CN1413252A - 新型酶 - Google Patents

新型酶 Download PDF

Info

Publication number
CN1413252A
CN1413252A CN00817736.8A CN00817736A CN1413252A CN 1413252 A CN1413252 A CN 1413252A CN 00817736 A CN00817736 A CN 00817736A CN 1413252 A CN1413252 A CN 1413252A
Authority
CN
China
Prior art keywords
luciferase
luciola
amino
residues
photinus pyralis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00817736.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100516223C (zh
Inventor
D·J·斯奎雷尔
M·J·莫菲
R·L·普里斯
P·J·怀特
T·L·维利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
3M Innovative Properties Co
Original Assignee
UK Secretary of State for Defence
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9925161.3A external-priority patent/GB9925161D0/en
Application filed by UK Secretary of State for Defence filed Critical UK Secretary of State for Defence
Publication of CN1413252A publication Critical patent/CN1413252A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100516223C publication Critical patent/CN100516223C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

一种具有荧光素酶活性而且与野生型荧光素酶具有至少60％相似性的重组蛋白，其中在所述酶的序列中，在对应于Photinus pyralis荧光素酶357位上残基的氨基酸残基与对应的野生型荧光素酶相比是突变的，使得与对应的野生型荧光素酶相比所述荧光素酶能够发不同波长的光和/或与对应的野生型荧光素酶相比所述酶的热稳定性增强。一般而言，对应于Photinus pyralis荧光素酶357位的残基由一个酸性氨基酸变为一个非酸性氨基酸，优选为不带电荷的极性氨基酸，例如酪氨酸。依照本发明的突变型荧光素酶能够产生发射光的大的波长移动(50nm)，而且具有很好的热稳定性。产生的色位移通过加入辅酶A可以被逆转。这些特性使所述突变体在各种各样的检测中特别有用。

Description

新型酶
本发明涉及一种新型的蛋白质，详细地讲是与对应野生型荧光素酶相比显示出明显特性的突变型荧光素酶，还涉及编码这些蛋白质的DNA，涉及这些酶在检测中的应用和包含这些酶的检测试剂盒。
萤火虫荧光素酶在ATP、Mg2+和分子氧存在的条件下催化荧光素的氧化，从而造成光的产生。这个反应的量子产率大约为0.88。所述光发射的特性使得它能够应用于各种各样测量ATP水平的发光检测中。这些检测的例子包括那些建立在EP-B-680515和WO 96/02665中所述基础上的检测，但许多其他的例子是一些在实验室中常规使用的。
荧光素酶从昆虫体内能够直接获得，详细地讲是甲虫类，例如萤火虫。已经获得荧光素酶的具体物种包括日本GENJI萤火虫或KEIKE萤火虫、Luciola cruciata和Luciola lateralis、东欧萤火虫Luciolamingrelica、北美萤火虫Photinus pyralis和萤火虫欧洲萤(Lampyrisnoctiluca)。
然而，由于编码这些酶的许多基因已经被克隆和测序，因此这些酶也可以通过重组DNA技术产生。用编码所述酶的重组DNA序列转化微生物，例如大肠杆菌(E.coli)，然后这些微生物表达所需的酶产物。
当这些酶用于实验室中的检测时，它们所发射光的颜色一般是相似的。如果波长能够改变，这对于由特殊检测器更容易地识别或应用于需要多重报道分子的系统(例如监测同一样品中的不同事件)是有用的。辨别报道分子的一种方法就是利用能够在截然不同的波长下发光的荧光素酶分子。这可以利用含有从不同的甲虫或萤火虫物种中获得的荧光素酶的报道分子来实现。然而一种可供选择的策略是利用重组DNA技术产生突变型荧光素酶，这样在信号的波长上产生变化。这种突变体的例子在WO 95/18853中有提供。
