CN1149318A

CN1149318A - 虫荧光素酶

Info

Publication number: CN1149318A
Application number: CN95193259A
Authority: CN
Inventors: C·R·劳韦; P·J·怀特; J·A·H·默雷; D·J·施柯雷尔
Original assignee: Mitsubishi Heavy Industries Ltd
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2015-03-22
Also published as: US6132983A; NO319706B1; AU1954595A; DK0751996T3; EP1281762A3; EP1281762B1; RU2192467C2; FI963741A; KR100392020B1; AU697883B2; NO963983D0; GB9501170D0; ES2185697T3; NO963983L; DE69529337D1; JPH09510610A; EP1281762A2; EP0751996B1; ATE230800T1; JP2010088440A

Abstract

本发明通过将对应于Photinus pyralis虫荧光素酶第354位或Luciola虫荧光素酶第356位的谷氨酸替换成其它的氨基酸，尤其是赖氨酸的方法，提供了具有比野生型虫荧光素酶更高的热稳定性的具有虫荧光素酶活性的蛋白。本发明还提供了编码或表达该蛋白的DNA、载体或细胞，它们被用作使用本发明蛋白的进行荧光检测的测试试剂盒或试剂。优选的蛋白在相当于Photinus pyralis虫荧光素酶第215位或Luciola虫荧光素酶第217位的位置有第二个替换的氨基酸。

Description

虫荧光素酶

本发明涉及新的具有虫荧光素酶活性的蛋白以及编码及表达该蛋白的DNA和载体。具体地说，本发明提供了在30℃以上时具有热稳定性的虫荧光素酶。

萤火虫荧光素酶在ATP、Mg²⁺和分子氧存在时，催化荧光素的氧化反应，结果产生光。该反应具有约0.88的量子产率(见德鲁加和麦克埃里(1978)以及塞利格尔和麦克埃里(1960))，并且其发光特性可以用于测量ATP水平的光度分析中。

虫荧光素酶可以从昆虫(如萤火虫)体内直接获取，或者通过含有编码该酶的重组DNA构建体的微生物表达获得。可以从四种值得注意的萤火虫中获得该酶或编码该酶DNA，它们是日本的GENJI和HEIKE十字萤火虫(Luciola cruciata)和横纹萤火虫(Luciola lateralis)，东欧的明格列尔萤火虫(Luciola mingrelica)和北美的螟萤火虫(Photinuspyralis)。夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)是该酶的另一来源，它的虫荧光素酶的氨基酸序列有84％与螟萤火虫的同源。

野生型和重组型的虫荧光素酶的热稳定性表现为当它们暴露于约30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性。这样的不稳定性不能满足该酶在高温环境下使用或保存，或通过加热提高反应速度的要求。已知日本萤火虫荧光素酶可以通过在217位用一个异亮氨酸残基取代一个苏氨酸残基引起突变来使其在热失活反应中保持稳定(Kajiyama &Nakano(1993)生物化学32 13795-13799页)。通过这种方式，增加了该酶的热稳定性、pH稳定性以及比活。螟萤火虫和明格列尔萤火虫荧光素酶的热稳定化尚未见报道。

本发明提供了新的虫荧光素酶，它们具有比野生型虫荧光素酶更高的热稳定性，这是通过用其它氨基酸，特别是赖氨酸和精氨酸，取代分别存在于螟萤火虫、明格列尔萤火虫、横纹萤火虫和十字萤火虫中的保守序列中的一个谷氨酸残基完成的。该谷氨酸残基位于螟萤火虫荧光素酶的第354位，即保守氨基酸序列TPEGDDKPGA的第三个氨基酸，这个序列发现于该种和其它种萤火虫的虫荧光素酶中。

因此，本发明的第一个方面，是提供了一种具有虫荧光素酶活性的蛋白，并且其氨基酸序列60％以上与螟萤火虫、明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫的同源，该序列的特征在于相应于螟萤火虫虫荧光素酶第354残基和明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫虫荧光素酶第356残基的氨基酸残基不是谷氨酸。

该氨基酸可以是一个天然存在的氨基酸，或是一个所谓罕见氨基酸(unusual amino acid)，例如修饰的天然存在的氨基酸或其类似物。除谷氨酸以外的氨基酸类似物应被理解为那些同与它们类似的氨基酸对蛋白有相同功效的化合物。典型的罕见氨基酸列于美国和欧洲专利手册和专利案件实施细则：包含核苷酸和/或氨基酸序列的申请公开：修饰的和罕见的氨基酸。

优选的蛋白的特征在于：它包含一个氨基酸序列XGDDKPGA其中X不是谷氨酸。更优选的蛋白包含氨基酸序列TPXGDDKPGA，并且出于热稳定性考虑，优选的X是除天门冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸以外的其它任何氨基酸；更优选的是色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或天门冬酰胺，但最优选的是赖氨酸或精氨酸，或它们中任何一个的类似物。

应该注意到，有些种的虫荧光素酶可能在保守区TPXGDDKPA中有一个或两个氨基酸不同，但是，相应于序列中第三位氨基酸不是谷氨酸的虫荧光素酶的所有活性蛋白均由本发明提供。

