CN1613011A - 信号系统及其使用的元件 - Google Patents

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Abstract

一种测定胞内ATP和/或基因表达的方法，该方法包括用带有编码荧光素酶和虫荧光素再生蛋白质的构建体转化细胞，导入虫荧光素到所述细胞中，并监控所述细胞的生物发光信号。本发明还描述了新的虫荧光素再生蛋白质以及这些蛋白质在旋光活性酶底物制备中的应用。

Description

信号系统及其使用的元件
本发明涉及生物发光信号系统，尤其是包括荧光素酶和虫萤光素的生物发光信号系统的应用，用于该方法的特定的新基因和蛋白质，以及涉及用于该系统的元件的生产。
生物发光信号系统是众所周知的且在生物技术中具有广泛的应用，尤其是在微生物的检测领域，或在细胞活性的研究中作为生理报道分子。
普通的生物发光信号系统利用在自然界的生物例如萤火虫和发光蠕虫中发现的荧光素酶，以及酶底物，虫萤光素的组合。在可在所有细胞中发现的三磷酸腺苷(ATP)的存在下，荧光素酶氧化虫萤光素来生成氧合虫荧光素与半胱氨酸以及生物发光信号，后者可通过例如利用光度计来监控。
信号反应可被表示如下：
Figure A0282250300051
其中虚线箭头表示一种生物发光信号。
然而氧合虫荧光素是该反应的抑制剂，其意味着此体系中产生的任何信号均是很短暂的。因此，人们有必要提供一种显著过量的D-虫萤光素到任意的反应体系来确保产生充分和可测量的信号。
用于检测微生物等的试验的实例，其利用一种如包括在WO 94/17202和WO 96/02665实施例中所描述的体系。
胞内ATP的浓度依赖细胞的健康状态或发育阶段可以变化10倍或更多倍。这对于测量作为例如药物，毒素，激素，环境因素或疾病对于细胞影响的研究手段的胞内ATP水平的波动有着非常大的价值。
在现有技术中，各种各样的方法被用于分析活体内ATP的浓度。例如，在Dementieva等(1996)Biochemistry(莫斯科)Vol 61，No.7中所描述的，大肠杆菌中胞内ATP浓度是通过利用一种重组荧光素酶计算ATP的总量，并除以估计的总细胞容积来进行测定的。
这样的一种间接方法仅仅至多得到一个实际ATP浓度的估计值。
荧光素酶往往被用作基因表达(体内)的标记，其在细胞中的产生与特定的遗传调控元件相关联。虫萤光素被外源地加入，胞内的ATP浓度，在几乎所有的环境中，使得该酶被饱和。因而基因表达的开启通过与所产生的活性荧光素酶的量相对应的以定量方式发射的光来显示。
通常荧光素酶的浓度被测定；浓度然后与不同的结果例如启动子的效率相关联。众所周知，人们利用ATP米-曼氏常数Km降低(Michaelis-Menten constant Km)的荧光素酶(参见例如WO 96/22376)确保周围环境[ATP]的变化不影响该试验。
一种突变荧光素酶被描述在WO 98/46729中，其因为具有比正常荧光素酶更高的米-曼氏常数Km而对体内进行的细胞ATP试验特别有用。通过利用与现有技术中已知的荧光素酶相比较具有增加的Km的荧光素酶，来测定稳定状态的ATP浓度的可能性是很大的。因为，一般而言，酶速率(V，通过发光强度测定的)以及底物浓度(ATP的，其中虫萤光素是过量的)之间的关系如下：
V＝Vm.[ATP]/Km+[ATP]
因此可以看到只有当Km大于(或同一数量级)周围环境[ATP]时，在[ATP]变化和发光强度变化之间有一个比例程度。其中Km比周围的[ATP]少得多，任何[ATP]的变化不会真正影响测定的发光强度。无疑地，发光检测越敏感，可检测的“V”的变化可以越小，并且相对于被估价的[ATP]范围的Km越小。
对于特定的应用，例如，体内检测，具有在400μm到1.4mM之间的数量级例如500μm，600μm，1mM等的Km的荧光素酶可能是有利的。然而，从上述的讨论可以理解，主要标准是Km不比被评价的所期望的[ATP]范围小太多。
特定的对于血细胞的生理学试验重要的所期望的[ATP]范围在300μm和1mM之间，或更特别地为380μm和620μm之间，(cf.SigmaDiagnostic Kit，Catalog No.366上面所讨论的)。对于其它的哺乳动物细胞例如肝细胞而言，[ATP]范围为2.5mM-6mM(参见Dementieva等(1996)上讨论的)。重组荧光素酶诸如WO 96/22376中所描述的重组荧光素酶的应用尤其适用于在这些范围中的连续试验。
在所有这类试验中，然而，其又被用作细胞健康状态的生理报道分子，例如在药物等的筛选过程中，细胞被适当地转化使得其表达荧光素酶。然而，如上所述，虫萤光素必须被外源施加。不幸运地是，虫萤光素仅仅在pH＜5时是细胞-可透过的，而所述的pH通常被认为不是一种生理学可接受的pH。因而将这些反应物添加到传统的细胞试验中不是容易的。为了监控在较长周期中细胞ATP的水平，维持整个周期的低pH是必要的，其本身对细胞有不利的影响。这些限制了此类试验在尤其要求高强度操作的高通量筛选的应用。
此外，尽管萤光素酶可通过重组DNA技术来制备，D-虫萤光素通常被合成生成，作为所期望的D-异构体和不需要的L-异构体的混合物，其在应用之前必须被分离。这是一个不经济的方法。
US专利No.5,814,504描述了一种40kD的分离自萤火虫的蛋白质，当其与氧合虫荧光素和D-半胱氨酸结合时产生萤火虫D-虫萤光素。此蛋白质据说在改进来自萤光素酶/虫萤光素反应体系的荧光信号的持久性以及降低用于该反应的萤光素酶和虫萤光素的量方面是有用的。利用此蛋白质产生萤火虫虫萤光素的方法也已被描述。螟萤火虫(Photinus pyralis)的此蛋白质的氨基酸序列以及相应的mRNA可在NCBI数据库中获得，登录号分别为BAB60700和AB062786。
其它来自十字萤火虫(Luciola cruciata)和横纹萤火虫(Luciolalateralis)的萤光素酶再生酶也已经被公开(分别参见BAB85479和BAB85478)。
申请人已经改进了此类蛋白质及其编码核酸的进一步的应用，并已经进一步的发现可获自发光蠕虫具有相关活性的新的蛋白实例。
本发明提供了一种用于测定胞内ATP和/或基因表达的方法，该方法包括用编码萤光素酶和虫萤光素再生蛋白的构建体转化细胞，导入虫萤光素到所述细胞中，并监控所述细胞的生物发光信号。
术语“虫萤光素再生蛋白”或LRE是指转化氧合虫荧光素和半胱氨酸为虫萤光素的蛋白。此类蛋白的实例描述在USP 5,814,504中，但申请人已经克隆并测序另外的实例且这些构成了本发明的另一个方面，在下面将被进一步的说明。
本发明的方法可用于监控胞内的ATP水平。可选择地或进一步地可被用于监控萤光素酶基因或虫萤光素再生基因的表达，因为所产生的信号与其中任何一个的表达水平相关，尽管其与萤光素酶的表达更直接地相关。
本发明的方法在允许用稳定的光输出来报道体内基因的表达方面具有明显的优点。单一虫萤光素可在细胞试验的开始导入到细胞中，期间短暂的暴露于pH5。其后该细胞在试验期间被恢复到生理pH中。尽管该虫萤光素被快速地应用在该体系中，产生的氧合虫荧光素将在细胞内表达的虫萤光素再生蛋白和存在于细胞内的半胱氨酸，尤其是D-半胱氨酸的作用下被转变回D-虫萤光素。
结果，可获得相对稳定的光输出，其提供了易于读取的信号。此对于这种类型的体系是特别有好处的。
萤光素酶和虫萤光素再生蛋白可在细胞中被表达为两个分离的蛋白。在这种情况下，用于转化细胞的构建体可是一个二部分组成的构建体，一个部分含有编码萤光素酶的基因，且第二部分含有编码虫萤光素再生蛋白的基因。优选的，萤光素酶和虫萤光素再生蛋白被表达为融合蛋白。通过遗传连接萤光素酶活性和再生活性，反应的动力学(体内或体外)变得更加有利。此融合蛋白构成了本发明的另一个方面。
如有必要，可增加D-半胱氨酸的细胞内含量，例如通过进一步转化该细胞使得其表达L-半胱氨酸消旋酶。
在一个优选方案中，细胞被转化使得其表达两个萤光素酶，一个带有相对高的Km值且一个带有相对低的Km值。这些酶适当地具有可辨别的不同波长的输出。在此系统中，试验的有效测定范围可被延伸。可选择地或进一步地，允许进行定量试验，其中高Km萤光素酶的活性被与低Km萤光素酶的活性相比较。这样，细胞生理可被连续地监控，例如使得细胞毒素或被筛选样品的其它副作用，能够被快速的检测。
带有相对低的Km值的萤光素酶突变体的实例描述在WO 9622376中，且这些可用于本发明的上下文。
用于本发明方法中的转化细胞的新构建体构成了本发明的另一个方面。因而，本发明进一步的提供了一种DNA构建体其含有(i)一个编码萤光素酶的核酸序列，和(ii)一个编码虫萤光素再生蛋白的核酸序列。这些元件优选的在合适的启动子的调控下。其中该元件被表达为两个蛋白质，编码萤光素酶的核酸序列在第一启动子的调控下，且编码虫萤光素再生蛋白的核酸序列在第二启动子的调控下。
然而，优选的，这些元件的核酸序列被连接来表达萤光素酶和虫萤光素再生酶的融合蛋白。在这种情况下，该核酸序列在一个单一启动子的调控下。
如上所述，构建体可适当地含有一个或多个其它的选自(iii)编码其它萤光素酶的核酸序列；和(iv)编码L一半胱氨酸消旋酶的核酸序列的元件。元件(iii)和(iv)合适地分别在第三和第四启动子的调控下。
构建体合适地为一或多个可用于细胞转化的载体的形式。其中构建体的元件存在于超过一个的载体上，这些载体可被用于共转化靶细胞。
此方法中转化的细胞可以是真核的或原核的。为进行细胞试验，可以理解真核细胞，例如哺乳动物或植物细胞将是所需要的。选择在靶细胞中有功能的载体和启动子，如现有技术中所常用的。
用于本发明构建体的核酸编码具有特定活性的蛋白。优选的至少用于这些核酸中的一些密码子对于靶细胞种类而言是“最佳的”，如现有技术常用的。例如，特定的细胞类型更有效地表达带有特定GC含量百分比的核酸并且由于遗传密码的简并性，可以选择密码子使得核酸具有类似的GC含量％。
上述的元件(i)和/或(iii)的核酸序列的实例是本领域公知的。它们合适地编码具有所期望的特性例如热稳定性，Km值以及比色特性的荧光素酶。通过本发明构建体的核酸合适地编码的突变型荧光素酶的实例被描述在EP-A-0528448，WO 95/25798，WO 96/22376，WO 98/46729，WO 00/24878，WO 01/31028，WO 9914336和WO 01/20002中。
合适的L-半胱氨酸消旋酶(上述的元件(iv))的实例是现有技术已知的。例如，氨基酸消旋酶，带有低的底物特异性，来自恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)(在EcoCyc数据库中命名为EC 5.1.1.10)已知催化L-氨基酸到D-氨基酸的转化。
可用于本发明构建体的元件(ii)中的核酸的一个实例编码如图解于下面附图2中的SEQ ID NO 1的蛋白，或一个虫萤光素再生片段或其变体。这些蛋白可获自螟萤火虫(Photinus pyralis)。其它已知的虫萤光素再生酶的实例为可获自Luciola种的例如十字萤火虫(Luciola cruciata)和横纹萤火虫(Luciola lateralis)的蛋白。此序列的特定实例在下文被提供为SEQ ID NO 62和63。因此包含在本发明构建体中的核酸可编码蛋白质SEQ ID NOS 62或63，或其虫萤光素再生片段，或这些的任意的变体。
此处所用的术语“片段”是指基本序列的具有所需酶活性的一或多个部分。这些可以是缺失突变体。一般而言，该部分包含基本序列的至少12个和优选至少20个氨基酸。
术语“变体”包括等位基因的变体和由于多基因拷贝存在于不同位点发现的变体。此外，术语“变体”包括氨基酸的序列或编码氨基酸的核酸序列，其因为序列中的一或多个氨基酸被其它的氨基酸取代而不同于所起源的基本氨基酸序列。当一个氨基酸被用一个不同的带有非常类似的特性的氨基酸取代时，氨基酸取代可被认为是“保守的”。非保守的取代是其中的氨基酸被用一不同类型的氨基酸取代。一般说来，不改变多肽的生物活性的非保守取代几乎没有。合适的变体应与基本的序列至少有60％的同源性，优选的至少75％的同源性，以及更优选的至少90％的同源性。在此情况下的同源性可被判定例如利用Lipman-Pearson算法，设置Ktuple：2，缺口罚分：4，缺口长度罚分：12，标准PAM计分矩阵(Lipman，D.J.和皮尔森，W.R，Rapid和Sensitive Similarity Searches，Science，1985，vol.227，1435-1441)。
特定的编码SEQ ID NO 1的核酸实例为在附图2中显示为SEQ ID NO2的mRNA序列。合适的编码蛋白SEQ ID NO 1的基因组序列的实例，为下文附图4中图解的SEQ ID NO 11。
在一个可选择的实施方案中，本发明的构建体包括元件(ii)其是一个获自发光蠕虫例如夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)的编码虫萤光素再生蛋白，或其虫萤光素再生片段，或其任意的变体的核酸。
特定的，核酸编码一个含有如附图10所示的SEQ ID NO 3的虫萤光素再生蛋白，或一个含有如附图12所示的SEQ ID NO 39的虫萤光素再生蛋白，
或一个含有如附图16所示的SEQ ID NO 59的虫萤光素再生蛋白或一个虫萤光素再生片段或任意这些的变体。
含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 59的虫萤光素再生蛋白是新的，其与虫萤光素再生片段，以及具有至少60％，更优选的至少80％，进一步更优选的至少90％以及最优选的至少95％同源性或同一性的变体一起构成了本发明的另一个方面。
本发明的一个特定的实施方案包括一个含有附图10中图解的SEQID NO 3的虫萤光素再生蛋白。
本发明的一个可选择的实施方案包括一个含有附图12中图解的SEQ ID NO 39的虫萤光素再生蛋白。
本发明的一个优选实施方案包括一个含有附图16中的SEQ ID NO59的虫萤光素再生蛋白。
此蛋白且特别是蛋白SEQ ID NO 59，可获自夜光萤火虫(Lampyrisnoctiluca)且因此等位基因变体也可从此种中获得。该序列被克隆且部分序列被测定，如实施例1所述。然而克隆方法不是简单的，在某种程度上取决于好象存在于虫萤光素再生蛋白质的自然基因中的大内含子的存在。
本发明进一步的，提供了一个核酸其编码含有SEQ ID NO 3的虫萤光素再生蛋白，含有SEQ ID NO 39的虫萤光素再生蛋白，或含有SEQID NO 59的虫萤光素再生蛋白，或其虫萤光素再生片段，或任意这些的具有至少60％序列同源性或同一性的变体。特定的，本发明的核酸编码含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 59的虫萤光素再生蛋白。
此种序列的一个实例，其编码蛋白SEQ ID NO 3，是附图10所示的基因组序列(包括内含子)SEQ ID NO 4。编码蛋白SEQ ID NO 39的核酸序列的实例是如附图12所示的SEQ ID NO 40。一个合适的cDNA序列含有SEQ ID NO 4而没有内含子(SEQ ID NO 41)或含有如附图12所示的SEQ ID NO 38。特定的，核酸是显示在附图16中的SEQ ID NO58。
蛋白质除可获自特定的种之外，可通过结合来自不同种的酶的片段来产生嵌合的虫萤光素再生酶。在这里，片段合适地含有由在基因组序列中发现的单独外显子所编码的区域。人们已经发现例如，通常编码这些蛋白质的基因序列含有5个外显子，通过4个不同大小的内含子连接在一起，如附图5，6，7，10，12和14中所描述的。嵌合的虫萤光素再生蛋白合适地含有一个对应于序列表中外显子I，II，III，IV和V的5个单独外显子的组合。
合适地，嵌合酶含有至少一个且优选的直到4个来自萤火虫种例如夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)的外显子所编码的片段。例如，申请人已经通过将螟萤火虫(Photinus pyralis)外显子1的序列，与夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)虫萤光素再生酶相当于该基因内的外显子2，3，4和5的片段拼接在一起制备出一种虫萤光素再生酶。
此酶的一个实例在下文被图解为SEQ ID NO 61。这些序列和虫萤光素再生片段以及这些任何一个的变体，与编码这些蛋白质例如SEQ IDNO 60的核酸序列一起，构成了本发明的另一个方面。
本发明的新的蛋白质可用于合成的D-虫萤光素以及其它旋光的酶底物的生产。例如它们可用于磷酸酶或半乳糖苷酶的有旋光活性的底物的再生。
因此在更进一步的一个方面，本发明提供了一种用于产生旋光活性酶底物例如D-虫萤光素的方法，其包括用一种含有SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 39或其虫萤光素再生片段，或任意的这些具有至少60％同源性或同一性的再生蛋白，以及任意的影响该转化所必须的其它氨基酸例如半胱氨酸来接触所述底物的氧化形式，例如氧合虫荧光素。
该反应在合适的溶剂，例如水溶剂中，在再生酶有活性的温度下合适地作用，所述的温度将依赖所涉及的特定的酶而变化。例如，反应可在生理相容性缓冲液例如，25mM-50mM磷酸盐或HEPES pH6.5-7.5的存在下以及20-30℃的反应温度下进行。
本发明现在通过参考附图的实例的方式特定地描述，其中：
附图1显示了试验设计以及在夜光萤火虫(L.noctiluca)中发现的编码虫萤光素-再生蛋白(酶)(LRE)的基因的鉴定的结果；附图2显示了螟萤火虫(Photinus pyralis)LRE mRNA的序列以及对应的蛋白序列，获自NCBA数据库(分别为SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 1)；
附图3显示了一系列用来扩增P.pyralis LRE全基因的引物；
附图4显示了来自P.pyralis的LRE基因的全序列(SEQ ID NO 11)与mRNA序列(SEQ ID NO 2)比对；其中外显子被显示为阴影；
附图5图示了基于保守的氨基酸序列及其相对于氨基酸序列(SEQID NO 1)的位置设计的用于扩增L.noctiluca同系物或P.pyralis LRE小区域的通用引物，；
附图6显示了一个来自夜光萤火虫(L.noctiluca)350个碱基对的PCR产物，与P.pyralis mRNA和DNA序列的比对；
附图7显示了用于5′和3′基因组步移实验的引物；
附图8图示了根据基因组步移实验构建毗连序列的图；
附图9显示了来自L noctiluca的5′UTR基因组步移序列，图解了基因的3种形式的存在；
附图10显示了蛋白序列(SEQ ID NO 3)以及含有夜光萤火虫(L.noctiluca)的LRE的编码核酸序列(SEQ ID NO 4)；