此外，当野生型和重组型荧光素酶暴露于超过约30℃的温度，具体的将是超过35℃时，它们的热稳定性会使其很快失活。当所述酶在高的环境温度下使用或保存，或者是在高温反应条件下进行检测时，例如为了加快反应速度，则这种不稳定性会引发出问题。
从EP-A-524448和WO/95/25798中知道了热稳定性增强的突变型荧光素酶。前者描述一种突变型荧光素酶，其中在日本萤火虫荧光素酶的217位上有个突变，详细地讲是由一个异亮氨酸残基取代了一个苏氨酸残基。后者描述多种突变型荧光素酶，这些突变型荧光素酶与来自Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis的荧光素酶具有超过60％的相似性，但对应于Photinus pyralis354位上残基或Luciola物种356位上残基的氨基酸残基是突变的，而非谷氨酸，详细地讲不是谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或甘氨酸。
同时待审的申请号为9823468.5的英国专利申请和源于它的国际专利申请描述了其它这种突变体。在这个专利申请中，所描述的蛋白质具有荧光素酶活性，而且与诸如来源于Photinus pyralis、Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis的野生型荧光素酶具有至少60％的相似性，但在所述蛋白质的不同位置上都有突变，这其中包括(a)对应于Photinus pyralis荧光素酶214位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶216位上残基的氨基酸残基；或(b)对应于Photinus pyralis荧光素酶232位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶234位上残基的氨基酸残基；或(c)对应于Photmus pyralis荧光素酶295位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶297位上残基的氨基酸残基。
本申请人发现，在荧光素酶蛋白的不同位置上突变(或引入)一个氨基酸，可以获得发射光大的波长移动和/或所述酶的热稳定性增强。此外，发射光的光子(proton)通量可以增大，这就使得所述酶更好地适用于阻止辉光动力学的体内检测或不存在CoA或其他“诱发辉光动力学”的化合物的体外检测。
本发明提供了一种具有荧光素酶活性而且与野生型荧光素酶具有至少60％相似性的重组蛋白，其中在所述酶的序列中，，在对应于Photinus pyralis荧光素酶357位上残基的氨基酸残基与对应的野生型荧光素酶相比是突变的，使得与对应的野生型荧光素酶相比，所述荧光素酶能够发射不同波长的光和/或所述酶的热稳定性增强。
能够成为本发明重组类型基础的野生型荧光素酶序列包括Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis、Hotaria paroula、Pyrophorus plagiophthalamus、欧洲萤、Pyrocoelia nayako、Photinus pennsylvanica或Phrixothrix(railroad-worm——参见Biochem.38(1999)8271-8279)。
来自能够利用底物D-荧光素(4，5-二氢-2-[6-羟基-2-苯并噻唑基]-4-噻唑羧酸)来发光的不同物种的生物发光酶可以构成本发明突变型酶的基础。
能够构成本发明重组类型基础的特定的野生型荧光素酶序列包括Photinus pyralis Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis、Hotaria paroula、Pyrophorus plagiophthalamus、欧洲萤、Pyrocoelia nayako和Photinus pennsylvanica。
详细地讲，所述荧光素酶是可由Photinus pyralis、Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis的酶获得的酶。在Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis酶中，合适的氨基酸残基是在序列359位上。
所有这些不同的荧光素酶序列显示它们是高度保守的，它们之间具有显著的相似性。这就意味着通过检查序列以检测最相似区域，可以很容易地确定所述酶序列中的相对应区域，虽然必要时，为了确定不同序列间的相对应区域或特定氨基酸可以利用市售的软件(例如：来自Wisconsin大学遗传计算机小组的“Bestfit”软件；参见Devereux等(1984)Nucleic Acid Research 12：387-395)。可选择地或补充地，通过参考L.Ye等在Biochim.Biophys Acta 1339(1997)39-52发表的论文来确定对应的氨基酸，这篇论文公开了所述酶的序列和编号，关于本申请，使用这个编号系统。