在本发明的优选方式中，本发明的蛋白还把相应于Luciola萤火虫荧光素酶217位氨基酸或螟萤火虫215位的氨基酸变成疏水性氨基酸，优选的是异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，如EP 0524448 A所述。已发现这样的变化所导致的热稳定性的增加超过了第354位单独的变化；因此这两个变化具有的效果基本上是相互独立的，并且可以同时使用。

本发明的第二个方面，是提供编码本发明的蛋白的DNA，并且第三方面是提供一个载体，具体地说是一个质粒，它包含luc基因(编码虫荧光素酶的基因)，该基因以能够表达本发明的蛋白的形式存在。所述的存在形式是指载体包含能够控制本发明的蛋白表达的DNA序列，以便当该DNA序列导入到微生物宿主细胞中后，在加入适当的诱导剂的条件下，可以按照需要表达蛋白。

螟萤火虫、明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫的luc基因是众所周知的，并且可以通过标准的分子生物学技术分离。螟萤火虫的luc基因可以以pGEM质粒形式从普罗麦格公司买到。因此，制备本发明的DNA的适当方法和起始材料的来源是(i)使用天然存在的萤火虫基因组DNA，并用例如PCR法扩增从中获得的luc基因，(ii)pGEM以及(iii)Kajiyama&Nakano的pGLf37质粒。编码具有虫荧光素酶活性(即氧化虫荧光素同时发光的活性)的蛋白的其它基因，也将是获得一个DNA，并最终通过该基因表达本发明的蛋白的起始材料的合适的来源。

用于操纵野生型或其它的luc基因DNA以制备本发明的DNA的适合的载体是能够包容DNA，同时可以将天然存在的谷氨酸变换成可选的氨基酸的任何载体。对于化学诱变的基因突变，可以使用例如羟胺进行，本领域的技术人员会想到许多适合的载体，它们使基因突变前和突变后的基因操纵变得容易。

优选的是使luc基因在谷氨酸位点特异性突变，因此，需要一个定点基因突变操作。这样的操作在载体中最容易进行，它们对本领域的技术人员是熟知的。

为了表达野生型和已知型的，以及本发明的luc基因，适合的载体包括pKK223-3、pDR540(Boehringer Mannheim公司提供)和pT7-7；具有tac启动子的前两个载体受控于乳糖阻遏子，允许在异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的情况下诱导表达。pT7-7允许被T7-RNA聚合酶启动子控制，由此为在包含T7RNA聚合酶的大肠杆菌细胞内非常高水平的基因表达提供了基础。在这些载体中，当luc基因插入pT7-7载体时，发现表达效率是最高的。

由插入pKK223-3和pDR540的luc基因表达虫荧光素酶会导致具有野生型N末端序列的虫荧光素酶的表达，而由插入pT7-7的luc基因表达会导致具有附加的N末端氨基酸序列M-A-R-I-Q的融合蛋白的合成。带有luc基因的每个载体(称为构建体pPW204，PPW116和pPW304)中luc基因的核糖体结合位点和启始密码子示于实施例的表1中。

本发明的第三方面提供了能够表达本发明的蛋白的细胞；用这些细胞制备这些蛋白的方法和包含本发明的蛋白的测试试剂盒和试剂。本以明还提供了检测方法，其中ATP的检测使用了虫荧光素/虫荧光素酶试剂，它是本领域已知的，其特征为虫荧光素酶是一种本发明的蛋白。本发明的虫荧光素酶的制备物与野生型和重组野生型虫荧光素酶相比，在30-70℃时，特别是在37-60℃时，尤其是在40-50℃时相对耐热。

能够在DNA或载体(如细胞中的质粒)中用DNA序列表达异源蛋白的任何细胞，都可以用来表达本发明的蛋白。典型的这类细胞的是酵母和细菌细胞，例如啤酒酵母和大肠杆菌细胞，但是本领域的技术人员将会想到许多其它的适合蛋白表达的宿主生物。由于该蛋白是一种昆虫蛋白，因此昆虫细胞可能是优选的。该蛋白可以表达为具有与天然的和已知的重组虫荧光素酶相同结构的蛋白，或可以表达为该蛋白与其它氨基酸、肽、蛋白或其它化学物质例如上述M-A-R-I-Q序列的融合体或结合体。

本领域的技术人员应该意识到：一些宿主可能具有特殊的密码子偏向，例如，细菌在某些情况下用不同于酵母的密码子，因此导入这样的宿主的DNA可能被更有利地改变，为给定的氨基酸提供一个简并密码子，以便在该宿主中更好地表达。这样的简并DNA当然包括在本发明的DNA范围之内。

大肠杆菌BL21(DE3)是一个合适的宿主，并且具有可以稳定地整合到其染色体组中的T7RNA聚合酶，它受控于可诱导的IacUV5启动子，因此它与pT7-7得到的构建体相容。大肠杆菌B株如BL21缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶。这些缺陷有助于使外源蛋白在大肠杆菌中的表达和积累更稳定。对包含上述三种表达构建体之一的大肠杆菌BL21(DE3)粗提物的逐个分析表明，虫荧光素酶最高水平的表达来自于含有pPW304的构建体的细胞(见表2)。

