦磷酸酶是一种水解酶类可以特异性地把焦磷酸(P2O7 4?, PPi)水解为无机磷酸盐。焦磷酸酶水解焦磷酸是一个高能量释放反应,它可偶联到一些热力学上不利的转化过程，以便驱动这些转化进行（Biswas et al., 2013. Nucleic acids research 41, e56.; Cestari et al., 2013. Journal of biomolecular screening 18, 490-497.）。早期研究表明，焦磷酸酶在脂代谢（包括脂合成与分解）、钙吸收以及骨形成和脱氧核糖核酸（DNA）合成中扮演重要角色（Ilias et al., 2006. Biochimica et biophysica acta 1764, 1299-1306.; Heinonen, J., 1970. Analytical biochemistry 37, 32-43.）。因此焦磷酸酶在能量合成等代谢过程中至关重要，生物体中焦磷酸酶的损耗可导致细胞的死亡（Tamburini et al., 2014. Soil Science Society of America Journal 78, 38.）。
点击化学（Kolb et al., 2001. Angew. Chem 40, 2004-2021.）是在2001年由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首先提出的，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。点击化学具有模块化、可靠、高效率、高选择性、反应条件温和、产物收率高、副反应少、分离提纯简单等特点，被广泛应用于环境、化学及生物医学等众多领域。
目前检测焦磷酸酶的方法有放射性标记法（Cartier et al., 1971. Analytical biochemistry 44, 397-403.），生物发光法（Eriksson et al., 2001. Analytical biochemistry 293, 67-70.），酸碱度分析法（YA et al., 1982. Acta Chemica Scandinavica. Series B: Organic Chemistry and Biochemistry 36, 689-694.），纳米金比色法（Deng et al., 2013. Analytical chemistry 85, 9409-9415.）等。但是这些方法的普遍缺点是要么需要用到大型的仪器设备，这类仪器设备不但价格昂贵，操作复杂，而且不方便操作，要么需要特殊的试剂，价格较高且有些会对人体产生伤害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法，基于点击化学的以荧光信号采集方式的能够快速、简便的检测焦磷酸酶的方法。该方法对焦磷酸酶的检测灵敏度高、特异性好。在0.5 mU到10 mU的浓度范围内对焦磷酸酶的检测呈现良好的线性响应，检测限为0.2 mU。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测焦磷酸酶荧光传感器的制备方法，配置不同浓度单位的焦磷酸酶溶液，将不同浓度相同体积焦磷酸酶溶液分别加入到含有焦磷酸的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，水浴保温，加入铜离子继续保温，继续加入叠氮香豆素，丙炔醇及抗坏血酸钠，避光放置，用荧光分光光度计测定体系的荧光强度，记录数据。
具体包括以下步骤：
（1）配置不同浓度单位的焦磷酸酶溶液；
（2）将步骤（1）中不同浓度相同体积焦磷酸酶分别加入到含有125uM焦磷酸的10 mM，pH 7.2 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中，水浴37℃保温60分钟；
（3）将100uM铜离子加入到上述溶液中继续保温20分钟；
（4）在混合液中继续加入250uM叠氮香豆素，250uM丙炔醇及400uM抗坏血酸钠；避光放置15分钟；
（5）用970-CRT荧光分光光度计测定体系的荧光强度，记录数据；
（6）根据焦磷酸酶浓度和荧光强度值，计算得到其线性方程为Y=404.6+333lgX，其中Y为荧光强度值；X为其所对应的焦磷酸酶浓度，单位为mU。
步骤（1）中所述的焦磷酸酶溶液是用购置于sigma公司的冻干粉称取一定量配成高浓度母液稀释得到。
步骤（2）中所述的不同浓度焦磷酸酶加入量为2 uL，含有焦磷酸的缓冲液体积为178 uL；
步骤（3）中所述的铜离子加入量为2 uL；
步骤（4）中所述的叠氮香豆素根据文献（Qiu et al.，2013. Biosensors and Bioelectronics 42, 332-336.）合成，未做进一步提取纯化；叠氮香豆素和丙炔醇加入的量均为5 uL，抗坏血酸钠加入量为8 uL；
步骤（5）中所述荧光测定条件为:石英比色皿容量300 uL，光程10mm，激发光波长395nm，采集的发射波长范围为400-600nm，激发与发射波长狭缝均为10nm。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明的所用的点击试剂叠氮香豆素合成方法简单、容易得到且具有良好的活性和稳定性，其他试剂也都比较便宜。
