CN103940528B - 用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料与热敏性高分子进行偶联反应，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；将其与纳米Au偶联，得到荧光共振分子探针体系；将荧光共振分子探针体系与目标细胞孵育，并通过荧光光谱仪检测纳米温度计的细胞内温度.本发明利用稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的荧光被纳米Au淬灭的效率与能量共振转移距离（FRET）有关，而FRET距离受热敏性分子（温度）控制，从而实现对温度的检测，为细胞内温度检测监控提供了一种新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法。
背景技术
细胞内的温度测量对于生物学和医学研究具有重要的意义。首先，细胞内的基因表达及酶反应等生化过程都与温度息息相关，其次，一些研究表明诸如癌症等病理学细胞因其新陈代谢快，相对于正常的体细胞具有更高的温度，因而通过细胞内的温度测量可以作为一些疾病的诊断提供参考。另外，对于癌症的热疗法，如果能准确知道单细胞水平上的温度，可能更有利于我们深入理解热疗机理及准确的疗效评价；对于药物等外界刺激因素，通过研究细胞内温度与药物等刺激因素之间的关系，对建立单细胞水平上的生物热力学具有重要意义，进而有助于药物研发及疾病机理深入研究。然而，相对于人体内温度的测量，通常只有针尖大小（10～100微米）的细胞，其内部温度的测量是比较困难的。因而，迫切需要构建一个能测量细胞内温度的温度计。
对于微米尺度的细胞内温度的测量，人们尝试了不同的方法，其中包括利用纳米材料制备热电偶纳米温度计对细胞内温度的测量，然而这种侵入式的测量会破坏细胞结构，在操作上也存在一些不便。近几年来，人们利用纳米材料的荧光信号强度与温度间的相关性，发展了基于量子点、纳溶胶、纳米粒子及热敏型染料等材料的细胞温度计，其中以CdSe-CdS（供体）和花青染料（受体）组成共振能量传递(FRET)体系的纳米温度计备受关注，这种温度计利用对温度敏感的花青染料和CdSe-CdS材料，结合FRET技术的优点，实现对细胞内温度的灵敏检测，但这类荧光材料对于生物体系的毒副作用大及生物体系自身荧光对检测结果的影响较大。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，通过分子弹簧（热敏性分子）链接、构建纳米复合材料ZnO:RE（给体）和纳米Au（受体）FRET体系，设计依赖于温度调控分子弹簧的伸缩而实现对细胞内温度检测的纳米温度计，作简单，灵敏性高，检测速度快。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：
用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，三者的摩尔比为1：（1～1.2）：（1～1.2）；
所述稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的粒径为3～5nm，掺杂的稀土质量含量为2～5%，配制成浓度为0.2μM～1μM的乙醇溶液；
所述的纳米Au的粒径为3～5nm，配制成浓度为0.2μM～1μM的乙醇溶液；
所述的热敏性高分子是指氨基或巯基改性的聚乙二醇高分子，配制成浓度为10～100μM的乙醇溶液；
步骤二：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料与热敏性高分子进行偶联反应，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；
步骤三：将步骤二得到的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点与纳米Au偶联，得到纳米Au与稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点相互作用后的荧光共振分子探针体系，即纳米温度计。
作为优选，稀土掺杂ZnO纳米复合材料中的稀土是铒、镨、钕、铕、钆、镱中的一种或多种。
作为优选，热敏性高分子是H2NCH2(CH2CH2O)nCH2CH2CH2NH2，PEG1500N。
作为优选，步骤二稀土掺杂ZnO的纳米复合材料与热敏性高分子的偶联体按如下方法制备：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料加入到反应器中，震荡；加入EDC溶液和sulfo-NHS，用硼酸盐缓冲液调节pH并活化；加入热敏性高分子，继续震荡混合均匀；反应结束，将样品过滤；浓缩纯化。
作为优选，所述步骤三荧光共振体系按如下方法制备：在步骤二得到的溶液中加入纳米Au，室温反应，将样品浓缩纯化。
作为优选，步骤二得到的得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点的浓度为5uM。
上述用于检测细胞内温度的纳米温度计的使用方法，包括以下步骤：将纳米温度计与目标细胞在35～37℃孵育0.5～1.5h，清洗未进入细胞内的纳米温度计，通过荧光光谱仪检测纳米温度计的细胞内温度。
技术效果