附图11显示了来自4个不同个体的SEQ ID NO 4以及一些等位基因或其它的变体；
附图12显示了一个完全蛋白序列(SEQ ID NO 39)，编码基因核酸序列(SEQ ID NO 40)以及推定的含有夜光萤火虫(L.noctiluca)的LRE的mRNA序列(SEQ ID NO 38)；
附图13显示了来自L.noctiluca的全长虫萤光素再生酶基因序列的推定的氨基酸序列与来自螟萤火虫(Photinus pyralis)的LRE蛋白序列(登录号BAB60700)的比对，其显示了55.7％的氨基酸同源性；
附图14类似于附图12但显示了基因组序列中内含子区域的正确位置(SEQ ID NO 40)；
附图15是一个显示利用外显子-连接介导的PCR进行的虫萤光素再生酶(LRE)cDNA构建的图解；
附图16显示了夜光萤火虫(L.noctiluca)LRE1(SEQ ID NO 46)的DNA序列(SEQ ID NO 45)以及推定的氨基酸序列；
附图17显示了夜光萤火虫(L.noctiluca)LRE1(SEQ ID NO 48)的DNA序列(SEQ ID NO 47)以及推定的氨基酸序列；
附图18显示了来自LnocLRE1(1noc LRE)(SEQ ID NO 59)以及ChimLREI(chim LRE)(SEQ ID NO 61)的氨基酸序列与3个公开的LRE‘s十字萤火虫(Luciola cruciata)-Lcru LRE(BAB85479)(SEQ IL NO62)以及Photinus pyralis-Ppyr LRE(BAB60700)(SEQ ID NO 1)的比对；以及
附图19图解了pET-28a-c(+)克隆载体(Novagen)其中A.是pET-28(+)的质粒图谱，以及B显示了pET-28a-c(+)克隆/表达区域的序列，插入位点用*标记。
实施例1
来自夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)的LRE基因的克隆和测序
夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)，欧洲萤火虫自2000-2002采于南英格兰。通过高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche)提取雌性样品的总的基因组DNA。通过类似的方式从冻干的螟萤火虫(Photinuspyralis)样品(Sigma)抽提基因组DNA。
公开的螟萤火虫(P.pyralis)LRE mRNA序列(SEQ ID NO 2)，获自GENBANK，被用于设计一套通用有引物来试图从L.noctiluca的提取物中扩增一个同源的基因序列。然而，这些尝试，是不成功的。尽管利用常规的聚合酶链式反应(PCR)扩增产生许多的产物，所有这些看上去是非特异性的扩增子。
为了克服这些困难，申请人设计了一组的5个引物(SEQ ID NOS5-9)来扩增全部的P.pyralis LRE基因，如附图3中所图解的。这些引物在SEQ ID NO 2上的位置也被显示在此图中。
利用这些引物扩增的结果，产生了其他的序列信息。通过初始序列与这些序列的结合，产生了P.pyralis LRE基因的全序列图谱(SEQID NO 11)且被显示于附图4中。在这些附图中，完全的基因序列被与mRNA序列(SEQ ID NO 2)比对。外显子被描述且显示为阴影。
基于保守的氨基酸序列设计通用引物来扩增P.pyralis LRE的夜光萤火虫(L.noctiluca)同系物的一个小的区域。这些包括6个正向引物(SEQ ID NOS 12-18)和5个反向引物(SEQ ID NOS 19-23)。该引物的序列以及它们的相对于氨基酸序列的位置(SEQ ID NO 1)被图解于附图5中。
利用LRE通用引物FOR5(SEQ ID NO 17)和LRE通用的REV 3(SEQ IDNO 22)，从夜光萤火虫(L.noctiluca)扩增得到一个350个碱基对的PCR产物。这些被测序(SEQ ID NO 24)且如附图6所显示的与P.pyralis LRE mRNA和基因组序列(分别为SEQ ID NOs 25和26)有同源性。这些确证了在夜光萤火虫(L.noctiluca)中的确有一个LRE同系物。
基于此信息，设计4个引物(SEQ ID NOs 27-30)来进行5和3′基因组沿着L.noctiluca LRE基因的步移。这些引物的序列以及在SEQID NOs 24-26上的位置被图解于附图7中。
作为利用这些引物5′和3′基因组进行步移的结果，从5′和3′末端获得6个克隆且正向和反向测序。产生的图谱包括原始350bp序列下游的全序列。5′末端的序列与P.pyralis外显子/内含子的任何区域没有同源性。所有步移序列的重叠群，图解在附图8中，在比对中产生超过两个等位基因，此表明该基因在L.noctiluca中可能有超过一个的位点。
这些被进一步的图解在附图9中，其显示了来自L.noctiluca的5′UTR基因组步移序列。该基因的3个不同的等位基因形式(SEQ IDNOS 10，64和65)在一个个体中，表明了该基因存在两个或更多个拷贝。在这些附图中外显子II从图解的序列中的精氨酸和位点855处开始。
3′UTR基因组步移序列(不显示)表明在一个个体中有两个基因的不同形式。
从此操作中获得的夜光萤火虫(L.noctiluca)LRE蛋白的大部分序列和编码序列分别在附图10中被图解为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO4。
来自4个不同个体的一些等位基因变体在附图11显示为SEQ IDNOS 31-37。
人们令人惊讶地发现夜光萤火虫(L.noctiluca)的内含子I显著地小于来自P.pyralis.的内含子。在夜光萤火虫(L.noctiluca)中获得了除内含子I和外显子I以外的完全序列。来自夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)的虫萤光素再生蛋白的完全基因序列，推定的mRNA和蛋白序列在附图12中分别显示为SEQ ID NOS 40，41和39。
实施例2
虫萤光素再生蛋白质的制备
基于来自Lampyrís noctiluca的LRE基因序列(附图14)设计5套引物，NOC LRE EX1-5来分别扩增各个外显子(附图15，表1)。
表1寡聚核苷酸和序列的列表。下划线的碱基表示限制性内切酶位点。
寡聚核苷酸   序列5′-3′ SEQ ID NO
 NOC LRE EX1正向 ATGCAGTTTGGAGAAGGACCTCATTGGG  42
 NOC LRE EX1反向 CTACTTTTATATGGGTATGTCTTTTAAG  43
 NOC LRE EX2正向 ATAAAATACCGTCTTTGATTATT  44
 NOC LRE EX2反向 CTGCCCACAGATTACCAAGATGATCTG  45
 NOC LRE EX3正向 GCACCATGGACGTAAATG  46
 NOC LRE EX3反向 TGATCAATCTGTTGGAAGCATCA  47
 NOC LRE EX4正向 GTAATCGTCAAACATTGTTTAGTC  48
 NOC LRE EX4反向 CAGCGAATCTGGAAKGTTTACAG  49
 NOC LRE EX5正向 ATAACCTCGGTTGCTTTTGGTGACC  50
 NOC LRE EX反向(1097) ATTATRTATTTTWATCCTATTTGCAG  51
 PYR LRE EX1正向 ATGGGGCCAGTTGTTGAAAAAATTGCAG  52
 PYR LRE EX1反向 TCATAGCTTCACTTTAACTCCCGC  53
 NOC LRE Nco ISTART GAGCTC CCATGGGCCAGTTTGGAGAAGGACCTCATTGGG  54
 NOC LRE Xho I END1 GAG CTCTCGAGATTATRTATTTTWATCCTATTTGCAG  55
 NOC LRE Xho I END2 GAGCT CTCGAGTTAATTATRTATTTTWATCCTATTTGCAG  56
 PYR LRE Nco I STAR TGAGCT CCCATGGGGCCAGTTGTTGAAAAAATTGC  57
利用纠错PFU聚合酶(Promega)进行PCR来最小化单个脱氧腺苷残基被加到扩增片段的3′末端的可能性。
通过2％琼脂糖凝胶分离PCR产物，从凝胶上切除并利用琼脂糖净化提纯柱(AB Gene)提取。在第一个连接循环，2个外显子对被连接在一起。连接反应在16℃下进行并过夜。0.2μl的结合反应液用于第二轮PCR。对每一外显子连接对而言，一个正向和一个反向引物被用于扩增邻接的产物(附图15)。
电泳，凝胶切除以及净化提纯如上所述来进行。在连接的第二轮，两对的外显子PCR产物被连接在一起。PCR扩增产生的邻接产物随后被用在最后的与其余外显子的连接中。
最后的含有所有5个序贯连接的外显子的PCR产物用pGEM-TEasy Vector System(Promega)来克隆并利用染料终止试剂盒(Beckman)测序来证实连续的开放阅读框架且因此产生一个完全的转录本-LnocLRE1(附图16)。由于P.pyralis和夜光萤火虫(L.noctiluca)的LRE的外显子1有明显的差异，人们利用P.pyralis特异性引物(表1)，从P.pyralis扩增外显子1，然后将其与夜光萤火虫(L.noctiluca)的外显子2-5拼接来产生一种嵌合的LRE-ChimLRE1(附图17)。
序列鉴定
从外显子连接介导的PCR产生的两个转录本，LnocLRE1和ChimLRE1分别为864bp和903bp。两个序列(分别为SEQ NOS 58和60)，与推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS 59和61)一起显示在附图16和17中。这些氨基酸序列被显示与以前报道的其它LRE比对(附图18)且氨基酸的百分同一性被显示在表2中。
表2 LnocLRE1和ChimLREI与3个公开的LRE，十字萤火虫(Luciola cruciata)-Lcru LRE(BAB85479)，Luciola laterlais-Llat LRE(BAB85478)和螟萤火虫(Photinus pyralis)-Ppyr LRE(BAB60700)之间的百分氨基酸同一性。
            ChimLREI    Lcru LRE    Llat LRE    Ppyr LRE
LnocLRE1    90.6        51.5        50.6        54.1
ChimLREI                53.2        51.6        63.1
Lcru LRE                            57.2        56.2
Llat LRE                                        50.8
转化到稳定的大肠杆菌(E.coli)的表达菌株中
通过用含有限制性内切酶位点的引物进行PCR扩增将两个LRE序列转入合适的表达载体中，且在所选载体中能有正确取向和表达。设计的引物带有一个Nco I和一个Xho I位点(表1)。PCR产物的限制性酶消化会导致粘性末端的产生，5′末端的Nco I位点和3′末端的Xho I位点。
可用于LRE序列表达的特定载体为pET-28a(附图19)和16b克隆载体(Novagen)。前者将产生带有一个C-末端His标记的蛋白。后者被用于产生天然蛋白(参见上述的克隆策略)。
克隆于pET质粒中的目的基因在一个强T7启动子的调控之下且需要在包含T7核糖核酸聚合酶基因的宿主中表达。这些通过BL21(DE3)宿主菌株的DE3溶素原来提供。然而，象pET重组体在表达菌株(DE3)中是不稳定的，质粒被保存在一个稳定的E.coli菌株(XL1-Blue)中。重组质粒因此可在诱导之前被转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中。表达菌株pLysS被提供用于高度-严紧性的表达。
2μl的每一种连接反应液被加到100μl的感受态细胞(XL1-Blue)中并在42℃进行45秒的热休克。
冰浴2分钟后，加入0.9ml的SOC，然后将样品37℃振荡温育1hr。在含有50μg/ml氨苄青霉素(用于pET)和34μg/ml氯霉素(用于pLysS)的LB平皿上选择重组体。
25ng的重组体可在转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS之前被测序。
过量-表达
每一构建体的过夜培养物(3ml)(在含有氨苄青霉素，50μg/ml，和氯霉素，34μg/ml的LB中)，被用于接种1L的培养基。在诱导之前培养物被分开来提供一个对照(未诱导的样品)和一个试验(诱导的样品)。所有的试验样品在0.45-0.6的光密度(A600)之间用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3-5小时。
为验证蛋白表达，1ml的未诱导的和诱导的两个培养物样品被沉淀。
对于每一沉淀，加入100-200μl的1X SDS溶解缓冲液(SB)且样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分析(SDS-PAGE，Laemmli，U.K.(1970))之前煮沸5分钟。在噬菌体T4头部的装配过程中裂解结构蛋白，Nature 227(259)：680-85。
在变性和SDS-PAGE之前，任何蛋白制品的液态部分被加入等体积的2X SB。
溶解缓冲液：
               1X          2X
10％SDS        100         200
1M Tris        50          100
2-巯基乙醇     50          100
PMSF           20          40
EDTA           10          20
甘油           100         200
DH20          670         340
               1000μl     1000μl
加入大约50μl 10mg/ml溴酚蓝。
用10％分离胶和4％浓缩胶制备SDS-PAGE凝胶。凝胶在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液[0.025M Tris，0.192M甘氨酸，0.1％SDS(ICN)]中，25-30mA下电泳大约1小时。通过在考马斯蓝中振荡温育(1hr)，然后脱色直到蛋白带通过脱色清晰可见而观察蛋白(参见下文)。
10％分离胶(制备4-5块)：
dH2O                                   16.2ml
1.5M Tris；0.384％SDS(Protogel          10ml
缓冲液获自National Diagnostics)
10％SDS                                 450μl
超高纯的Protogel(30％w/v丙烯酰胺        13.3ml
获自National Diagnostics)
10％APS(每次制备新鲜的)                 400μl
四甲基乙二胺(Temed)                     40μl
4％浓缩胶(制备4-5块)：
dH2O                                   12.2ml
0.5M Tris；0.4％ SDS(Protogel           5ml
缓冲液获自National Diagnostics)
10％SDS                                 200μl
超高纯的Protogel(30％w/v丙烯酰胺        2.7ml
获自National Diagnostics)
10％APS(每次配制新鲜的)                 200μl
Temed                                   40μl
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝R-250                         1g
甲醇                                    450ml
水                                      450ml
乙酸                                    100ml
脱色剂
异丙醇                                  125ml
乙酸                                    50ml
甘油                                    15ml
水                                      310ml
蛋白质纯化
收集诱导的培养物(500ml)并重新悬浮在20ml的缓冲液中。通过超声处理(25秒开启，20秒关闭，10个循环)制备可溶解的粗提物(澄清的样品)并在离心14000rpm，20分钟)后收集上清液。通过TALON亲合树脂(BD biosciences)依照生产商的说明书纯化His-标记的蛋白质。TELON树脂利用固定化的钴2+并且增强了对多聚组氨酸-标记的蛋白质的选择性。
纯化的蛋白可通过SDS-PAGE来显像并且依照Bradford试验来定量测定(Bradford，M.M.(1976)一种利用蛋白-染料结合的原理用于蛋白微克定量分析的快速和灵敏的方法，Anal.Biochem.72：248 54)。
实施例3
用虫萤光素再生酶进行的体内试验
利用常规方法转化所有的细胞，使得它们表达LRE和荧光虫荧光素酶活性。这些细胞被培养在含有0.6mM D-虫萤光素的低pH(最大pH5.0)的缓冲液中0.5到10分钟(取决于细胞的类型)。
然后从低pH缓冲液中分离细胞，洗涤，并重新悬浮在中性缓冲液中。可选择的，低pH缓冲液被合适的碱中和。该细胞发出的生物荧光可以因此被检测并通过光度计或其它的光-探测仪进行测定。此提供一种用于测定胞内ATP的体内试验方法。
实施例4
用虫萤光素再生酶进行的体外试验