本发明的突变蛋白除了热稳定性以外，还具有其它的优点。已发现在Photinus 354位/Luciola 356位的氨基酸突变导致了在虫荧光素氧化时发出的光的波长的变化，它依赖于替代谷氨酸的氨基酸或类似物。因此，本发明还提供了用作特异性结合试剂标记或报告基因(reportergene)的虫荧光素酶，当使用它们的蛋白产物进行虫萤光素酶氧化时，报告基因将背景特性报告为特殊波长的光；这一特性为甘氨酸、脯氨酸和天门冬氨酸的突变提供了用途。本发明的蛋白的另一个优点是如以下的实施例中所述，可以在更高的温度，例如37℃或更高的温度下制备它们并相应有高的产率，这一优点来自于它们的较高的热稳定性。

本发明的蛋白、DNA、载体和细胞将通过参照下面的非限制性实施例、图、表以及序列表，以示例的方式描述。本领域的技术人员还会因此想到其它蛋白、蛋白结合物、DNA、载体和细胞、带有上述材料的分析和检测试剂盒。

附图：

图1：显示了pPW204质粒的限制图谱，该质粒是如以下实施例所述，通过插入一个luc基因，从pKK223-3得到的。

图2：显示了pPW116质粒的限制图谱，该质粒是如以下实施例所述，通过插入一个luc基因，从pDR540得到的。

图3：显示了pPW304质粒的限制图谱，该质粒是如以下实施例插入一个luc基因，从pT7-7得到的。

图4：显示了pPW601a质粒的限制图谱，该质粒是利用pDR540和去掉Xho位点的PGEM-luc的BamH1/Sst1片段得到的。

图5：显示了重组的和野生型的Photinus虫荧光素酶(西格玛公司)热失活曲线。如以下实施例所述，该酶在给定的温度下温育20分钟。

图6：显示了在不同温度下生长的大肠杆菌BL21(DE3)pPW304粗提物的活性曲线。

图7：显示了从pPW304和pPW304M-1(本发明的编码用赖氨酸替代354位的谷氨酸编码的蛋白的质粒)获得的虫荧光素酶的热失活曲线。

图8：显示了在37℃下西格玛公司的野生型、pPW304和pPW304M-1的重组虫荧光素酶随时间的失活曲线。

图9：显示了在Tabor后的pT7-7的限制图谱。

图10：显示了证明在普罗麦格公司裂解缓冲液中，在40℃下本发明的大肠杆菌表达的虫荧光素酶的细胞粗提物的热失活曲线，该虫荧光素酶在354位的野生型的谷氨酸已分别被丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天门冬酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸取代。

图11：显示了在磷酸缓冲液中，47℃下，与A215L和E354K单突变相比，具有E354K赖氨酸和A215L亮氨酸变化的纯化的双突变的虫荧光素酶的热失活曲线。

图12：显示了赖氨酸E354k突变的、重组野生型的和天然的萤火虫荧光素酶在37℃pH7.75HEPES缓冲液加0.02％叠氮化物的条件下，残留初始活性的百分比随时间变化曲线。

图13：显示了重组野生型的、E354K单突变的和E354K+A215L双突变的虫荧光素酶在37℃表达时，用来检测培养细胞浓度的光密度的增加对虫荧光素酶活性的曲线。

图14：显示了10ng/ml的A215L和E354K单突变、A215L+E354K双突变、重组的以及西格玛公司野生型的虫荧光素酶在，pH7.75的包含1％BSA和0.02％叠氮化物的HEPES缓冲液、37℃时起始活性的百分数在5小时内随时间变化的曲线。

图15：显示了10ng/ml的A215L和E354K单突变、A215L+E354K双突变、重组的以及西格玛公司野生型的虫荧光素酶在pH7.75的包含1％BSA、0.02％叠氮化物、2mM EDTA和2mM DTT的HEPES缓冲液、37℃时，初始活性的百分比在5小时内随时间变化的曲线。

序列表：

在本说明书的结尾提供的序列表描述了如下的DNA和氨基酸的序列：

第1号序列：显示了编码本发明虫荧光素酶的DNA的DNA序列，其中螟萤火虫野生型密码子在第1063至1065位被突变；为了突变成赖氨酸，1063位的碱基突变成A。

第2号序列：显示了本发明蛋白的氨基酸序列，其中螟萤火虫野生型第354位的氨基酸谷氨酸变成了其它的氨基酸。

第3号序列：显示了用于pPW601的SDM突变的寡聚核苷酸序列，用于在实施例2中在第354位以赖氨酸替代谷氨酸。

第4号序列：显示了用于pPW601的SDM突变的寡聚核苷酸序列，用于在实施例5中在第215位给出亮氨酸。

第5号序列：显示了本发明蛋白的氨基酸序列，其中螟萤火虫野生型第354位的氨基酸谷氨酸变成了任一种其它氨基酸，并且215位的氨基酸变成了亮氨酸。

实施例

实施例1：含有本发明的DNA的质粒的制备

质粒pKK223-3和pDR540从Boehringer Mannheim公司获得；pDR540可从Pharmacia公司获得。

质粒pT7-7(参见现代分子生物学协定Vol II 16.2.1)是从StanTabor，生化系，哈佛医学院，波士顿，麻省402115处获得，并且(如图8所示)包含T7RNA聚合酶启动子φ10和插入pT7-5中PvuII和ClaI位点之间的T7基因10蛋白(T7bp22857至22972)的翻译起始位点。建立融合蛋白的独特的限制性位点(在填补5’末端后)是框架0：EcoR1；框架1：NdcI、SmaI、ClaI；框架2：BamHI、SalI、HindIII。原来的多联体SacI位点通过删除而被移去，并且在起始密码子上游提供了一个附加的XbaI位点。