关于对应于Photinus pyralis荧光素酶357位上残基的氨基酸残基的可能的变换，大多数野生型序列在该位置上具有一个酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸)。但这有个例外就是一些类型的Photinus pennsylvanica荧光素酶在相对应位置上(355)的残基是非极性残基缬氨酸，或者一些类型的Phrixothrix荧光素酶，在PvGR中或在PhRE中对应位置上为V354，而此位置上一般为L354。因此一般而言，在这个位置上作为替代氨基酸的氨基酸不是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
因此，在大多数情况下一个酸性氨基酸残基被一个非酸性残基所取代，所述非酸性残基包括碱性氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸；非极性氨基酸，例如亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；不带电荷的极性氨基酸，例如酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸或苏氨酸。详细地讲，它可以被一个不带电荷的极性氨基酸(例如酪氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸)取代。在这个位置上用于取代的特别优选氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，最优选为酪氨酸。一般而言，在这个位置上的芳香族氨基酸会产生最大的移动并也可以增加热稳定性。
如果野生型序列在这个位置上包括非酸性氨基酸残基，它们适合于突变成不同的非酸性残基。
已经发现，以这种方法使酶突变，由荧光素酶发射的光的波长会发生移动，在有些情况下，向光谱的红端移动多至50nm。因此，与野生型荧光素酶发射光的波长为562nm相比，D357Y突变型Photinuspyralis荧光素酶发射光的波长为大约612nm。
由于50nm这个幅度的波长移动在光谱上可以很容易地确定，因此50nm的波长移动对用于检测应用具有重要的潜力。不同颜色的荧光素酶可以在基因表达研究中用作报道分子，使得能够同时监测一个以上的基因，例如在WO 95/18853中所描述的。也可以利用荧光素酶作为标记，进行多种分析物的检测。
在这种情况下发出的光是深红色，这一事实对于检测方法学是特别有用的。当分析含有色素或可以吸收较短波长光的其他化合物的溶液中的ATP时，红色突变体会很有用的。例如，红色的溶液就不会吸收红光。常常成为这种分析的研究对象的红色溶液的例子包括血液样品或者可能含有红色pH指示剂的真核细胞培养液。
当使用比色剂(colourimetric agent)例如荧光素酶的混合物时，产生深红色信号的能力会是有用的，特别是当样品中的另外一种比色剂产生绿色信号时。可以设置在光电阴极光谱分析中使用的光电倍增管，以检测单一样品中产生的一个或两个峰。换句话说，有可能分辨同一个样品中红光发射体和绿光发射体的光子通量。
另外，发现辅因子辅酶A(CoA)的存在可以影响波长移动。这一特性使得有可能将这种酶可以用于该辅因子的测定中。
如下面所述的，研究了辅因子辅酶A对体外光射光光谱的影响。随着辅酶A浓度的增加，光谱分布变化，在CoA的最高浓度下，光谱中波长主要在590-630nm区域内，在610nm处有一个明显峰。
因此，按照本发明的另一方面，提供了一种判定样品中存在CoA的检测方法，这种检测包括在怀疑含有CoA的样品中加入上面所述的荧光素酶和引发荧光素酶/荧光素反应所需的其他试剂，然后测量从样品中发出光的波长，并将它与存在CoA或缺乏CoA联系起来。
这种检测对于判定细胞(例如微生物或真核细胞)的生长状态或细胞活性是有用的。
例如，在大肠杆菌细胞中CoA的浓度是相当高的，并且随代谢状态明显变化。本发明的突变型酶可以用于监测一种生物的代谢状态，特别是CoA的体内浓度，因为发射波长的变化取决于CoA的浓度。这种检测在抗生素生产(例如在链霉菌中)中CoA作为重要初级代谢物的情况下特别有用。细胞CoA浓度也是脂肪酸生物合成的一个重要指标，并且它随细胞的饥饿状态而变化。许多代谢性疾病，例如癌发生和糖尿病，显示出脂肪酸代谢物的异常和随之发生的异常CoA水平。本发明的检测可以用于诊断这些疾病。例如，通过测量用于检测中的本发明荧光素酶所发出光的波长，可以确定来自患者的细胞样品例如血液样品的CoA水平。可以将这个结果与从健康细胞获得的结果相比较，来确定波长是否发生变化以及从而确定是否出现CoA水平的改变。这可能诊断患者的疾病状态。在检测前宜使用一种已知裂解剂，将细胞裂解。