将一种含有ATP的待测定的样品加到一种含有25mM Tricine-NaOHpH7.8，4.0mM MgSO4，0.1-10μg荧光虫荧光素酶和0.1-20μg本发明的纯化重组LRE，或0.1-40μg本发明的纯化的重组萤光素酶-LRE融合蛋白，0.5-5mM D-半胱氨酸和250μM D-虫萤光素的反应混合物中。利用光度计或其它的光检测仪器检测和测定该反应的光输出，从而测定样品的ATP含量。
所有上述说明书中提及的参考文献都在此处引作参考。不违背本发明的精神和范围的其它修改对本领域技术人员是显而易见的。虽然本发明已经连同具体的优选实施方案进行了描述，但是应该理解本发明不应该受限于此具体的实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的执行本发明的描述的方式的多种修改应该在本发明权利要求的范围之内。
                             序列表
<110>The Secretary of State for Defence
     Day，John C
     Squirrell，David J
     Bailey，Mark J
     White，Peter J
<120>信号系统及其所使用的元件
<130>CG/P/149/WOD
<140>PCT/GB2002/005120
<141>2002-11-13
<150>GB 0127292.1
<151>2001-11-14
<150>GB 0205201.7
<151>2002-03-06
<160>73
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>308
<212>PRT
<213>螟萤火虫(Photinus pyralis)
<400>1
Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys
        35                  40                  45
Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Leu Val Ser Phe Ile Ile Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Ser Pro Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ile Glu Ala
                85                  90                  95
Ile Val Asn Val Glu Pro His Ile Lys Asn Asn Arg Leu Asn Asp Gly
            100                 105                 110
Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Thr Gly Thr Met Ala Ile Asp
        115                 120                 125
Ala Gly Leu Pro Val Gly Pro Val Thr Gly Ser Leu Tyr His Leu Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Lys Lys Val Lys Met His Glu Ser Asn Ile Ala Ile Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Trp Ser Asn Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser
                165                 170                 175
Gly Lys Arg Arg Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ser
            180                 185                 190
Ile Ser Asn Gln Arg Pro Leu Phe Thr Phe Glu Lys His Glu Val Pro
        195                 200                 205
Gly Tyr Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Trp Val
    210                 215                 220
Ala Val Phe Gln Gly Gln Arg Ile Ile Lys Ile Ser Thr Gln Gln Pro
225                 230                 235                 240
Glu Val Leu Leu Asp Thr Val Lys Ile Pro Asp Pro Gln Val Thr Ser
                245                 250                 255
Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu His Val Thr Ser Ala
            260                 265                 270
Gly Leu Gln Leu Asp Asp Ser Ser Leu Asp Lys Ser Leu Val Asn Gly
        275                 280                 285
His Val Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Phe Ala Gly Val
    290                 295                 300
Lys Val Lys Leu
305
<210>2
<211>927
<212>DNA
<213>螟萤火虫
<400>2
atggggccag ttgttgaaaa aattgcagaa cttggcaagt atacggttgg agaaggtcct     60
cactgggatc atgaaactca gaccttatat ttcgtcgaca ccgtagagaa aacttttcat    120
aaatatgtac cttctcagaa aaaatacacg ttttgtaaag tagataaact ggtttctttc    180
attattcccc ttgctggatc ccctggccgt tttgtagtca gtttggaacg tgaaatagcc    240
attcttacat gggatggcgt tagtgctgca cctacaagca tagaagctat tgttaatgtc    300
gaaccacaca ttaaaaataa cagactcaat gatggcaaag cagatcccct tggcaatcta    360
tggacaggta caatggctat tgacgctggt ctccccgtag gaccggtcac tggcagttta    420
tatcatttag gggctgataa aaaggtaaaa atgcacgaga gcaacatagc tatagcaaat    480
gggctcgcgt ggagtaatga tttgaagaaa atgtattata ttgattcggg gaaaagaaga    540
gtagacgagt acgattatga tgcttctaca ttatccatca gcaatcaacg gccattattt    600
acttttgaaa agcatgaagt gcctggatat ccagatggtc aaacaattga tgaggagggt    660
aatttatggg ttgccgtttt ccaaggacag cgaattatta aaatcagtac ccaacaaccg    720
gaagtgttac tggataccgt aaaaatacca gatcctcagg tcacctctgt agcatttggc    780
ggtccgaatt tggatgaact gcatgtaaca tctgctggtc ttcagcttga cgacagttct    840
ttggacaaaa gtttagttaa tgggcacgtc tacagagtaa caggtttagg cgtcaaaggt    900
ttcgcgggag ttaaagtgaa gctatga                                        927
<210>3
<211>237
<212>PRT
<213>夜光萤火虫
<400>3
Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile Ile Pro Ile Ser Gly Cys Ser Asn Arg
1               5                   10                  15
Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg Glu Ile Ala Ile Leu Thr Trp Asp Gly
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser Ile Lys Thr Ile Ala Val Val Asp Asn
        35                  40                  45
Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn Arg Ile Asn Asp Gly Lys Ala Asp His
    50                  55                  60
Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Met Asp Val Asn Ala Phe Pro Thr
65                  70                  75                  80
Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu Phe Ser Met Asn Ser Thr Lys Asp Val
                85                  90                  95
Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile Ala Val Ser Asn Gly Ile Ala Trp Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser Lys Thr Arg Val Ile
        115                 120                 125
Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala Ser Asn Arg Leu Ile Ser Asn Arg Gln
    130                 135                 140
Thr Leu Phe Ser Leu Glu Lys His Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Gly
145                 150                 155                 160
Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp Asn Leu Trp Val Gly Val Phe Glu Gly
                165                 170                 175
Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser Thr His Ile Pro Glu Thr Leu Leu Tyr
            180                 185                 190
Thr Val Asn Leu Pro Asp Ser Leu Ile Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly
        195                 200                 205
Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Gly Gly Gly Asn Phe Leu Asn
    210                 215                 220
Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser Gly Leu Gly Val Gln Gly
225                 230                 235
<210>4
<211>863
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>4
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggtataa gttctacacc cacaagtata    120
aaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtctggaaa gtaatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata gaactataac    240
atgaaatcca acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atgcttttcc aacgggacca    300
ataactggta gattgtttag tatgaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccaagacta gagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga tttacattcg ttgcatattt atgttgttta ttttcaggta atcgtcaaac    540
attgtttagt ctggaaaagc atcaaatccc gggatttccc gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccttccagat tcgctggtga gtaaaagtat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag    840
tatctggtct aggtgttcaa ggt                                            863
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
atggggccag ttgttgaaaa aattg                                           25
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gcaatctatg gacaggtaca atgg                                            24
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
gggctgataa aaaggtaaaa atgca                                           25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
tcatagcttc actttaactc ccgcg                                           25
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
gcactaacgc catccca                                                    17
<210>10
<211>971
<212>DNA
<213>夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)
<220>
<221>misc_teature
<222>(102)..(102)
<223>n是不确定的
<220>
<221>misc_feature
<222>(444)..(444)
<223>n是不确定的
<220>
<221>misc_feature
<222>(278)..(278)
<223>n是不确定的
<400>10
gtacgtctcc aaatgacttc gtcatgagat gtgagcactt ctggtatgtg ttacgggtag     60
ttagatatcg catttaacga cgttacctaa cattttctac tnatggggag tgttatatag    120
taaagttttg aataattttc gtaagctagt cacaggtctc gatagaagtg taagctttaa    180
ccataaatgt taatgatatt attccattca attgagcttc tataaaatct tcattttttg    240