本发明利用稀土掺杂ZnO复合材料的热敏性及近红外上转换发光，通过分子弹簧（热敏性分子）链接、构建纳米复合材料ZnO:RE（给体）和纳米Au（受体）FRET体系，设计依赖于温度调控分子弹簧的伸缩而实现对细胞内温度检测的纳米温度计。
本发明采用能量共振转移原理，用热敏性分子（分子弹簧）将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料和纳米Au连接起来，从而建立起FRET过程中良好的能量共振传输通道。本发明采用生物兼容性好的稀土掺杂ZnO纳米复合材料代替Cd类生物毒性较大的材料，具有生物兼容性好，细胞毒性低的特点。稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的荧光被纳米Au淬灭的效率与FRET距离有关，理论上微小的温度变化引起稀土掺杂ZnO的纳米复合材料和Au纳米材料间的FRET距离变化，进而导致FRET过程中荧光强度较大的变化。通过检测FRET过程中的荧光强度变化情况，可建立待测细胞温度与检测信号之间的关系，即热敏性分子明显的结构变化起到了对温度信号的指示作用。当加入具有抑制或增强细胞的药物时，细胞内的温度将发生变化，稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的荧光强度随之发生变化。可以通过荧光光谱仪监测细胞内内稀土掺杂ZnO的纳米复合材料探针体系荧光强度的变化情况，从而计算出细胞内内温度的变化，实现对药物的评价。本方法操作简单，灵敏度高，可对细胞内温度在不同情况下的温度进行检测。
附图说明
图1为稀土掺杂ZnO的纳米复合材料和热敏性高分子偶联反应原理示意图。
图2为当温度变化时本荧光共振体系的工作原理示意图。
图3为细胞温度计的荧光强度与温度的关系。
其中， 表示热敏性高分子（分子弹簧），表示稀土掺杂ZnO的纳米复合材料 （受体）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述：
实施例1
用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，三者的摩尔比为1：1：1；
所述的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的粒径为3nm，掺杂的稀土质量含量为2%，配制成浓度为0.2μM的乙醇溶液；稀土是铒；
所述的纳米Au的粒径为3nm，配制成浓度为0.2μM的乙醇溶液；
所述的热敏性高分子是H2NCH2(CH2CH2O)nCH2CH2CH2NH2，PEG1500N，配制成浓度为10μM的乙醇溶液；
步骤二：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料加入到反应器中，400rpm，震荡5min；加入浓度均为10mg/mL的EDC溶液和sulfo-NHS，用10mM硼酸盐缓冲液调节pH为7.4，活化30min；加入热敏性高分子，继续震荡混合均匀，400rpm，室温反应1h；若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃；反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心2min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；
步骤三：在步骤二得到的溶液中加入纳米Au，室温反应30min，构建FRET体系，用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到荧光共振分子探针体系；
步骤四：将荧光共振分子探针体系加入到已贴壁培养至的细胞中，与成纤维细胞在36℃孵育0.5h，PBS(PH7.4)冲洗3次，清洗未进入细胞内的纳米温度计，并通过荧光光谱仪检测纳米温度计的细胞内温度。
上述制备方法的原理见图1和图2。
标准图谱建立
根据现有技术利用CdSe-CdS和花青染料组成共振能量传递(FRET)体系的纳米温度计测定细胞内温度，然后用本发明的温度计测定荧光强度，测定三次，误差值在±0.5。根据测定的数据建立荧光强度和温度的关系曲线图,如图3所示，图3中横坐标为发射波长，纵坐标为发射光谱强度。
以1.45um处发光峰计，采用实施例1制备的纳米温度计，测定不同条件下的细胞内的荧光强度分别为0.035,0.049,0.098,0.236,0.379，对照图谱的温度为23℃,25℃,29℃,33℃,37℃。因此测定的细胞内温度分别为23℃,25℃,29℃。
实施例2
用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，三者的摩尔比为1：1.2：1.2；
所述的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的粒径为5nm，掺杂的稀土质量含量为5%，配制成浓度为1μM的乙醇溶液；稀土是铕；
所述的纳米Au的粒径为5nm，配制成浓度为1μM的乙醇溶液；
所述的热敏性高分子是氨基改性的聚乙二醇高分子，配制成浓度为50μM的乙醇溶液；
