CN106018387A - 一种atp荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产品检测技术领域，提供一种荧光强度强、检测灵敏、单位时间内荧光反应速率高、底物循环利用、荧光信号输出周期增加的ATP荧光检测方法，包括以下处理步骤：（1）样品采集；（2）在反应容器中加入萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶荧光素再生酶复合结构、反应底物萤火虫荧光素、镁离子、半胱氨酸，通入适量的溶剂，充分混匀溶解，得到反应体系混合物溶液；（3）底物混合物溶液充分溶解待测样品中的ATP，在大气氧气条件下，促发反应，产生氧化态荧光素及光；（4）氧化态荧光素在萤火虫荧光素再生酶荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；（5）采集光信号：将步骤（3）反应产生的光进行采集。

Description

一种ATP荧光检测方法
技术领域
本发明涉及产品检测技术领域，尤其涉及一种ATP荧光检测方法。
背景技术
三磷酸腺苷 (ATP) 存在于从微生物到高等动植物等生物体的细胞中，主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要来源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP的快速高效测定，对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程、进行药物敏感实验以及食品卫生监控都有非常重要的意义。
食品安全快速检测，是对食品/饮料进行实时采样，通过检测样品ATP含量反映样品中微生物总数，进而指示食品/饮料的新鲜程度。目前市面上的ATP检测产品，都是基于萤火虫荧光蛋白发光反应机理（萤火虫荧光蛋白酶，催化荧光素与ATP定量反应），利用荧光强度反映ATP含量。反应式如图1所示，这种ATP检测产品存在局限性，主要受萤火虫荧光蛋白的稳定性、荧光素半衰期及荧光强度太弱等因素影响，导致灵敏度不足，且检测试剂有效工作期太短。
发明内容
因此，针对以上内容，本发明提供一种荧光强度强、检测灵敏、单位时间内荧光反应速率高、底物循环利用、荧光信号输出周期增加的ATP荧光检测方法。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种ATP荧光检测方法，包括以下处理步骤：
（1）样品采集：采集需要检测的样品；
（2）在反应容器中加入萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构、反应底物萤火虫荧光素、镁离子、半胱氨酸，通入适量的溶剂，充分混匀溶解，得到反应体系混合物溶液；
（3）底物混合物溶液充分溶解步骤（1）采集的需要检测的样品中的ATP，在大气氧气条件下，促发反应，产生氧化态荧光素及光；
（4）氧化态荧光素在萤火虫荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；
（5）采集光信号：将步骤（3）反应产生的光进行采集。
优选的，还包括对步骤（5）采集的光信号进行放大处理，接着通过受光二极管的光电信号转化，将荧光信号转化为电信号，再通过检测仪器自身的电路系统报告信号终端。
优选的，所述萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构包括游离态双酶以及通过短肽、纤维小体偶联的双酶。
优选的，所述反应第五萤火虫荧光素包括D型萤火虫荧光素及其衍生物。
优选的，所述半胱氨酸包括D型半胱氨酸及L型半胱胺氨酸。
优选的，所述溶剂包括纯净水、磷酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液。
优选的，所述萤火虫荧光素、萤火虫荧光素酶与萤火虫荧光素再生酶复合结构、镁离子、半胱氨酸的反应浓度为0.01-10m mol/L、0.01-10mg/mL、0.01-100m mol/L、0.01-10m mol/L。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：本发明的ATP荧光检测方法，包括以下处理步骤：采集需要检测的物品，在反应容器中加入萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构、反应底物萤火虫荧光素、镁离子、半胱氨酸，通入适量的纯净水，充分混匀溶解，得到反应体系混合物溶液，反应体系混合物溶液充分溶解待测样品中的ATP，在有氧的大气环境中促发反应，产生氧化态荧光素及光，氧化态荧光素在萤火虫荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；利用萤火虫荧光素再生酶对底物萤火虫荧光素再利用，在单位时间内提高荧光反应速率，增强荧光强度，进而增强荧光输出信号，同时使原本不可再生的底物萤火虫荧光素循环利用，增加荧光信号输出周期；接着对反应产生的光进行采集；进一步的，通过光信号放大处理以及通过受光二极管的光电信号转化，将荧光信号转化为电信号，再通过检测仪器自身的电路系统报告信号终端，利用物理的光电信号转换对荧光信号进行放大处理，提高信号指示精度。采用本发明的检测方法，荧光信号延长24～72小时并保持稳定的信号强度，荧光信号强度提高了1～100倍。
附图说明
图1为本发明背景技术的反应示意图；
图2为本发明实施例中的反应式；
图3为本发明实施例中的反应模式图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
本发明的实施例为：
参考图2及图3，一种ATP荧光检测方法，包括以下处理步骤：
（1）样品采集：采集需要检测的牛肉样品5g；
（2）在反应容器中加入萤火虫荧光素0.25mMol/L、萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构0.2 mg/L、反应底物萤火虫荧光素0.2 mMol/L、镁离子10 mMol/L、半胱氨酸5 mMol/L，通入适量的纯净水、磷酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液，充分混匀溶解，得到底物混合物溶液；
（3）底物混合物溶液充分溶解步骤（1）采集的需要检测的样品中的ATP，促发反应，产生氧化态荧光素及光；
（4）氧化态荧光素在荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；
（5）采集光信号：将步骤（3）反应产生的光进行采集；
（6）放大处理，接着通过受光二极管的光电信号转化，将荧光信号转化为电信号，再通过检测仪器自身的电路系统报告信号终端。
本发明的ATP荧光检测方法，包括以下处理步骤：采集需要检测的物品，在反应容器中加入萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构、反应底物萤火虫荧光素、镁离子、半胱氨酸，通入适量的纯净水，充分混匀溶解，得到反应体系混合物溶液，反应体系混合物溶液充分溶解待测样品中的ATP，在有氧的大气环境中促发反应，产生氧化态荧光素及光，氧化态荧光素在萤火虫荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；利用萤火虫荧光素再生酶对底物萤火虫荧光素再利用，在单位时间内提高荧光反应速率，增强荧光强度，进而增强荧光输出信号，同时使原本不可再生的底物萤火虫荧光素循环利用，增加荧光信号输出周期；接着对反应产生的光进行采集；进一步的，通过光信号放大处理以及通过受光二极管的光电信号转化，将荧光信号转化为电信号，再通过检测仪器自身的电路系统报告信号终端，利用物理的光电信号转换对荧光信号进行放大处理，提高信号指示精度。采用本发明的检测方法，荧光信号延长24～72小时并保持稳定的信号强度，荧光信号强度提高了1～100倍。
其中，本发明的萤火虫荧光素酶和萤火虫荧光素再生酶的单体及复合物结构都是通过微生物发酵生长合成的，通过基因表达调控随着细菌生成代谢产生，通过对基因的表达调控提高了这两种酶的单体及其融合表达复合结构的蛋白稳定性和生物活性，本发明的萤火虫荧光素酶和萤火虫荧光素再生酶已为市场公知的物质。
以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