gtttataata ctgatgtgat cactgctaga ttacgttntt cgtagaattg gcaatataat    300
tatttaagcc gtaaatattt catcagtgta attgtcacta cgcatcactt ttttttgtct    360
gtctagtaca gcttacttcc ctcgttattt gtgtaatttc gcatagttat ggataatatc    420
tagtattatc taaatttacc tatngtgtat tacgccatgt agttaaaggt tgctgtatta    480
tcttatcata cattgaagtt aatacacaag taaaaacctt gatttttata gaaacctacg    540
acagcattgc aacggcacta gttaatagaa acagtggaag aagtggccaa tatgcagttt    600
ggagaaggac ctcattggaa tgataagaca caaagtttat atttggtgga ccttgtagat    660
aaatctattc acaaatatgt accatctctt aaaagacaaa cccatataaa agtaggcaag    720
tattattaca acttgttata tccgagtcaa ccaaataatg taaaaaattt acgtcagtcc    780
cactataaga tttaagaaat tcataaatat aaatttctat gctcattttc agataaaata    840
ccgtctttga ttattgccat aagcggttgt tcaaatcgtt ttcttattac tttagaccga    900
gaaatcgcca tccttacttg ggatggcatt agttctacac ccacaagtat agaaacaatc    960
gctgtagttg a                                                         971
<210>11
<211>1986
<212>DNA
<213>螟萤火虫(Photinus pyralis)
<400>11
atggggccag ttgttgaaaa aattgcagaa cttggcaagt atacgagttg gagaaggtcc     60
tcactgggat catgaaactc agaccttata tttcgtcgac accgtagaga aaacttttca    120
taaatatgta ccttctcaga aaaaatacac gttttgtaaa gtaggtaaga atcattgttc    180
aaactatcac gcgtaaccgt ttttacataa gtacaatgta aagtagctac gtacaccgtg    240
gatagtagca ttgtatttat aaacgaaata caatggtagc attgtattta tatagtaggc    300
actttatagt tagaaatagg ggaagtatta gccaagagta tacagggtgg tgagttgcgt    360
aacacattat agggatttca atgtaaaatt cataacatgc gattattggc tccccaaatt    420
attttagagc aaaaatgcat taaggttttt tgtagaaaaa cattttttac atcaatcaac    480
cgtattagtt ttaaaatttt aagcaagtca ccaccctgta tatactcttt ggtattagta    540
caagatccca cataaggcca acctcgctca tctgtttact gagtgaaata catctttgtt    600
agtaatcttt tatgtgtaaa caaacacact aaaaaactta agtcaagact atccttaaaa    660
tttctgtctg cttctattag atagagagga gacacacgga acaacacacg tttctctccc    720
gcgcgtttct taaaattacg acaaccgtgt gaaacaggac gttactcgtg acggcggtgt    780
acgcattaat gttaagagag tgcggcgcac tgaattttaa ttgagggtag tcttgactta     840
atttttttag gcaaccattt gcaatgtgtt tgattacata ttaaaattgc taaaacatgt     900
aattcacttg gtaaacagta gtcggtaggg cgaataatgc tgctatctat tttctcttct     960
atagcttatt gagctgagta tgaagggtag aatagcattt agattagcta aagaatggcg    1020
tgagaattta acccatctgt acataaactg aagttgatgc catttcagat aaactggttt    1080
cattcattat tccccttgct ggatcccctg gccgttttgt agtcagtttg gaacgtgaaa    1140
tagccattct cacgtgggat ggcgttagtg ctgcacctac gagcatagaa gctattgtta    1200
atgtcgaacc ccacattaaa aataacagac tcaatgatgg caaagcagat cctcttggca    1260
atctatggac aggtataact gaaatcgact aaccaaatta taataattct agctcgaatt    1320
ctttaggtac aatggctatt gacgctggtc tccccgtagg accggtcact ggcagtttat    1380
atcatttagg ggctgataaa aaggtaaaaa tgcacgagag caacatagct atagcaaatg    1440
ggctcgcgtg gagtaatgat ttgaagaaaa tgtattatat tgattcggga aaaagaagag    1500
tagacgagta cgattatgat gcttctacat tatccatcag taaacactat ttaaatatat    1560
tgcactattt tttgttagat gaatattttc aggcaatcaa cggccattat ttacttttga    1620
aaagcatgaa gtgcctggat atccagatgg tcaaacaatt gatgcggagg gtaatttatg    1680
ggttgccgtt ttccaaggac agcgaattat taaaatcagt accgaacaac cggaagtgtt    1740
actggatacc gtaaaaatac cagatcctca ggtaaattaa gtaactttgt gtattacatt    1800
aattaccttt ggagtcaggt cacctctgtt gcatttggcg gtccgaattt ggatgaactg    1860
tatgtaacat ctgctggtct tcagcttgac gacagttctt ttgacaaaag tttagttaat    1920
gggcacgtct acagagtaac aggtttaggc gtcaaaggtt tcgcgggagt taaagtgaag    1980
ctatga                                                               1986
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
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<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>12
aaraargtna aratgcayga                                                20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>13
aaraargtna aaatgcacga                                                20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>14
aaraargtna agatgcacga                                                 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>15
aaraargtna aaatgcatga                                                 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>16
aaraargtna agatgcatga                                                 20
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
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<223>n是a或g或c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>17
athctnacnt gggatgg                                                    17
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n是a或g或c或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a或g或c或t
<400>18
athctnacnt gggacgg                                                    17
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ccrgartcda trtartacat                                                 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ccrgartcda tatagtacat                                                 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ccrgartcda tgtagtacat                                                 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
ccrgartcda tataatacat                                                 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ccrgartcda tgtaatacat                                                 20
<210>24
<211>350
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<220>
<221>misc_feature
<222>182，207，208，225，282，283，329，337，342
<223>n是不确定的
<400>24
atcctgacgt gggatggcat aagttctaca cccacaagta tagaaacaat cgctgtagtt     60
gactatgagc caggtctgga aagtaataga attaatgatg gtaaagcaga tcatcttggt    120
aatctgtggg caggtgaatg aagaaatcta tagaactata acatgaaatc caacgcacct    180
tnttcaggca ccatggacgt aaatgcnnat attccaacgg gaccnataac tggtagattg    240
tttagtatga attctactaa agacgttaga tactacagaa cnnacatagc ggtgtcaaac    300
ggaatcgctt ggagtaaaga tctgaagana atgtatnata tngactccgg               350
<210>25
<211>289
<212>DNA
<213>螟萤火虫
<400>25
attcttacat gggatggcgt tagtgctgca cctacaagca tagaagctat tgttaatgtc     60
gaaccacaca ttaaaaataa cagactcaat gatggcaaag cagatcccct tggcaatcta    120
tggacaggta caatggctat tgacgctggt ctccccgtag gaccggtcac tggcagttta    180
tatcatttag gggctgataa aaaggtaaaa atgcacgaga gcaacatagc tatagcaaat    240
gggctcgcgt ggagtaatga tttgaagaaa atgtattata ttgattggg                289
<210>26
<211>343
<212>DNA
<213>螟萤火虫
<220>
<221>misc_feature
<222>(241)..(241)
<223>n是不确定的
<220>
<221>misc_feature
<222>(313)..(313)
<223>是不确定的
<220>
<221>misc_feature
<222>(331)..(331)
<223>n是不确定的
<400>26
attctgacgt gggatggcgt tagtgctgca cctacgagca tagaagctat tgttaatgtc     60
gaaccccaca ttaaaaataa cagactcaat gatggcaaag cagatcctct tggcaatcta    120
tggacaggta taactgaaat cgactaacca aattataata attctagctc gaattcttta    180
ggtacaatgg ctattgacgc tggtctcccc gtaggaccgg tcactggcag tttatatcat    240
ntaggggctg ataaaagggt agaaatgcac gagagcaaca tagctatagc aaatgggctc    300
gcgtggagta atnatttgaa gaaaatgtat natattgatt cgg                      343
<210>27
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
gatcatcttg gtaatctgtg ggcaggt                                         27
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
gcggtgtcaa acggaatcgc ttggagt                                         27
<210>29
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
acctgcccac agattaccaa gatgatc                                         27
<210>30
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
tctgctttac catcattaat tctattac                                        28
<210>31
<211>863
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>31
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggtataa gttctacacc cacaagtata    120
aaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtctggaaa gtaatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa cctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata gaactataac    240
atgaaatcca acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atgcttttcc aacgggacca    300
