CN103207167B - 用于快速检测线粒体内atp的荧光共振体系的制备方法 - Google Patents

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用于快速检测线粒体内ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：步骤一：提供一种Cy3荧光标记的ATP适配体和MTS序列；步骤二：将QDs与ATP适配体互补链和MTS进行偶联反应，得到QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），浓度为1uM；步骤三：将步骤二得到的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的荧光共振体系，本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测；并且通过特异的穿膜多肽-线粒体定位融合序列（MTS)实现了对线粒体内ATP浓度变化的实时监控，为ATP的细胞内、体内检测监控提供了一种新的方法。

Description

用于快速检测线粒体内ATP的荧光共振体系的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术和快速诊断检测领域，特别涉及用于快速检测线粒体内ATP浓度的荧光共振体系的制备方法，适用于细胞生物学线粒体功能方面的应用。
技术背景
三磷酸腺苷(ATP)存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中。ATP在细胞体内主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要来源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个重要标志物。ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过检测ATP含量，可以检测食品、水、啤酒、药品、化妆品等样品中的微生物含量，从而反应出其受污染的程度。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，通过监测活细胞线粒体内ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。
传统的ATP检测方法有生物发光法、高效液相色谱法和同位素示踪法等。其中高效液相色谱法操作复杂且检测时间较长；同位素示踪法虽检测灵敏度较高，但污染较大限制其应用。采用生物发光方法是目前较为流行的方法之一，该方法基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点，而ATP含量是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度与样品中所含的ATP量成正比，需利用高灵敏度的仪器测定光的强度进行定量分析。而目前众多的ATP检测方法多适用于体外ATP检测，对活细胞线粒体内ATP的检测涉及较少。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，提高ATP检测的灵敏度以及实现对细胞内ATP尤其是线粒体内ATP浓度的实时监控，本发明的目的在于提供用于快速检测线粒体内ATP浓度的荧光共振体系的制备方法，利用ATP与其配体链（aptamer)的特异性结合原理，利用荧光能量共振转移技术，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，从而实现对ATP的快速检测；同时利用特异的穿膜多肽-线粒体定位融合序列（MTS)将上述能量共振体系转移到细胞线粒体中，可实现实时监测线粒体内ATP浓度的变化情况，从而可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质对线粒体内ATP合成的影响；本发明操作简单，具有测试样品量低、灵敏性高，检测速度快等优点，可同时实现ATP的体外及体内检测。
为实现上述目的，本发明通过以下的技术方案实现，
用于快速检测线粒体内ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体以及MTS融合多肽，ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’，MTS融合多肽序列信息为：（a）YGRKKRRQRRR、（b）YARAAARQARA、（c）YGRKKRRQRRRMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN或（d）YARAAARQARAMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN；
步骤二：将QDs与ATP适配体互补链、MTS融合多肽进行偶联反应，得到线粒体定位的QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），ATP-aptamer适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’（ProbeDNA，DNAp）；
步骤三：将步骤二得到的线粒体定位的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体反应，得到ATP-aptamer适配体与互补链相互作用后的荧光共振体系，
步骤四：通过将上述步骤三得到的荧光共振分子探针体系与目标细胞在37度进行孵育，半小时后，利用培养基清洗未进入细胞内的分子探针体系，并通过共聚焦显微镜检测荧光共振分子探针体系的细胞内定位以及细胞内线粒体ATP浓度的变化。
本发明采用能量共振转移原理，以带有荧光染料Cy3标记的ATP-aptamer适配体与量子点标记的ATP适配体互补链，通过杂交反应形成双链，构建能量共振转移体系。利用ATP与ATP适配体特异性识别结合的原理，以量子点为能量供体，Cy3为能量受体进行能量共振转移，检测荧光信号强度比值改变。利用MTS融合多肽修饰使上述能量共振体系特异性标记到细胞线粒体中，进行线粒体内ATP浓度的检测；在无ATP浓度较低的条件下，与QDs偶联的ATP适配体互补链与Cy3标记的ATP适配体形成双链进行能量转移，QDs荧光下降，Cy3荧光增强；当ATP浓度增加时，ATP与ATP-aptamer适配体特异性识别，双链解体，能量共振转移体系降低或消失，QDs荧光增强，Cy3荧光降低，从而实现对ATP的快速检测；当加入具有抑制或增强线粒体功能的药物时，线粒体内ATP的浓度将发生变化，QDs和Cy3的荧光强度随之发生变化。可以通过共聚焦显微镜监测线粒体内分子探针体系荧光强度的变化情况，从而计算出其线粒体内ATP的浓度，实现对线粒体功能或者药物的评价。本方法操作简单，样品消耗少，灵敏度高，可对不同细胞内线粒体在不同情况下的ATP浓度进行快速检测。
本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测；并且利用特异的穿膜多肽-线粒体定位融合序列（MTS)实现了对线粒体内ATP浓度变化的实时监控，为ATP的细胞内、体内实时检测监控提供了一种新的方法。
本发明设计了一种快速、高灵敏度检测细胞线粒体内ATP浓度变化的体系。以QDs标记的DNA-aptamer为分子探针，利用荧光能量共振转移原理，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，从而实现对ATP进行定量检测；并利用MTS融合多肽将上述能量共振体系转移到细胞线粒体中，可实现实时监测细胞线粒体内ATP浓度的变化。本发明可以提高细胞内线粒体ATP浓度检测的灵敏度、缩短检测时间，降低成本。
附图说明
图1为偶联反应原理示意图。
图2为荧光共振体系反应原理示意图。
图3为当ATP存在时本荧光共振体系的工作原理示意图。
图4为本发明中各原理示意图图例说明。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细叙述。
用于快速检测线粒体内ATP的荧光共振体系的制备方法，
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP适配体和MTS融合多肽，ATP适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，浓度为0.2uM-1uM；
步骤二：将QDs与ATP适配体互补链和MTS融合多肽进行偶联反应，得到线粒体定位的QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点（COOH-QDs），浓度为1uM，ATP适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，浓度为10-500uM；
步骤三：将步骤二得到的线粒体定位的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体反应，得到ATP-aptamer适配体与互补链相互作用后的荧光共振体系；
步骤四：通过将上述步骤三得到的荧光共振分子探针体系与目标细胞在37度进行孵育，半小时后，利用培养基清洗未进入细胞内的分子探针体系，并通过共聚焦显微镜检测荧光共振分子探针体系的细胞内定位以及细胞内线粒体ATP浓度的变化。
所述ATP适配体为3’-Cy3修饰，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’；ATP适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’（ProbeDNA，DNAp）；MTS融合多肽序列信息为：（a）YGRKKRRQRRR；（b）YARAAARQARA；（c）YGRKKRRQRRRMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN；（d）YARAAARQARAMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN。
本发明中，步骤QDs与ATP适配体互补链和MTS融合多肽的偶联体按如下方法制备，反应原理参照图1：将COOH-QDs加入到反应器中，300rpm，5min，震荡混匀；加入计算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS（10mg/mL，10mM硼酸盐缓冲液，pH7.4）活化30min；加入计算好用量的DNAp和MTS融合多肽，继续震荡混合均匀，300rpm，室温反应2h（若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃）；反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心3min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物（MTS-QDs-DNAp）复溶于适当的目标偶联物缓冲液中。
反应用量：
本发明中步骤三荧光共振体系如下方法制备，原理参照图2：在MTS-QDs-DNAp溶液中加入适量ATP适体链，37℃，杂交30min，构建fret体系，用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物（MTS-QDs-DNAp-Cy3体系）复溶于无血清培养液中，观察其荧光情况。
参照图3，将得到的MTS-QDs-DNAp-Cy3加入到已贴壁培养至的细胞中，37℃，孵育1h，PBS(PH7.4)冲洗3次，共聚焦显微镜观察其荧光情况；加入一定浓度的待评价药物（改变线粒体ATP合成活性），37℃，共聚焦显微镜实时观察其荧光强度改变，进一步评估其线粒体内ATP浓度和对线粒体功能的影响，上述原理详见图3。
图4为本发明中各原理示意图图例说明。