相信在357位上的氨基酸残基与辅酶A的结合位点严格相关。当显示荧光素酶表面轮廓达到1埃()的分辩率时(利用SYBL蛋白质建模软件，Tripos Ltd.)，注意到有一个小的极性口袋。这个口袋看来由H310、E354和D357残基连接，测量它的大小在8-10之间。当从分子的顶部观察时，呈现出这个口袋是由H310、E354、D357和I232残基所连接的更大口袋的一部分。H310和E354残基形成一个桥健交叉于呈现两个更小的口袋的裂缝上(见图8)。
虽然不希望受理论的约束，但似乎有可能是，当该酶在溶液中提供一个允许CoA结合的更大的口袋(～12深，～8宽)时，桥连残基会具有足够柔性而松脱。这与能量计算相一致。
当表达本发明的萤火虫荧光素酶突变体的大肠杆菌在不同的碳源中生长时，观察到体内发射光光谱变化，当从丰富培养基(LB)转移到带有乙酸或葡萄糖作为唯一碳源的合成基本培养基，会导致发出的光移动到更长的波长，而来自更短波长的贡献减少。这也提供了用于检测目的的控制发射光的波长的另一个方法。
已经发现该蛋白质357位上的突变导致增强热稳定性。
所述蛋白质在序列上可以含有其他突变，只要所述蛋白质的荧光素酶活性没有受到过度损害。所述突变适合于增强酶的特性，或以某种方式使它更适合于预定目的。这可能意味着，它们导致增强热稳定性和/或增强色位移特性和/或酶对于ATP的Km值。导致色位移的突变的例子在WO95/18853中有描述。影响Km值的突变例如在WO96/22376和申请号为PCT/GB98/01026的国际专利申请中有描述。
总而言之，已经发现突变的作用在所述特性变化方面是加成的。
本发明的所述突变型荧光素酶包括与野生型荧光素酶相比热稳定性增强的其他特定突变。详细来讲，
(a)对应于Photinus pyralis荧光素酶354位(Luciola荧光素酶356位)上氨基酸的氨基酸残基是突变的；
(b)对应于Photinus pyralis荧光素酶215位或(Luciola荧光素酶217位)上的氨基酸残基是一个不同的疏水性氨基酸；或者
(c)对应于Photinus pyralis荧光素酶214位残基或对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶216位残基的氨基酸残基；
(d)对应于Photinus pyralis荧光素酶232位残基或对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶234位残基的氨基酸残基；
(e)对应于Photinus pyralis荧光素酶295位残基或对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶297位残基的氨基酸残基；
(f)对应于Photinus pyralis荧光素酶14位氨基酸或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶16位氨基酸或者对应于Luciola cruciata荧光素酶或Luciola lateralis荧光素酶17位氨基酸的氨基酸残基；
(g)对应于Photinus pyralis荧光素酶35位氨基酸或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶37位氨基酸或者对应于Luciola cruciata荧光素酶或Luciola lateralis荧光素酶38位氨基酸的氨基酸残基；
(h)对应于Photinus pyralis荧光素酶105位氨基酸残基或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶106位残基或者对应于Luciolacruciata荧光素酶或Luciola lateralis荧光素酶107位残基或者Luciolalateralis荧光素酶基因108位残基的氨基酸残基；
(i)对应于Photinus pyralis荧光素酶234位氨基酸残基或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶236位残基的氨基酸残基；
(j)对应于Photinus pyralis荧光素酶420位氨基酸残基或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶422位残基的氨基酸残基；
(k)对应于Photinus pyralis荧光素酶310位氨基酸残基或者对应于Luciola mingrelica荧光素酶、Luciola cruciata荧光素酶或Luciolalateralis荧光素酶312位残基的氨基酸残基；至少上述其中之一是与对应野生型序列中出现的氨基酸不同的，并且其中与在这个位置上具有对应野生型荧光素酶氨基酸的酶相比所述荧光素酶增强了热稳定性。
因此，本发明蛋白质的优选实施例是突变的野生型荧光素酶，其中不止1个氨基酸、例如高达100个氨基酸残基、优选为不超过40个氨基酸、更优选为最多30个氨基酸与适宜野生型酶对应位置的氨基酸不同。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的所述蛋白质包括Photinus pyralis荧光素酶，其中除了如上面所述357位上的突变外，至少还包括下列其中之一；