ataactggta gattgtttag tatgaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccaagacta gagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga tttacattcg ttgcatattt atgttgttta ttttcaggta atcgtcaaac    540
attgtttagt ctggaaaagc atcaaatccc gggatttccc gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccctccagat tcgctggtga gtaaaagtat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag    840
taactggtct aggtgttcaa ggt                                            863
<210>32
<211>851
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>32
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata    120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac    240
atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca    300
ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcctggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac    540
cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag    840
gtgttcaagg t                                                         851
<210>33
<211>863
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>33
gataaaatac cgtctttgat tgttcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggtataa gttctacacc cacaagtata    120
aaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtctggaaa gtaatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata gaactataac    240
atgaaatcca acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atgcttttcc aacgggacca    300
gtaactggta gattgtttag tatgaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccaagacta gagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga tttacattcg ttgcatattt atgttgttta ttttcaggta atcgtcaaac    540
attgtttagt ctggaaaagc atcaaatccc gggatttccc gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccttccagat tcgctggtga gtaaaagtat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag    840
tatctggtct aggtgttcaa ggt                                            863
<210>34
<211>851
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>34
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata    120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac    240
atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca    300
ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagc aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac    540
cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag    840
gtgttcaagg t                                                         851
<210>35
<211>863
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>35
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata    120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac    240
atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca    300
ttaaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac    540
cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccttccagat tcgctggtga gtaaaagtat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag    840
tatctggtct aggtgttcaa ggt                                            863
<210>36
<211>851
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>36
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata    120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac    240
atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca    300
ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccatgacta aagtaatagg tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac    540
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tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
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gtgttcaagg t                                                         851
<210>37
<211>851
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>37
gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact     60
ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata    120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt    180
aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac    240
atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca    300
ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac    360
atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat    420
tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata    480
cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac    540
cttgtttagt cttgaaaaga atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac    600
tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga    660
tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat    720
tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa    780
acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag    840
gtgttcaagg t                                                         851
<210>38
<211>867
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>38
atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac     60
cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa    120
gtagataaaa taccgtcttt gattattccc ataagcggtt gttcaaatcg ttttcttatt    180
actttagacc gagaaatcgc catccttact tgggatggta taagttctac acccacaagt    240
ataaaaacaa tcgctgtagt tgacaatgag ccaggtctgg aaagtaatag aattaatgat    300
ggtaaagcag atcatcttgg taatctgtgg gcaggcacca tggacgtaaa tggatatcca    360
acgggaccaa taaccggtag attgtttagt ataaattcta ctaaagacgt tagatactac    420
agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat    480
tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg    540
atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat    600
ggtcaaacaa ttgatactga tgataattta tgggttgctg tgttcgaagg aaacagagtg    660
ataaaaatta gtactcatat acctgaaaca ttactgtata ctgtaaacat tccagattcg    720
ctgataacct cggttgcttt tggtggacca aacttggatg aattgtacgt aacaggtggt    780
ggtaactttc tgaatgggaa agtttataaa gtatctggtc taggtgttca aggtttacct    840
gcaaatagga ttaaaataca taattaa                                        867
<210>39
<211>288
<212>PRT
<213>夜光萤火虫
<400>39
Met Gln Phe Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Asp Lys Thr Gln Ser Leu
1               5                   10                  15
Tyr Leu Val Asp Leu Val Asp Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser
            20                  25                  30
Leu Lys Arg His Thr His Ile Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Pro Ile Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg
    50                  55                  60
Glu Ile Ala Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser
65                  70                  75                  80
Ile Lys Thr Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn
                85                  90                  95
Arg Ile Asn Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly
            100                 105                 110
Thr Met Asp Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu
        115                 120                 125
Phe Ser Ile Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile
    130                 135                 140
Ala Val Ser Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala
                165                 170                 175
Ser Asn Arg Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn
            180                 185                 190
Asn Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp
        195                 200                 205
Asn Leu Trp Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Thr His Ile Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser
225                 230                 235                 240
Leu Ile Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr
                245                 250                 255
Val Thr Gly Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser
            260                 265                 270
Gly Leu Gly Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn
        275                 280                 285
<210>40
<211>1125
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<220>
<221>misc_feature
<222>(130)..(130)
<223>n是不确定的
<220>
<221>misc_feature
<222>(132)..(132)
<223>n是不确定的
<400>40
atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac     60
cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa    120