Claims (3)

1.用于快速检测线粒体内ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体以及MTS融合多肽，ATP-aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，其序列信息为：5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’，MTS融合多肽序列信息为：(a)YGRKKRRQRRR、(b)YARAAARQARA、(c)YGRKKRRQRRRMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN或(d)YARAAARQARAMLSALARPVGAALRRSFSTSAQNN；
步骤二：将QDs与ATP适配体互补链、MTS融合多肽进行偶联反应，得到线粒体定位的QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点(COOH-QDs)，浓度为1uM，ATP-aptamer适配体互补链为5’-NH2-(CH2)12修饰的DNA，其序列信息为：5’-NH2-(CH2)12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’(ProbeDNA，DNAp)；
步骤三：将步骤二得到的线粒体定位的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体反应，得到ATP-aptamer适配体与互补链相互作用后的荧光共振体系，
步骤四：通过将上述步骤三得到的荧光共振分子探针体系与目标细胞在37度进行孵育，半小时后，利用培养基清洗未进入细胞内的分子探针体系，并通过共聚焦显微镜检测荧光共振分子探针体系的细胞内定位以及细胞内线粒体ATP浓度的变化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二QDs与ATP适配体互补链和MTS融合多肽的偶联体按如下方法制备：将COOH-QDs加入到反应器中，300rpm，5min，震荡混匀；加入计算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS，活化30min；加入计算好用量的DNAp和MTS融合多肽，继续震荡混合均匀，300rpm，室温反应2h；若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃；反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心3min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物MTS-QDs-DNAp复溶于适当的目标偶联物缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三荧光共振体系如下方法制备：在MTS-QDs-DNAp溶液中加入适量ATP-aptamer适配体，37℃，杂交30min，构建fret体系，用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物MTS-QDs-DNAp-Cy3体系复溶于无血清培养液中，观察其荧光情况。
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