(a)对应于Photinus pyralis荧光素酶354位氨基酸的氨基酸残基不是谷氨酸；
(b)对应于Photinus pyralis荧光素酶215位的氨基酸残基是一个除丙氨酸以外的疏水性氨基酸；
(c)对应于Photinus pyralis荧光素酶214位残基的氨基酸残基不是苏氨酸；
(d)对应于Photinus pyralis荧光素酶232位残基的氨基酸残基不是异亮氨酸；
(e)对应于Photinus pyralis荧光素酶295位残基的氨基酸残基不是苯丙氨酸；
(f)对应于Photinus pyralis荧光素酶14位氨基酸的氨基酸残基不是苯丙氨酸；
(g)对应于Photinus pyralis荧光素酶35位氨基酸的氨基酸残基不是亮氨酸；
(h)对应于Photinus pyralis荧光素酶105位氨基酸残基的氨基酸残基不是丙氨酸；
(i)对应于Photinus pyralis荧光素酶234位氨基酸残基的氨基酸残基不是天冬氨酸；
(j)对应于Photinus pyralis荧光素酶420位氨基酸残基的氨基酸残基不是丝氨酸；
(k)对应于Photinus pyralis荧光素酶310位氨基酸残基的氨基酸残基不是组氨酸。
另一方面，本发明的所述蛋白质包括具有Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis酶的荧光素酶序列的蛋白质，并且其中除了如上面所述359位上的突变外，至少还包括下列其中之一：
(a)对应于Photinus pyralis荧光素酶356位氨基酸的氨基酸残基不是谷氨酸；
(b)对应于Photinus pyralis荧光素酶215位的氨基酸残基或是一个除丙氨酸以外的疏水性氨基酸或是苏氨酸；
(c)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶216位残基的氨基酸残基不是甘氨酸(对基于Luciolamingrelica的序列而言)或不是天冬酰胺(对基于Luciola cruciata或Luciola lateralis的序列而言)；
(d)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶234位残基的氨基酸残基不是丝氨酸；
(e)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶297位残基的氨基酸残基不是亮氨酸；
(f)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶16位氨基酸的氨基酸残基不是苯丙氨酸；
(g)对应于Luciola mingrelica荧光素酶37位残基的氨基酸残基或Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶38位的氨基酸残基不是赖氨酸；
(h)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶106位氨基酸残基的氨基酸残基不是甘氨酸；
(i)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶236位氨基酸残基的氨基酸残基不是甘氨酸；
(j)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶422位残基的氨基酸残基不是苏氨酸；
(k)对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis荧光素酶312位氨基酸残基的氨基酸残基不是苏氨酸(对基于Luciola mingrelica的序列而言)或不是缬氨酸(对基于Luciola cruciata或Luciola lateralis的序列而言)。
在任何情况下导致增强热稳定性的具体取代的氨基酸都可以通过下文中举例说明的常规方法来确定。在每一种情况下，不同的取代都可能导致热稳定性增强。正如专业人员所明白的，可以通过对编码天然蛋白质或适宜的突变型蛋白的DNA进行定点诱变，来实现取代。在这种情况下，本发明涉及鉴定热稳定性相关位点。
但是一般而言，可能最好是考虑用具有不同特性的氨基酸取代野生型氨基酸。因此，在某些情况下，亲水性氨基酸残基可以优选被疏水性氨基酸残基所取代，反之亦然。同样，酸性氨基酸残基可以被碱性残基所取代。
例如，所述蛋白质可以包括具有荧光素酶活性并与来自Photinuspyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis酶的荧光素酶具有至少60％的相似性的蛋白质，其中在所述酶的序列中，至少有下列其中之一：