萤火虫荧光素酶(由晶状悬液制得，Cat No L9009)，辅酶A和ATP得自西格玛化学公司。甲虫荧光素酶钾盐由普罗麦格公司得到。细胞提取物的制备依照普罗麦格技术公告第101号。等分的大肠杆菌培养物在细胞裂解试剂(25mM Tris-磷酸，pH7.8，2mM DTT，2mMEDTA，10％甘油，1％Triton X-100，2.5mg/ml BSA，1.25mg/ml溶菌酶)中室温下裂解10分钟，然后在检验前存放于冰浴中。

细胞系的虫荧光素酶的活性是通过监测菌落发出的生物光来检测的，这些菌落被转移到尼龙滤片(Hybond N，Amersham)上，并将滤片浸入含有0.5mM虫荧光素的100mM pH5.0的柠檬酸钠缓冲液(Wood&Deluca，(1987)生化年鉴161p501-507)。虫荧光素酶的体外检测在25℃125μl的检测缓冲液(20mM Tricine，1mM MgSO₄，0.1mM EDTA，33.3mM DTT，0.27mM辅酶A，0.47mM虫荧光素，0.53mM ATP和1至2μl的样品)中进行。检测混合液的最终pH值是7.8，光的测量是用一台BioOrbit 1250光度计进行的。

为了制备非特异性化学突变的DNA，包含luc基因的质粒根据Kironde et al(1989)Biochem.J.259，p421-426的方法用含0.8mM的羟胺，1mM EDTA的pH6.0的0.1mM的磷酸钠溶液在65℃的条件下处理2小时。突变后的质粒在G60DNA级的Nick柱(Pharmacia)上脱盐，之后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。

热失活研究是通过将具有虫荧光素酶活性的细胞粗提物在不同的温度下温育20分钟后测量剩余活力而进行的。在研究从西格玛得到的纯化的虫荧光素酶时，在失活前用普罗麦格裂解缓冲液稀释。为进行与时间有关的研究，包含50μl的细胞粗提物或溶于裂解缓冲液的西格玛虫荧光素酶的Eppendorf管在37℃下温育。在不同的时间取出试管并在检测前放入冰浴中冷却。剩余活力以初始活力的百分比表示。

pPW204、pPW116和pPW304的构建体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达虫荧光素酶的相对水平是0.1∶0.5∶1.0。细胞在LB培养基中37℃下培养至OD600的值为0.3，然后用IPTG诱导，并继续生长4小时，之后制备粗提物并测量活性。

表1：实施例1使用的表达构建体的核糖体结合位点(下划线)和起始密码子。

pPW304 AAGGAGATATACATATG^*CGTAGAATTCAAATG

pPW116 AGGAAACAGGATCCAATG^*

pPW204 AGGAAACAGCAAATG^*

将谷氨酸转变成其它氨基酸所需的定点基因突变用如下方案进行。因为谷氨酸到赖氨酸的突变依赖于一个独特的AvaI限制位点并将它破坏，因此有可能使用单一寡聚核苷酸作为基因突变和选择的寡聚核苷酸。

定点基因突变方案：

所选质粒用赖氨酸选择/突变的寡聚核苷酸变性并退火：5’-CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG-3’，其中下划线的T被错配。突变的DNA链被合成并连接，所有原来的限制性位点被AvaI消化。

使用Bio-Rad Gene Pulser version 2-89将质粒转化到细胞中，这里使用的是大肠杆菌BMH71-18mutS细胞。所得到的收获的细胞以及纯化的包含突变质粒和亲本质粒的混合质粒，在转化到大肠杆菌JM109细胞之前，用AvaI进行二次消化。这些细胞在选择性培养基上(LB琼脂+50μg/ml氨苄青霉素)铺平板，通过纯化质粒DNA和分析AvaI限制性位点的缺失筛选菌落。每次使用Birnboim and Doly((1979)核酸研究7，p1513)的碱裂解法纯化质粒DNA。精确的方案描述见于Transformer^RTM定点基因突变试剂盒(2版)，由Clontech Laboratories公司(美国)销售，目录号K1600-1。

图4显示了pPW601a的限制图谱，pPW601a是用PharmaciapDR540和从pGEM-luc得到的除去Xho位点的BamH1/Sst1片段的pPW116异构体。定点基因突变按照上述方法和Clontech的指示进行，例如将插入的野生型Photinus luc基因转变为如序列一所示的序列，其中1063-1065位为AGG，它能够表达如序列二所示的在第354位修饰为赖氨酸的蛋白序列。