步骤二：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料加入到反应器中，400rpm，震荡5min；加入浓度均为10mg/mL的EDC溶液和sulfo-NHS，用10mM硼酸盐缓冲液调节pH为7.4，活化30min；加入热敏性高分子，继续震荡混合均匀，400rpm，室温反应1h；若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃；反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心2min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；
步骤三：在步骤二得到的溶液中加入纳米Au，室温反应30min，构建FRET体系，用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到荧光共振分子探针体系；
步骤四：将荧光共振分子探针体系加入到已贴壁培养至的细胞中，与肝细胞在37℃孵育0.5～1.5h，PBS(PH7.4)冲洗3次，清洗未进入细胞内的纳米温度计，并通过荧光光谱仪检测纳米温度计的细胞内温度。
实施例3
用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，三者的摩尔比为1：1.1：1.1；
所述的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的粒径为4nm，掺杂的稀土质量含量为3%，配制成浓度为0.5μM的乙醇溶液；稀土是镱；
所述的纳米Au的粒径为4nm，配制成浓度为0.8μM的乙醇溶液；
所述的热敏性高分子是巯基改性的聚乙二醇高分子，配制成浓度为100μM的乙醇溶液；
步骤二：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料加入到反应器中，400rpm，震荡5min；加入浓度均为10mg/mL的EDC溶液和sulfo-NHS，用10mM硼酸盐缓冲液调节pH为7.4，活化30min；加入热敏性高分子，继续震荡混合均匀，400rpm，室温反应1h；若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25℃；反应结束，用0.22μm针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心2min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；
步骤三：在步骤二得到的溶液中加入纳米Au，室温反应30min，构建FRET体系，用超滤管将样品浓缩纯化3次，每次浓缩比不小于10，得到荧光共振分子探针体系；
步骤四：将荧光共振分子探针体系加入到已贴壁培养至的小鼠肝细胞中，与小鼠肝细胞在35℃孵育0.5～1.5h，PBS(PH7.4)冲洗3次，清洗未进入细胞内的纳米温度计，并通过荧光光谱仪检测纳米温度计的细胞内温度。
Claims (5)
1.用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：称取稀土掺杂ZnO的纳米复合材料、纳米Au和热敏性高分子，三者的摩尔比为1：（1～1.2）：（1～1.2）；
所述稀土掺杂ZnO的纳米复合材料的粒径为3～5nm，掺杂的稀土质量含量为2～5%，配制成浓度为0.2μM～1μM的乙醇溶液；
所述的纳米Au的粒径为3～5nm，配制成浓度为0.2μM～1μM的乙醇溶液；
所述的热敏性高分子是指氨基或巯基改性的聚乙二醇高分子，配制成浓度为10～100μM的乙醇溶液；
步骤二：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料与热敏性高分子进行偶联反应，得到热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点；
步骤三：将步骤二得到的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点与纳米Au偶联，得到纳米Au与稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点相互作用后的荧光共振分子探针体系，即纳米温度计。
2.根据权利要求1所述的用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，其特征在于：稀土掺杂ZnO纳米复合材料中的稀土是铒、镨、钕、铕、钆、镱中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，其特征在于：步骤二中的稀土掺杂ZnO的纳米复合材料与热敏性高分子的偶联体按如下方法制备：将稀土掺杂ZnO的纳米复合材料加入到反应器中，震荡；加入EDC溶液和sulfo-NHS，用硼酸盐缓冲液调节pH值并活化；加入热敏性高分子，继续震荡混合均匀；反应结束，将样品过滤；浓缩纯化。
4.根据权利要求1所述的用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，其特征在于：步骤三中的荧光共振分子探针体系按如下方法制备：在步骤二得到的溶液中加入纳米Au，室温反应，将样品浓缩纯化。
5.根据权利要求1所述的用于检测细胞内温度的纳米温度计的制备方法，其特征在于：步骤二得到的热敏性高分子表面修饰水溶性稀土掺杂ZnO的纳米复合材料量子点的浓度为5uM。
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