(a)对应于Photinus pyralis荧光素酶214位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶216位上残基的氨基酸残基是突变的，而且在Photinus pyralis荧光素酶的情况下它不是苏氨酸；或
(b)对应于Photinus pyralis荧光素酶232位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶234位上残基的氨基酸残基是突变的，而且在Photinus pyralis荧光素酶的情况下它不是异亮氨酸；或
(c)对应于Photinus pyralis荧光素酶295位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶297位上残基的氨基酸残基是突变的，例如在Photinus pyralis荧光素酶的情况下它不是苯丙氨酸；而且与野生型荧光素酶相比，所述荧光素酶的热稳定性增强。
所有这些不同的荧光素酶的序列显示出它们是高度保守的，在它们之间具有显著的相似性。这就意味着通过检查序列以检测最相似区域，可以很容易地确定所述酶序列中的相对应区域，然而必要时，为了确定不同序列间的相对应区域或特定氨基酸，可以利用市售的软件(例如：来自Wisconsin大学遗传计算机小组的“Bestfit”软件；参见Devereux等(1984)Nucleic Acid Research 12：387-395)。可选择地或补充地，通过参考L.Ye等Biochim.Biophys Acta 1339(1997)39-52发表的论文，来确定对应的氨基酸。
关于对应于Photinus Pyralis荧光素酶214位上残基的氨基酸残基有可能变换，极性氨基酸苏氨酸适合于被一个非极性氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸所取代。对于对应Photinus Pyralis荧光素酶214位上残基的苏氨酸特别优选的取代是丙氨酸。更优选的取代是半胱氨酸。然而，在这个位置上不同的极性残基例如天冬酰胺也同样可以增强在这个位置上具有苏氨酸的对应酶的热稳定性。在野生型荧光素酶这个位置上出现的其他氨基酸包括甘氨酸(Luciola mingrelica、Hotaria paroula)、天冬酰胺(Pyrophorus plagiophthalamus GR、YG、YE和OR、Luciola cruciata、Luciola lateralis、欧洲萤、Pyrocelia nayakoPhotinus pennsylvanica LY、KW、J19)和丝氨酸(Phrixothix)。这些可能最好被非极性或不同的非极性侧链例如丙氨酸和半胱氨酸所取代。
就对应Photinus pyralis荧光素酶232位上残基的氨基酸残基的可能变化来说，非极性氨基酸异亮氨酸适合于被一个不同的非极性氨基酸所取代，例如被丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸所取代。出现于野生型序列中这个位置上的其他氨基酸包括丝氨酸和天冬酰胺。这些极性氨基酸适宜被前面那些列出的非极性残基所取代。对应于Photinus pyralis荧光素酶232位上残基和Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis一组荧光素酶234位上残基的氨基酸残基特别优选的取代物是丙氨酸。
改变对应于Photinus pyralis荧光素酶295位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶297位上残基的氨基酸残基，也可以对该蛋白质的热稳定性产生作用。(这对应于Phrixothix荧光素酶292位上的残基)。一般而言，在这个位置上的氨基酸是非极性氨基酸苯丙氨酸或亮氨酸。这些氨基酸适合于被不同的非极性氨基酸取代。例如，在Photinus pyralis荧光素酶中，非极性氨基酸苯丙氨酸适合于被一个不同的非极性氨基酸取代，如被丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸取代。对应于Photinus pyralis荧光素酶214位上残基的苯丙氨酸残基特别优选的取代物是亮氨酸。
对应于Photinus pyralis荧光素酶14位上氨基酸或Luciola荧光素酶16位上氨基酸(Phrixothrix荧光素酶13位上的氨基酸)的氨基酸残基的突变也是可能的。这个氨基酸残基(通常为苯丙氨酸、但也有可能是亮氨酸、丝氨酸、精氨酸或者在某些情况下为酪氨酸)适合于改变为一个不同的氨基酸，尤其是一个不同的非极性氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，优选为丙氨酸。