实施例2：虫荧光素酶的热稳定性

在如上述方法制备的大肠杆菌的载体中，由luc基因表达的未修饰的和修饰的(即本发明的)各种虫荧光素酶的热稳定性已被测量，结果示于图5至图8。

50μg/ml的虫荧光素酶在43.5℃的条件下，在50mM pH7.8的磷酸钾缓冲液、1mM EDTA、0.2％(w/v)BSA、1mM DTT和10％硫铵中的活性t^1/2(半衰期)的比较所显示的达到剩余50％活性所需的时间如下：

西格玛野生型虫荧光素酶：达到t^1/2约1.5分钟

pPW601(354＝谷氨酸)：达到t¹²约5分钟

pPW601aK(354＝赖氨酸)：达到t¹²约30分钟

从前述的图表中，我们可以清楚地看出：用一个赖氨酸替代354位的谷氨酸，可以在高达至少43.5℃时提高虫荧光素酶的热稳定性。

实施例3：虫荧光素酶的热稳定性：

用与实施例1中类似的方法制备的多种虫荧光素酶的热稳定性已被检测，这些酶是由大肠杆菌载体中的相应于本发明的其它354位突变的SDM修饰的luc基因表达的，结果图示于图10。

在40℃的普罗麦格裂解缓冲液中进行了t^1/2的比较，所得的t^1/2以分钟为单位如下：

pPW601aK (354＝赖氨酸) 达到t^1/2约13分钟

pPW601aR (354＝精氨酸) 达到t^1/2约13分钟

pPW601aL (354＝亮氨酸) 达到t^1/2约10分钟

pPW601aI (354＝异亮氨酸) 达到t^1/2约10分钟

pPW601aN (354＝天门冬酰胺)达到t^1/2约10分钟

pPW601aV (354＝缬氨酸) 达到t^1/2约9分钟

pPW601aW (354＝色氨酸) 达到t^1/2约8分钟

pPW601aA (354＝丙氨酸) 达到t^1/2约6.5分钟

pPW601aY (354＝酪氨酸) 达到t^1/2约6.5分钟

pPW601aM (354＝甲硫氨酸) 达到t^1/2约5.5分钟

pPW601aF (354＝苯丙氨酸) 达到t^1/2约5分钟

pPW601aH (354＝组氨酸) 达到t^1/2约5分钟

pPW601aT (354＝苏氨酸) 达到t^1/2约4.5分钟

pPW601aQ (354＝谷氨酰胺) 达到t^1/2约4.5分钟

pPW601aC (354＝半胱氨酸) 达到t^1/2约4分钟

pPW601aS (354＝丝氨酸) 达到t^1/2约3.5分钟

pPW601aE (354＝谷氨酸) 达到t^1/2约1分钟

pPW601aD (354＝天门冬氨酸)达到t^1/2约1分钟

pPW601aP (354＝脯氨酸) 达到t^1/2约1分钟

pPW601aG (354＝甘氨酸) 达到t^1/2约小于1分钟

实施例4：虫荧光素酶在37℃和室温下的稳定性

pPW601K赖氨酸突变的虫荧光素酶(86ng/ml)、重组野生型虫荧光素酶(550ng/ml)、和天然型虫荧光素酶(西格玛公司)(62.5ng/ml)在37℃下，在加入0.02％叠氮化物作为防腐剂约1％BSA pH7.75的HEPES缓冲液中温育4小时。为了测量剩余活力，将lng虫荧光素酶加于D-虫荧光素底物，每分钟记录光度计的读数。

在37℃下温育2小时和在室温下10天后的剩余活力的测量结果如下。

37℃2小时后：

E354K突变的虫荧光素酶 70％剩余活力

重组野生型虫荧光素酶 12％剩余活力

西格玛天然虫荧光素酶 18％剩余活力

室温下10天后：

E354K突变的虫荧光素酶 85％剩余活力

重组野生型虫荧光素酶 59％剩余活力

西格玛天然虫荧光素酶 71％剩余活力

实施例5：354K∶215L双突变的制备和稳定性

pPW601a螟萤火虫虫荧光素酶的354赖氨酸：215亮氨酸双突变体的制备是通过使用如实施例1所描述的pPW601aE354K，并将它用第四号序列的寡聚核苷酸5’-GAATCTGACGCAGAGAGTTCTATGCGG-3’进行突变，其中下划线的碱基代表引起突变的错配。这一突变的确认是通过对如实施例1的方法在大肠杆菌体内表达的合成的虫荧光素酶进行DNA测序并进行热稳定性检测实现的，该检测是在如实施例2至4所描述的条件下进行的，即使用包含1mM EDTA，0.2％(w/v)BSA，1mM DTT和10％硫铵的pH7.8的磷酸缓冲液作为热失活介质。

在43.5℃磷酸缓冲液中，32分钟之后只失去不到5％的活力，而在47℃时，t^1/2约是38分钟。在50℃温育16分钟后，双突变体保留了大约15％的活力。失活检测的结果图示于图12。