（2）本发明的操作步骤简单、便捷、灵敏、成本低而且无毒害，实用性强。
（3）本发明的传感器在识别焦磷酸酶及酶抑制剂氟化钠的过程中，能快速测定荧光值，有利于快速的分析检测。
附图说明
图1为本发明所述的基于点击化学的荧光化学传感器对焦磷酸酶检测的示意图。
图2为本发明所述的荧光传感器在不同焦磷酸酶浓度中荧光光谱；从a 到 i浓度分别为 0.0mU、 0.5 mU、1 mU、2 mU、4 mU、6 mU、8 mU、10 mU和20 mU。
图3为本发明所述的荧光传感器在其它不同蛋白质或酶中的荧光光谱；从左到右分别为空白、葡萄糖氧化酶（0.22 U）、溶菌酶（0.48 U）、人血清白蛋白（6.0×10-5M）、核酸外切酶I（0.1 U）、核酸外切酶III（1 U）和焦磷酸酶（4mU）。
图4 为本发明所述的荧光传感器应用于焦磷酸酶抑制剂氟化钠的检测的荧光光谱。从 a 到 f依次为0μM、2.0μM、1.6μM、1.2μM、0.8μM、0.4μM。
具体实施方式
实施例1
以下实施例结合附图来说明应用本发明所述方法制备荧光焦磷酸酶传感器并将其应用于焦磷酸酶抑制剂氟化钠浓度的检测的操作过程：
1、焦磷酸酶水解焦磷酸。具体步骤如下：
A、将酶冻干粉称取一定重量配置为1 U/μL的母液，并按照梯度稀释为所需的浓度；
B、将2μL不同梯度的焦磷酸酶加入到含有125μM焦磷酸的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液（10mM HEPES，pH=7.2）中混合均匀，室温下置于37℃水浴60分钟；
C、在混合溶液中加入2μL 浓度为10mM的硫酸铜溶液，37℃水浴继续反应20分钟。
2、点击化学荧光检测焦磷酸酶活力，具体步骤如下：
（1）将实施例1-1 中的混合液从水浴中取出，加入5μL 浓度为10mM叠氮香豆素，5μL 浓度为10mM丙炔醇及8μL 浓度为10mM抗坏血酸钠，振荡均匀后避光放置15分钟。
（2）用移液枪移取100μL反应混合液至石英比色皿中，测量体系的荧光强度。
实施例2
1、焦磷酸酶抑制剂氟化钠浓度的检测，具体步骤如下：
向含有4.0 mU焦磷酸酶的缓冲液中分别加入0μM、 2.0μM、1.6、1.2μM、0.8μM 和 0.4μM酶抑制剂氟化钠，室温放置30分钟后，加入125μM焦磷酸水浴37℃保温60分钟，然后加入100μM硫酸铜，继续水浴保温20分钟，最后加入点击试剂避光放置15分钟后用荧光分光光度计测量荧光，记录数据。
2、本发明所述方法制备荧光焦磷酸酶传感器对焦磷酸酶检测的特异性，具体步骤如下：
为了检测本发明所述的荧光焦磷酸酶传感器的特异性，将实施例1-1中所使用的焦磷酸酶换成其他干扰物质，分别为空白溶液、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、人血清白蛋白、核酸外切酶I、核酸外切酶III。如图3所示，从左到右为该传感器在不同干扰物质中所示的荧光强度值，从左到右分别为空白溶液、葡萄糖氧化酶（0.7 mM）、溶菌酶（0.4 mM）、人血清白蛋白（0.5 mM）、核酸外切酶I（0.7 mM）、核酸外切酶III（0.5 mM）和焦磷酸酶的浓度为4 mU，其相对应的荧光颜色变化如图中所示，从左到右分别为空白溶液、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、人血清白蛋白、核酸外切酶I、核酸外切酶III和焦磷酸酶，除了焦磷酸酶有明显的黄绿色荧光，其余均为浅黄色。结果说明本发明所述方法制备荧光化学传感器对焦磷酸酶检测有较好的特异性。在0.5 mU到10 mU的浓度范围内对焦磷酸酶的检测呈现良好的线性响应，检测限为0.2 mU。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种检测焦磷酸酶荧光传感器的制备方法，其特征在于：配置不同浓度单位的焦磷酸酶溶液，将不同浓度相同体积焦磷酸酶溶液分别加入到含有焦磷酸的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，水浴保温，加入铜离子继续保温，继续加入叠氮香豆素，丙炔醇及抗坏血酸钠，避光放置，用荧光分光光度计测定体系的荧光强度，记录数据。
2.根据权利要求1所述一种检测焦磷酸酶荧光传感器的制备方法,其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）配置不同浓度单位的焦磷酸酶溶液；
（2）将步骤（1）中不同浓度相同体积焦磷酸酶溶液分别加入到含有125μM焦磷酸的10 mM、pH 7.2 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，37℃水浴保温60分钟；
（3）将100μM铜离子加入到上述溶液中继续保温20分钟；
（4）在混合液中继续加入250μM叠氮香豆素，250μM丙炔醇及400μM抗坏血酸钠；避光放置15分钟；
（5）用荧光分光光度计测定体系的荧光强度，记录数据。
3.一种如权利要求1所述的方法制得的用于检测焦磷酸酶的荧光传感器。
4.一种如权利要求1所述的方法制得的用于检测焦磷酸酶的荧光传感器的应用，其特征在于：通过点击反应借助于荧光光谱对溶菌酶进行检测。
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