gtaggcaagn antatataca acttgttata tccgagtcaa ccaaataatg taaaaaattt    180
acgtcagtcc cactataaga tttaagaaat tcataaatat aaatttctat gctcattttc    240
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tttagaccga gaaatcgcca tccttacttg ggatggcatt agttctacac ccacaagtat    360
agaaacaatc gctgtagttg acaatgagcc aggtcttgaa aataatagaa ttaatgatgg    420
taaagcagat catcttggta atctgtgggc aggtgaatga agaaatctat aaaactataa     480
catgaaatca aacgcacctt tttcaggcac catggacgta aatggatatc caacgggacc     540
aataaccggt agattgttta gtataaattc tactaaagac gttagatact acagaacaaa     600
catagcggtg tcaaacggaa tcgcttggag taaagatttg aagaaaatgt attatattga     660
ttccatgact aaagtaatag gtcaatacga ttttgatgct tccaacagat tgatcagtat     720
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ggtgttcaag gtttacctgc aaataggatt aaaatacata attaa                    1125
<210>41
<211>867
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>41
atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac      60
cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa     120
gtagataaaa taccgtcttt gattattccc ataagcggtt gttcaaatcg ttttcttatt     180
actttagacc gagaaatcgc catccttact tgggatggta taagttctac acccacaagt     240
ataaaaacaa tcgctgtagt tgacaatgag ccaggtctgg aaagtaatag aattaatgat     300
ggtaaagcag atcatcttgg taatctgtgg gcaggcacca tggacgtaaa tggatatcca    360
acgggaccaa taaccggtag attgtttagt ataaattcta ctaaagacgt tagatactac    420
agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat    480
tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg    540
atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat    600
ggtcaaacaa ttgatactga tgataattta tgggttgctg tgttcgaagg aaacagagtg    660
ataaaaatta gtactcatat acctgaaaca ttactgtata ctgtaaacat tccagattcg    720
ctgataacct cggttgcttt tggtggacca aacttggatg aattgtacgt aacaggtggt    780
ggtaactttc tgaatgggaa agtttataaa gtatctggtc taggtgttca aggtttacct    840
gcaaatagga ttaaaataca taattaa                                        867
<210>42
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
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<210>43
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ctacttttat atgggtatgt cttttaag                                        28
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
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<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
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<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
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<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
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<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
gtaatcgtca aacattgttt agtc                                           24
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
cagcgaatct ggaakgttta cag                                             23
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ataacctcgg ttgcttttgg tgacc                                           25
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
attatrtatt ttwatcctat ttgcag                                          26
<210>52
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
atggggccag ttgttgaaaa aattgcag                                        28
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
tcatagcttc actttaactc ccgc                                            24
<210>54
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
gagctcccat gggccagttt ggagaaggac ctcattggg                            39
<210>55
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
gagctctcga gattatrtat tttwatccta tttgcag                              37
<210>56
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
gagctctcga gttaattatr tattttwatc ctatttgcag                           40
<210>57
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
gagctcccat ggggccagtt gttgaaaaaa ttgc                                 34
<210>58
<211>864
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>58
atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac     60
cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa    120
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agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat    480
tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg    540
atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat    600
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gcaaatagga ttaaaataca taat                                           864
<210>59
<211>288
<212>PRT
<213>夜光萤火虫
<400>59
Met Gln Phe Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Asp Lys Thr Gln Ser Leu
1               5                   10                  15
Tyr Leu Val Asp Leu Val Asp Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser
            20                  25                  30
Leu Lys Arg His Thr His Ile Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Pro Ile Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg
    50                  55                  60
Glu Ile Ala Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser
65                  70                  75                  80
Ile Lys Thr Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn
                85                  90                  95
Arg Ile Asn Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly
            100                 105                 110
Thr Met Asp Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu
        115                 120                 125
Phe Ser Ile Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile
    130                 135                 140
Ala Val Ser Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala
                165                 170                 175
Ser Asn Arg Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn
            180                 185                 190
Asn Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp
        195                 200                 205
Asn Leu Trp Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Thr His Ile Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser
225                 230                 235                 240
Leu Ile Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr
                245                 250                 255
Val Thr Gly Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser
            260                 265                 270
Gly Leu Gly Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn
        275                 280                 285
<210>60
<211>903
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的LRE-ChimLREI
<400>60
atggggccag ttgttgaaaa aattgcagaa cttggcaagt atacagttgg agaaggtcct     60
cactgggatc atgaaactca gaccttatat ttcgtcgaca ccgtagagaa aacttttcat    120
aaatatgtac cttctcagaa aaaatacacg ttttgtaaag tagataaaat accgtctttg    180
attattccca taagcggttg ttcaaatcgt tttcttatta ctttagaccg agaaatcgcc    240
atccttactt gggatggtat aagttctaca cccacaagta taaaaacaat cgctgtagtt    300
gacaatgagc caggtctgga aagtaataga attaatgatg gtaaagcaga tcatcttggt    360
aatctgtggg caggcaccat ggacgtaaat ggatatccaa cgggaccaat aaccggtaga    420
ttgtttagta taaattctac taaagacgtt agatactaca gaacaaacat agcggtgtca    480
aacggaatcg cttggagtaa agatttgaag aaaatgtatt atattgattc catgactaaa    540
gtaatagatc aatacgattt tgatgcttcc aacagattga tcagtaatcg tcaaacattg    600
tttagtcttg aaaataatca aatcccggga tttccagatg gtcaaacaat tgatactgat    660
gataatttat gggttgctgt gttcgaagga aacagagtga taaaaattag tactcatata    720
cctgaaacat tactgtatac tgtaaacatt ccagattcgc tgataacctc ggttgctttt    780
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gtttataaag tatctggtct aggtgttcaa ggtttacctg caaataggat taaaatacat    900
aat                                                                  903
<210>61
<211>301
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的LRE-ChimLREI
<400>61
Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys
        35                  40                  45
Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile Ile Pro Ile
    50                  55                  60
Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg Glu Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser Ile Lys Thr
                85                  90                  95
Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn Arg Ile Asn
            100                 105                 110
Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Met Asp
        115                 120                 125
Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu Phe Ser Ile
    130                 135                 140
Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile Ala Val Ser
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp
                165                 170                 175
Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala Ser Asn Arg
            180                 185                 190
Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn Asn Gln Ile
        195                 200                 205
Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp Asn Leu Trp
    210                 215                 220
Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser Thr His Ile
225                 230                 235                 240
Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser Leu Ile Thr
                245                 250                 255
Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Gly
            260                 265                 270
Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser Gly Leu Gly
        275                 280                 285
Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn
    290                 295                 300
<210>62
<211>309
<212>PRT
<213>十字萤火虫
<400>62
Met Ala Pro Thr Val Glu Gln Ile Val Glu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Glu Ser Pro His Trp Asp Asp Glu Thr Gln Ser Leu Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Asp Ile Val Gly Arg Ser Val Asn Lys Tyr Val Pro Thr Thr Lys Thr
        35                  40                  45
His Thr Gln Leu Lys Phe Asp Lys Asn Pro Ser Phe Ile Ile Pro Val
    50                  55                  60
Lys Gly Cys Ser Asp Arg Phe Ile Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Asn
65                  70                  75                  80
Leu Leu Thr Trp Asp Gly Ala Ser Ser Ala Pro Ser Lys Ile Glu Lys
                85                  90                  95
Ile Ala Val Phe Asp Asn Thr Pro Glu Lys Ser Glu Asn Arg Leu Asn
            100                 105                 110
Asp Gly Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Met Asn
        115                 120                 125
Met Gly Ser Asp His Thr Thr Gly Thr Pro Val Arg Gly Thr Leu Ser
    130                 135                 140
Ser Leu Ser Asn Lys Gln Val Lys Glu His Val Ser Glu Val Cys Ile
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Leu Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Phe Tyr Tyr Ile
                165                 170                 175
Asp Ser Ala Val Arg Gln Val Asp Gln Phe Asp Phe Asp Ala Lys Asn
            180                 185                 190
Leu Ser Leu Ser Asn Arg Gln Pro Leu Phe Thr Phe Asp Lys His Gly
        195                 200                 205
Ile Met Gly Ser Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Ala Glu Gly Asn Leu
    210                 215                 220
Trp Val Ala Thr Cys Gln Gly Asp Lys Val Leu Lys Ile Asp Thr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ile Val Glu Ile Pro Glu His Gln Val
                245                 250                 255
Thr Ser Val Cys Ile Gly Gly Ala Glu Leu Asn Val Leu Tyr Val Thr
            260                 265                 270
Thr Ala Ser Ile Lys Leu Pro Gly Ala Asp Glu Thr Lys Pro Met Lys
        275                 280                 285
Gly Ala Ile Tyr Lys Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Leu Pro Gly
    290                 295                 300
Asp Arg Val Lys Leu
305
<210>63
<211>307
<212>PRT
<213>横纹萤火虫
<400>63
Met Ser Pro Val Ile Glu Gln Ile Thr Glu Val Asp Asn Phe Gln Ile
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Thr Glu Thr Gln Ser Leu Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Asp Ile Leu Glu Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser Thr Lys Gln
        35                  40                  45
His Thr Lys Met Ile Leu Asn Lys Arg Pro Ser Phe Ile Ile Pro Ile
    50                  55                  60
Lys Glu Thr Ser Asp Arg Phe Val Ile Ser Leu Glu Arg Asp Ile Cys
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Thr Pro Ser His Leu Glu Thr
                85                  90                  95
Ile Val Thr Val Asp Thr Gly Ile Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp Gly
            100                 105                 110
Lys Ala Asp Ala Phe Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Leu Tyr Ser Lys
        115                 120                 125
Phe Asp Ile Glu Lys Gln Gly Pro Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Ser Leu
    130                 135                 140
Ser Asn Lys Gln Leu Arg Lys His Ile Ser Asn Ile Phe Leu Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Trp Asn Lys Asp Ser Lys Lys Phe Tyr Phe Ile Asp Ser
                165                 170                 175
Asn Lys Arg Thr Ile Asp Gln Phe Asp Tyr Asp Ser Glu Asn Leu Ile
            180                 185                 190
Ile Ser Asn Cys Gln Pro Leu Phe Thr Leu Asp Lys His Gly Ile Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Pro Asp Ala Gln Thr Ile Asp Glu Asn Asp Asn Leu Trp Val
    210                 215                 220
Ala Ile Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Thr Lys Gln Pro
225                 230                 235                 240
Glu Ser Leu Leu Gly Val Ile Asn Met Pro Glu Ser Leu Ile Thr Ser
                245                 250                 255
Val Cys Phe Gly Gly Ser Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Thr Ser
            260                 265                 270
Gly Ile Lys Glu Tyr Glu Thr Asp Ser Thr Lys Leu Val Lys Gly Gly
        275                 280                 285
Leu Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Leu Pro Ala His Arg
    290                 295                 300
Phe Ser Leu
305
<210>64
<211>958
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<220>
<221>misc_feature
<222>(389)..(389)
<223>n是不确定的
<400>64
atcgcattta tcgacgttcc taacatttta ctacttttgg ggagtgttat attgtaaagt     60
tttgaataat tttcgtaagc tagtcacagg tctcgataga agtgtaagct ttaaccataa    120
atgttaatga tattattcca ttcaattgag cttctataaa atcttcattt tttggtttat    180
aatgctgacg tgatcactgc tagattacgt tattcgtaga atttgcaata taattattta    240
agccgaaata tttcatcaat gagtacctca gtgtaattgt cactacgcat cacttttttt    300
tgtctgtcta gtacagctta cttccctcgt tatttgtgta atttcgtata gttatggata    360
atatctagta ttatctaaat ttacctatng tgtattacgt catgtagtta aaggttgctg    420
tattatcata catagaagtt aatacacaag taaaaacctt gatttttata gaaacctacg    480
acagcattgc aacggcacta gttatagaaa cagttgaaga agtggccaat atgcagtttg    540
gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac cttgtagata    600
aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa gtaggcaagt    660
attattacaa cttgttatat ccgagtcaac caaataatgt aaaaaattta cgtcagtccc    720
actataagat ttaagaaatt cataagtata aatttctatg ctcattttca gataaaatac    780
cgtctttgat tattgccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact ttagaccgag    840
aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata gaaacaatcg    900
ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa gtaatagaat taatgatggt aaagcaga      958
<210>65
<211>956
<212>DNA
<213>夜光萤火虫
<400>65
aaattactta gtcgtctttt gtaagtttat gaaaaagttg catttttatt aatttgaatt     60
ttgaataatt ttcgtaagct agtcacaggt ctcgatagaa gtgtaaactt taaccataaa    120
tgttaataat attattctat tcaactgagc ttctataaaa tcttcatttt tggtttataa    180
tactgatgta atctctgcta gattacgctt tggtagaatg gcaatataat taataattat    240