实施例6：虫荧光素酶的纯化

表达重组野生型或突变型虫荧光素酶的大肠杆菌JM109细胞在含有50μg/ml的氨苄青霉素的Luria Broth(LB)培养基中在30℃下培养，并在对数早期用IPTG(1mM)诱导表达。细胞在稳定期中期收获，并重悬于含有50mM KCl，1mM dithiothreitol，1.2mM甲硫磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA的Tris-HCl pH8.0缓冲液(缓冲液A)。细胞的破碎是通过一台MSE soniprep 150超声机(振幅14μ)裂解进行的，然后将细胞裂解液在30000xg离心30分钟。之后将上清中的粗提物用硫酸铵进行分级分离，发现在饱和度35％至55％之间的沉淀部分含有虫荧光素酶活性，将其溶于缓冲液A。

提取物在用含有0.5mM DTT的50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液(缓冲液B)平衡的Pharmacia PD10柱上脱盐，脱盐后的提取物加于PharmaciaMono Q阴离子交换柱，用具有从0至500mM NaCl线性梯度的缓冲液B洗脱，流速为4ml/分钟，每部分为2ml。收集虫荧光素酶活性的峰值部分并用含有0.5mM DTT和12％(v/v)甘油的pH7.5的25mM硫酸钠缓冲液透析以利于长期保存。

实施例7：纯化的虫荧光素酶的热失活

含有无细胞的虫荧光素酶提取物的Eppendorf管如实施例6中所述进行准备。纯化的虫荧光素酶制备物在由pH7.8 50mM磷酸钾缓冲液组成的热稳定缓冲液中温育，该缓冲液包含10％饱和度的硫酸铵、1mM dithiothreitol和0.2％的牛血清白蛋白(BSA)。在设定的时间取出一只试管，并在检测前在冰/水浴中冷却，检测剩余活力占初始活力的百分比。

纯化的重组野生型的和热稳定的虫荧光素酶的阿里纽斯图是通过测量在热稳定缓冲液中从42℃到50℃的温度范围内失活的半衰期来绘制的。以分钟记的t^1/2的自然对数对1/K作图。在相同的失活速率下，E354K突变体的热稳定度在这一温度范围内增加了2℃，与之相比，A215L突变体增加了5℃，E354K-A215L双突变体增加了6℃；后者显示了双突变体的加和属性。

实施例8：与野生型重组虫荧光素酶相比，突变型虫荧光素酶在大肠杆菌体内更高效的表达

检测大肠杆菌JM109细胞在37℃的液本培养基中生长时表达的荧光素酶，发现表达热稳定突变体的细胞在生长过程中积聚的活性虫荧光素酶比表达重组野生型酶的细胞要多，图13通过虫荧光素酶的活性与重组野生型、E354K+A215L双突变体和E354K的培养基在600nm处的光密度的增加图示了这一结果。可以看到，单突变体和双突变体的提高的热稳定性允许在37℃的培养温度下生产更多的虫荧光素酶。

实施例9：在37℃下，缓冲液对虫荧光素酶突变体的稳定性的影响

A215L、E354K、E354K+A215L、重组野生型和西格玛虫荧光素酶10ng/ml的溶液分别制备于含有1％BSA和0.02％叠氮化物的HEPESpH7.5缓冲液，其在37℃时的热稳定性与相同条件下加入2mM EDTA和2mN DTT相比较。结果示于图14和15，该结果说明A215L和E354K的相对稳定性在37℃下随缓冲液的不同而不同。

实施例10：氨基酸的取代对氧化D-虫荧光素时所发出的光的波长的影响

对用实施例3中列出的本发明的各种虫荧光素酶氧化D-虫荧光素所发射的光的波长进行测量，发现其随氨基酸取代的不同而不同。重组野生型(E354)和E354K所发射的光的波长之间有5nm的差异，而E354K和E354I之间有大约15nm的差异。

在D-虫荧光素存在的情况下，野生型重组大肠杆菌有机体发出黄绿色的荧光。当加入D-虫荧光素后，各突变大肠杆菌发出的光的颜色如下：

E354G 黄绿色

E354N 黄绿色

E354A 绿色

E354V 橙红色

E354M 橙红色

E354F 黄绿色

E354L 黄色

E354Y 黄绿色

E354S 黄绿色

E354C 黄绿色

E354K 黄色

E354Q 黄绿色

E354W 黄绿色

E354T 黄绿色

E354P 橙色

E354R 橙黄色

E354H 黄绿色

E354N 黄色

E354I 红色

序列表

(1)一般信息：

(i)申请者：

(A)名称：THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HERBRITANNIC MAJESTY

(B)街名：白厅

(C)城市：伦顿

(E)国家：英国(GB)

(F)邮编：SW1A 2HB

(A)姓名：CHRSTOPHER ROBIN LOWE

(B)街名：剑桥大学；TENNIS COURT ROAD

(C)城市：剑桥

(D)州名：剑桥郡

(E)国家：英国(GB)

(F)邮编：CB2 1QT

(A)姓名：PETER JOHN WHITE

(B)街名：剑桥大学；TENNIS COURT ROAD

(C)城市：剑桥

(D)州名：剑桥郡

(E)国家：英国(GB)

(F)邮编：CB2 1QT

(A)姓名：JAMES AUGUSTUS HENRY MURRAY

(B)街名：剑桥大学；TENNIS COURT ROAD

(C)城市：剑桥

(D)州名：剑桥郡

(E)国家：英国(GB)