对应于Photinus pyralis荧光素酶35位上氨基酸或Luciolamingrelica荧光素酶37位上氨基酸(在其他Luciola spp。38位上的氨基酸)的氨基酸残基的突变也可能是有效的。在野生型酶中的这个位置上的氨基酸是变化的，它可以包括亮氨酸(Photinus pyralis)，也包括赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。在这个位置上的氨基酸残基适合于被一个非极性氨基酸残基或一个不同的非极性氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或色氨酸所取代。在这个位置上优选的氨基酸是丙氨酸，这里是不同于野生型酶的。
对应于Photinus pyralis序列14位上氨基酸的突变和/或对应于Photinus pyralis荧光素酶35位上氨基酸的氨基酸残基的突变，在所述酶中最好不是仅有的突变。它们适合于与上面详细说明的其他突变同时发生，尤其是那些对应于Photinus pyralis荧光素酶214、395或232位上的突变。
改变对应于Photinus pyralis荧光素酶105位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶106位上残基(Phrixothrix荧光素酶102位上的残基)的氨基酸残基，也可以影响所述蛋白质的热稳定性。一般而言，在这个位置上的氨基酸是一个非极性氨基酸丙氨酸或甘氨酸，或者在Phrixothrix荧光素酶中是一个丝氨酸。它们适合于被不同的非极性氨基酸取代。例如，在Photinus pyralis荧光素酶中，非极性氨基酸丙氨酸适合于被一个不同的非极性氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或色氨酸所取代。对应于Photinus pyralis荧光素酶105位上残基的丙氨酸残基的尤其优选的取代物是缬氨酸。
改变对应于Photinus pyralis荧光素酶234位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶236位上残基(Phrixothrix荧光素酶231位上的残基)的氨基酸残基，也可以影响所述蛋白质的热稳定性。一般而言，在这个位置上的氨基酸是天冬氨酸或甘氨酸，在某些情况下，是谷氨酰胺或苏氨酸。这些氨基酸适合于被适当的非极性氨基酸或不同的非极性氨基酸所取代。例如，在Photinuspyralis荧光素酶中，该氨基酸残基是天冬氨酸，适合于被一个非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或色氨酸所取代。对应于Photinus pyralis荧光素酶234位上残基的苯丙氨酸残基的尤其优选的取代物是甘氨酸。当在这个位置上出现一个非极性氨基酸如甘氨酸时(例如在Luciola荧光素酶中)，它可以被一个不同的非极性氨基酸所取代。
改变对应于Photinus pyralis荧光素酶420位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶422位上残基(Phrixothrix绿色荧光素酶417位上和Phrixothrix红色荧光素酶418位上的残基)的氨基酸残基，也可以影响所述蛋白质的热稳定性。一般而言，在这个位置上的氨基酸是一个不带电荷的极性氨基酸丝氨酸或苏氨酸或甘氨酸。这些氨基酸适合于被一个不同的不带电荷极性氨基酸所取代。例如，在Photinus pyralis荧光素酶中，该丝氨酸可以被天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸或酪氨酸所取代，尤其是为苏氨酸所取代。
改变对应于Photinus pyralis荧光素酶310位上残基和Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶312位上残基的氨基酸残基，也可以影响所述蛋白质的热稳定性。在已知的荧光素酶蛋白中这个位置上的氨基酸残基是变化的，在Photinus pyralis荧光素酶、Pyrocelia nayako荧光素酶、欧洲萤荧光素酶和某些型的Photinuspennsylanvanica荧光素酶中它是组氨酸，在Luciola mingrelica荧光素酶、Hotaria paroula荧光素酶和Phrixothix荧光素酶(在307位上的氨基酸)中它是苏氨酸，在Luciola cruciata和Luciola lateralis中它是缬氨酸，在某些Pyrophorus plagiophthalamus荧光素酶中它是天冬酰胺。因此，总的来说，在这个位置上的氨基酸是亲水性氨基酸，它们可以被不同的氨基酸残基取代，从而增强该酶的热稳定性。对应于Photinuspyralis荧光素酶310位上残基的组氨酸残基的尤其优选的取代物是精氨酸。