Claims (7)

1.一种ATP荧光检测方法，其特征在于，包括以下处理步骤：
（1）样品采集：采集需要检测的样品；
（2）在反应容器中加入萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构、反应底物萤火虫荧光素、镁离子、半胱氨酸，通入适量的溶剂，充分混匀溶解，得到反应体系混合物溶液；
（3）底物混合物溶液充分溶解步骤（1）采集的需要检测的样品中的ATP，在大气氧气条件下，促发反应，产生氧化态荧光素及光；
（4）氧化态荧光素在萤火虫荧光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被还原为萤火虫荧光素，促使反应继续进行；
（5）采集光信号：将步骤（3）反应产生的光进行采集。
2.根据权利要求1所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：还包括对步骤（5）采集的光信号进行放大处理，接着通过受光二极管的光电信号转化，将荧光信号转化为电信号，再通过检测仪器自身的电路系统报告信号终端。
3.根据权利要求1或2所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：所述萤火虫荧光素酶及萤火虫荧光素再生酶复合结构包括游离态双酶以及通过短肽、纤维小体偶联的双酶。
4.根据权利要求1或2所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：所述反应底物萤火虫荧光素包括D型萤火虫荧光素及其衍生物。
5.根据权利要求1或2所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：所述半胱氨酸包括D型半胱氨酸及L型半胱胺氨酸。
6.根据权利要求1或2所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：所述溶剂包括纯净水、磷酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液。
7.根据要求6所述的ATP荧光检测方法，其特征在于：所述萤火虫荧光素、萤火虫荧光素酶与萤火虫荧光素再生酶复合结构、镁离子、半胱氨酸的反应浓度为0.01～10m mol/L、0.01～10mg/mL、0.01～100m mol/L、0.01～10m mol/L。
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