(F)邮编：CB2 1QT(A)姓名：DAVID JAMES SQUIRRELL(B)街名：CBDE，PORTON DOWN(C)城市：SALISBURY(D)州名：WILTSHIRE(E)国家：英国(GB)(F)由编：SP4 0JQ(ii)发明名称：虫荧光素酶(iii)序列数：5(iv)计算机可阅读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release@1.0，Version@1.25(EPO)(vi)以前申请资料：(A)申请号：GB9405750.2(B)提交日期：1994年3月23日(vi)申请号：GB9501170.6(B)提交日期：1995年1月20日(2)第1号序列信息：(i)序列特性：(A)长度：1722个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(染色体)(iii)假设：无(iii)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：Photinus pyralis(ix)特性：(A)名称/关键词：CDS(B)位置：4..1653(xi)序列描述：第1号序列：CAAATGGAAG ACGCCAAAAA CATAAAGAAA GGCCCGGCGC CATTCTATCC TCTAGAGGAT 60GGAACCGCTG GAGAGCAACT GCATAAGGCT ATGAAGAGAT ACCCCCTGGT TCCTGGAACA 120ATrGCTTTTA CAGATGCACA TATCGAGGTG AACATCACGT ACGCGGAATA CTTCGAAATG 180TCCGTTCGGT TGGCAGAAGC TATGAAACGA TATGGGCTGA ATACAAATCA CAGAATCGTC 240GTATGCAGTG AAAACTCTCT TCAATTCTTT ATGCCGGTGT TGGGCGCGTT ATTTATCGGA 300GTTGCAGTTG CGCCCGCGAA CGACATTTAT AATGAACGTG AATTGCTCAA CAGTATGAAC 360ATTTCGCAGC CTACCGTAGT GTTTGTTTCC AAAAAGGGGT TGCAAAAAAT TTTGAACGTG 420CAAAAAAAAT TACCAATAAT CCAGAAAATT ATTATCATGG ATTCTAAAAC GGATTACCAG 480GGATTTCAGT CGATGTACAC GTTCGTCACA TCTCATCTAC CTCCCGGTTT TAATGAATAC 540GATTTTGTAC CAGAGTCCTT TGATCGTGAC AAAACAATTG CACTGATAAT GAATTCCTCT 600GGATCTACTG GGTTACCTAA GGGTGTGGCC CTTCCGCATA GAACTGCCTG CGTCAGATTC 660TCGCATGCCA GAGATCCTAT TTTTGGCAAT CAAATCATTC CGGATACTGC GATTTTAAGT 720GTTGTTCCAT TCCATCACGG TTTTGGAATG TTTACTACAC TCGGATATTT GATATGTGGA 780TTTCGAGTCG TCTTAATGTA TAGATTTGAA GAAGAGCTGT TTTTACGATC CCTTCAGGAT 840TACAAAATTC AAAGTGCGTT GCTAGTACCA ACCCTATTTT CATTCTTCGC CAAAAGCACT 900CTGATTGACA AATACGATTT ATCTAATTTA CACGAAATTG CTTCTGGGGG CGCACCTCTT 960TCGAAAGAAG TCGGGGAAGC GGTTGCAAAA CGCTTCCATC TTCCAGGGAT ACGACAAGGA 1020TATGGGCTCA CTGAGACTAC ATCAGCTATT CTGATTACAC CCNNNGGGGA TGATAAACCG 1080GGCGCGGTCG GTAAAGTTGT TCCATTTTTT GAAGCGAAGG TTGTGGATCT GGATACCGGG 1140AAAACGCTGG GCGTTAATCA GAGAGGCGAA TTATGTGTCA GAGGACCTAT GATTATGTCC 1200GGTTATGTAA ACAATCCGGA AGCGACCAAC GCCTTGATTC ACAAGGATGG ATGGCTACAT 1260TCTGGAGACA TAGCTTACTG GGACGAAGAC GAACACTTCT TCATAGTTGA CCGCTTGAAG 1320TCTTTAATTA AATACAAAGG ATATCAGGTG GCCCCCGCTG AATTGGAATC GATATTGTTA 1380CAACACCCCA ACATCTTCGA CGCGGGCGTG GCAGGTCTTC CCGACGATGA CGCCGGTGAA 1440CTTCCCGCCG CCGTTGTTGT TTTGGAGCAC GGAAAGACGA TGACGGAAAA AGAGATCGTG 1500GATTACGTCG CCAGTCAAGT AACAACCGCG AAAAAGTTGC GCGGAGGAGT TGTGTTTGTG 1560GACGAAGTAC CGAAAGGTCT TACCGGAAAA CTCGACGCAA GAAAAATCAG AGAGATCCTC 1620ATAAAGGCCA AGAAGGGCGG AAAGTCCAAA TTGTAAAATG TAACTGTATT CAGCGATGAC 1680GAAATTCTTA GCTATTGTAA TCCTCCGAGG CCTCGAGGTC GA 1722(2)第2号序列信息：(i)序列特点：(A)长度：550个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(iii)假设：无(vi)最初来源：(A)有机体：螟萤火虫(ix)特性：(A)名称/关键词：修饰位点(B)位置：354(xi)序列描述：第2号序列：Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro1 5 10 15Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