ttaattctaa atacttgatc aatgagtacc tccgtgtaat tgtcactacg catcactttt    300
tttgtctgtc tagtacagct tacttccctc gttatttgtg taatttcgtg tagttatgga    360
taatatctag tcttatctaa atttatgtac tacgtcatgt agttaaagat tgctgtatca    420
tcatacatta aagttaaatg caaaagtaaa aacattgatt tttatagaaa actacggcag    480
cattgcaacg gcactagtta tagaaacagt tgaagaattg ggcactttta agactggaga    540
aggacctcat tgggatgata aaacacaaag tttatatttg gtggaccttg tagataaatc    600
tattcacaaa tatgtaccat ctcttaaaag acatacccat ataaaagtag gcaagtatta    660
ttacaacttg ttatatccaa gtcaaccaaa taatgtaaaa aatttacgtc agtcccacat    720
tcataaatat aaatatatca taaatataaa tttctatgct cattttcaga taaaataccg    780
tctttgatta ttcccataag cggttgttca aatcgttttc ttattacttt agaccgagaa    840
atcgccatcc ttacttggga tggtataagt tctacaccca caagtataaa aacaatcgct    900
gtagttgaca atgagccagg tcttgaaagt aatagaatta atgatggtaa agcaga        956
<210>66
<211>300
<212>PRT
<213>螟萤火虫
<400>66
Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys
        35                  40                  45
Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Leu Val Ser Phe Ile Ile Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Ser Pro Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ile Glu Ala
                85                  90                  95
Ile Val Asn Val Glu Pro His Ile Lys Asn Asn Arg Leu Asn Asp Gly
            100                 105                 110
Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Thr Gly Thr Met Ala Ile Asp
        115                 120                 125
Ala Gly Leu Pro Val Gly Pro Val Thr Gly Ser Leu Tyr His Leu Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Lys Lys Val Lys Met His Glu Ser Asn Ile Ala Ile Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Trp Ser Asn Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser
                165                 170                 175
Gly Lys Arg Arg Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ser
            180                 185                 190
Ile Ser Asn Gln Arg Pro Leu Phe Thr Phe Glu Lys His Glu Val Pro
        195                 200                 205
Gly Tyr Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Trp Val
    210                 215                 220
Ala Val Phe Gln Gly Gln Arg Ile Ile Lys Ile Ser Thr Gln Gln Pro
225                 230                 235                 240
Glu Val Leu Leu Asp Thr Val Lys Ile Pro Asp Pro Gln Val Thr Ser
                245                 250                 255
Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu His Val Thr Ser Ala
            260                 265                 270
Gly Leu Gln Leu Asp Asp Ser Ser Leu Asp Lys Ser Leu Val Asn Gly
        275                 280                 285
His Val Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly
    290                 295                 300
<210>67
<211>292
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<220>
<221>CDS
<222>(108)..(284)
<223>
<400>67
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa     60
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacc atg ggc agc      116
                                                    Met Gly Ser
                                                    1
agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg cgc ggc agc      164
Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
    5                   10                  15
cat atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tcc gaa      212
His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu
20                  25                  30                  35
ttc gag ctc cgt cga caa gct tgc ggc cgc act cga gca cca cca cca      260
Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro
                40                  45                  50
cca cca ctg aga tcc ggc tgc taa caaagccc                             292
Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys
            55
<210>68
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<400>68
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1               5                   10                  15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
            20                  25                  30
Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala
        35                  40                  45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys
    50                  55
<210>69
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(72)
<223>
<400>69
ggt cgg gat ccg aat tcg agc tcc gtc gac aag ctt gcg gcc gca ctc       48
Gly Arg Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
gag cac cac cac cac cac cac tga gatccggctg ctaacaaagc cc              94
Glu His His His His His His
            20
<210>70
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<400>70
Gly Arg Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
Glu His His His His His His
            20
<210>71
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(93)
<223>
<400>71
ggt cgg atc cga att cga gct ccg tcg aca agc ttg cgg ccg cac tcg       48
Gly Arg Ile Arg Ile Arg Ala Pro Ser Thr Ser Leu Arg Pro His Ser
1               5                   10                  15
agc acc acc acc acc acc act gag atc cgg ctg cta aca aag ccc           93
Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ile Arg Leu Leu Thr Lys Pro
            20                  25                  30
<210>72
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<400>72
Gly Arg Ile Arg Ile Arg Ala Pro Ser Thr Ser Leu Arg Pro His Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ile Arg Leu Leu Thr Lys Pro
            20                  25                  30
<210>73
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表达区域
<400>73
gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg     60
cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg                                       89

Claims (34)

1.一种测定胞内ATP和/或基因表达的方法，该方法包括用带有编码萤光素酶和虫萤光素再生蛋白质的构建体转化细胞，把虫萤光素导入到所述细胞中，以及监控所述细胞的生物发光信号。
2.根据权利要求1的方法，其被用于监控胞内ATP的水平。
3.根据权利要求1的方法，其被用于监控萤光素酶表达。
4.根据前面权利要求中任一项的方法，其中用虫萤光素接触所述细胞且在测定开始之前pH减小到小于5，其后，所述细胞被恢复到生理pH条件。
5.根据前面权利要求中任一项的方法，其中所述细胞被进一步地转化使得其表达L-半胱氨酸消旋酶。
6.根据前面权利要求中任一前项的方法，其中所述的细胞能够表达另外一种具有与所述第一萤光素酶不同的Km值和不同的波长输出的萤光素酶。
7.一种DNA构建体，其含有(i)一个编码萤光素酶的核酸序列，和(ii)一个编码虫萤光素再生蛋白的核酸序列。
8.根据权利要求7的DNA构建体，其中(i)和(ii)的核酸序列被连接来表达含有萤光素酶和虫萤光素再生蛋白的融合蛋白。
9.根据权利要求7或权利要求8的DNA构建体，其进一步含有一个或多个其它的选自(iii)编码其它萤光素酶的核酸序列；和(iv)编码L-半胱氨酸消旋酶的核酸序列的元件。
10.根据权利要求7到9任一项的DNA构建体，其含有单个的载体。
11.根据权利要求7到9任一项的DNA构建体，其含有一个以上的可被用于细胞的共转化的载体。
12.一种用权利要求7到11任一项的DNA构建体转化的细胞。
13.根据权利要求12的细胞，其是哺乳动物或植物的细胞。
14.根据权利要求1到6任一项的方法，权利要求7到11任一项的DNA构建体或权利要求12到13任一项的细胞，其中的虫萤光素再生蛋白是蛋白SEQ NOS 1、62或63或其虫萤光素再生片段或所有这些中任一个的变体。
15.根据权利要求1到6任一项的方法，权利要求7到11任一项的DNA构建体或权利要求12到13任一项的细胞，其中的虫萤光素再生蛋白是一种含有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 59或SEQ ID NO 61的虫萤光素再生蛋白或其虫萤光素再生片段或变体。
16.根据权利要求15的方法、DNA构建体或细胞，其中的虫萤光素再生蛋白是含有SEQ ID NO 59的虫萤光素再生蛋白或其虫萤光素再生片段或变体。
17.一种可获自萤火虫种的虫萤光素再生蛋白，或其虫萤光素再生片段，或与其具有至少60％同源性的蛋白。
18.根据权利要求18的虫萤光素再生蛋白，其中的萤火虫种是夜光萤火虫。
19.根据权利要求17或权利要求18的虫萤光素再生蛋白，其含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39，或SEQ ID NO 59或虫萤光素再生片段，或所有这些的变体。
20.根据权利要求17到19任一项的蛋白，其含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或虫萤光素再生片段，或所有这些的变体。
21.根据权利要求17到19任一项的蛋白，其含有SEQ ID NO 59或虫萤光素再生片段，或所有这些的变体。
22.根据权利要求21的蛋白，其含有SEQ ID NO 59。
23.一种嵌合的萤光素酶再生蛋白，其含有由在不同种的萤光素酶再生蛋白基因中发现的外显子所编码的片段。
24.根据权利要求23的嵌合萤光素酶再生蛋白，其中至少一个所述的外显子来自萤火虫种的基因。
25.根据权利要求23或权利要求24的嵌合萤光素酶再生蛋白，其中至少一个所述的外显子来自萤火虫种的基因。
26.根据权利要求23到25任一项的嵌合萤光素酶再生蛋白，其含有与夜光萤火虫萤光素酶再生基因的外显子2，3，4和5编码的片段相连接的由螟萤火虫萤光素酶再生基因的外显子1编码的片段。
27.一种含有萤光素酶和虫萤光素再生蛋白的融合蛋白。
28.根据权利要求18的融合蛋白，其中的虫萤光素再生蛋白是权利要求17到26任一项的蛋白。
29.一种编码权利要求17到28任一项的蛋白的核酸。
30.根据权利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 4或SEQ ID NOS31到37的任一项。
31.根据权利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 40或其变体。
32.根据权利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 58或其变体。
33.根据权利要求29的核酸，其是一个cDNA序列。
34.一种产生旋光活性酶底物诸如D-虫萤光素的方法，其包括用任一权利要求的再生蛋白和任何其它的氨基酸诸如转化作用所必需的半胱氨酸接触所述底物的氧化形式，诸如氧合虫荧光素。
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