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405 410 415Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

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450 455 460Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465

470 475 480Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

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515 520 525Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540Gly Gly Lys Ser Lys Leu545 550(2)第3号序列信息：(i)序列特点：(A)长度：22个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(染色体)(iii)假设：无(Vi)最初来源：(A)有机体：螟萤火虫(ix)特性：(A)名称/关键词：misc-.区别(B)位置：代替(10，“”)(xi)序列描述：第3号序列：CATCCCCCTT GGGTGTAATC AG(2)第4号序列信息：(i)序列特点：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(染色体(iii)假设：无(vi)最初来源：(A)有机体：螟萤火虫(ix)特性：(A)名称/关键词：misc-.区别(B)位置：代替(16..l7，“”)(xi)序列描述：第4号序列：GAATCTGACG CAGAGAGTTC TATGCGG(2)第5号序列信息：(i)序列特点：(A)长度：550个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(iii)假设：无(Vi)最初来源：(A)有机体：螟萤火虫(ix)特性：(A)名称/关键词：修饰位点(B)位置：354(ix)特性：(A)名称/关键词：修饰位点(B)位置：215(xi)序列描述：第5号序列：Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro1 5 10 15Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

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450 455 460Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu465 470 475 480Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

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515 520 525Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540Gly Gly Lys Ser Lys Leu545 550

Claims

1.一种具有虫荧光素酶活性的蛋白，其与从螟萤火虫、明格列尔萤火虫、十字萤火虫或横纹萤火虫获得的虫荧光素酶有60％以上的氨基酸序列同源性，其特征为对应于螟萤火虫的虫荧光素酶第354位残基或明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫的虫荧光素酶第356位残基的氨基酸残基是非谷氨酸的氨基酸。

2.权利要求1中的蛋白，其特征在于它包含一段氨基酸序列XGDDKPGA，其中X是非谷氨酸的氨基酸。

3.权利要求2中的蛋白，其特征在于它包含一段氨基酸序列TPXGDDKPGA，其中X是非谷氨酸的氨基酸。

4.权利要求1、2或3中的蛋白，其特征在于氨基酸X不是甘氨酸、脯氨酸或天门冬氨酸。

5.权利要求1、2或3中的蛋白，其特征在于氨基酸X是色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和天门冬酰胺中的一种或它们之中任何一种的类似物或修饰体。

6.权利要求1、2或3中的蛋白，其特征在于氨基酸X是赖氨酸和精氨酸中的一种或它们之中任何一种的类似物或修饰体。

7.一种包含第2号序列中所描述的氨基酸序列的蛋白，其中Xaa是权利要求5或6中所列的任何一种氨基酸或其类似物或修饰体。

8.编码权利要求1至7任一权项中的蛋白的DNA。

9.权利要求8中的DNA，它包含一个如第1号序列所描述的核苷酸序列，其中在1063至1065位的三个N碱基形成编码非谷氨酸的氨基酸的密码子。

10.权利要求9中的DNA，其中的密码子编码权利要求5或6中所列的氨基酸、类似物或修饰体。

11.一种包含编码权利要求1至7任一权项中的蛋白的luc基因的载体。

12.权利要求11中的载体，它可以通过将包含野生型或重组型luc基因的载体进行定点基因突变得到，该突变将编码螟萤火虫的虫荧光素酶第354位的谷氨酸或明格列尔萤火虫、十字萤火虫或横纹萤火虫的虫荧光素酶第356位的谷氨酸的密码子改变成编码其它氨基酸或氨基酸类似物或修饰体的密码子。

13.权利要求12中的载体，其中其它氨基酸是权利要求5或6中列出的任何一种氨基酸、类似物或修饰体。

14.权利要求9至13任一权项中的载体，它选自连接了luc基因的pKK223-3、pDR540和pT7-7。

15.一种可以表达权利要求1至7任一权项中的蛋白的细胞，它含有权利要求8至14任一权项中的DNA或载体。

16.权利要求15中的细胞，它是大肠杆菌、啤酒酵母或昆虫细胞。

17.一种通过测量ATP来进行检测的测试试剂盒，其特征在于该试剂盒所含的荧光试剂中含有权利要求1至7任一权项中的蛋白。

18.一种检测方法，其中ATP的测量是通过虫荧光素和虫荧光素酶产生光来进行的，其产生光的量与ATP的数量有关，该方法的特征在于虫荧光素酶是权利要求1至7任一权项中的蛋白。

19.权利要求18中的检测方法，其中检测是在30℃至70℃的温度下进行的。

20.权利要求18中的检测方法，其中检测是在37℃至60℃的温度下进行的。

21.权利要求18中的检测方法，其中检测是在40℃至50℃的温度下进行的。

22.一种虫荧光素酶的制备物，它可以在没有热稳定剂的情况下，在室温下保存10天后维持85％或更高的虫荧光素酶活力。

23.将权利要求1至7或22任一权项中的虫荧光素酶用作特异性结合试剂标记的应用。

24.一种检测试剂盒，其特征在于它包含用权利要求1至7任一权项中的虫荧光素酶标记的特异性结合试剂。

25.将权利要求8至14任一权项中编码虫荧光素酶的DNA或载体用于表明细胞或DNA特性的应用。