在所述酶中也可能出现其他突变。例如，在一个优选的实施方案中，所述蛋白质在对应于Photinus pyralis荧光素酶354位上氨基酸(在Luciola荧光素酶中为356位上)的氨基酸，也从谷氨酸改变，尤其是变为除甘氨酸、脯氨酸或天冬氨酸以外的氨基酸。在这个位置上的氨基酸适宜是色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺，但最优选是赖氨酸或精氨酸。这个突变在WO 95/25798中有描述。已经发现在这个位置上疏水性残基增强所述酶的波长移动，此外，在354位上出现一个大的疏水性氨基酸(V或I)、极性氨基酸(N)或带正电荷的氨基酸(K或R)增强热稳定性。
在另一个优选的实施方案中，如EP-A-052448中所述，该蛋白质在对应于Luciola荧光素酶中217位(在Photinus pyralis荧光素酶中为356位)上氨基酸的氨基酸，也变为一个疏水性氨基酸，尤其是异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
本发明的蛋白质包括野生型荧光素酶和重组型荧光素酶。从出现在野生型酶中至少60％的氨基酸出现在本发明的蛋白质中的意义上来说，它们与诸如Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis酶的野生型序列具有至少60％的相似性。这些蛋白质可以与上面列出的野生型酶具有更大程度的相似性，尤其是至少70％，优选为至少80％，最优选为至少90％。这种类型的相似蛋白质包括等位基团变异体、来自其他昆虫物种的蛋白质以及重组产生的酶。可以很容易地鉴定它们，因为它们由在严格杂交条件下与编码野生型酶的序列杂交的核酸所编码。这些条件应该为本领域技术人员所熟知，这些条件例如在Sambrook等(1989)分子克隆，Cold Spring HarborLaboratory Press)中有举例说明。概括的说，低严格性条件可以定义为在环境温度至大约65℃下3×SSC，而高严格性条件可以被定义为在大约65℃下0.1×SSC。SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠的缩写。3×SSC就是3倍浓度的SSC，依此类推。
详细地讲，一个特定序列与本发明序列的相似性可以利用Lipman和Pearson描述的多重比对方法(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches，Science，第227卷，第1435-1441页)来评价。“优化的”百分比分值应该利用Lipman-Pearson算法的下列参数来计算：ktup＝1、gap penalty＝4和gap penaltylength＝12。待评价相似性的序列应该被用作“检测序列”，这就表明用于比较的碱基序列，如Photinus pyralis的序列或在Ye等(参见上文)中记录的其他序列中的任何一个序列应该首先输入到算法中。
本发明蛋白质的具体实施例是具有一个或多个上述突变的野生型荧光素酶序列。
本发明还提供了编码上面所述荧光素酶的核酸。所述核酸宜基于本领域所熟知的野生型序列。根据有关遗传密码的知识，实现所述氨基酸序列的所需突变的适宜突变是显而易见的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述核酸是一个合成基因。适宜地对所述合成基因进行工程改造，以从得自普通表达宿主如大肠杆菌中的高表达基因中去除罕见的密码子，同时，避免引入在编码甲虫荧光素酶的基因中罕见的密码子。这种方法保证该新基因具有最适合于大肠杆菌和昆虫两种表达系统的密码子选择。
例如，可能时，将氨基酸arg、leu、ile、gly和pro的密码子更换为CGT或CGC(arg)；CTG、CTT或CTC(leu)；ATC或ATT(ile)；GGT或GGC(gly)和CCG、CCA或CCT(pro)，从而清除稀有密码子。就下面(SEQ ID NO 1)和图14中说明的合成基因而论，这导致总共139个沉默突变，产生62个新的非稀有密码子(占全部的11％)。在图14中显示的前8个核苷酸构成核糖体结合位点的一部分，因此未编码。编码序列由用向上箭头指示的甲硫氨酸残基开始。这个编码序列和非常相似的序列，例如具有至少90％相似性或优选至少95％相似性的序列，构成了本发明一个优选的方面。
当构建一个合成组件(assembly)时可以应用的另一个有用特性，是插入新的单一限制性位点。这些位点使得基因的诱变尤其是组合盒式诱变更为简化和更为有效。详细地说，可能最好在编码该酶B亚结构域的cDNA内产生单一限制性位点。另外，在基因的3’最末端构建一个可以用于简单融合和/或除去过氧化物酶体靶向序列的单一限制性位点可能是有利的。
在下文中举例说明的实施例中，工程改造了9个新的单一限制性位点，大部分位于该基因中部的三分之一内，在该基因的3’最末端产生了一个允许简单的C-末端融合的Hind III单一位点(图12)。
最后，应用一个合成基因，使得可以引入突变，来增强基因产物的热稳定性或另外按照所期望的修饰产物的特性。在下文中说明的实施例中，例如工程改造了3个非沉默突变，来把热稳定性氨基酸改变T214C、E354K和D357F引入到所述多肽中。
本发明的核酸适合于导入到一个表达载体例如一个质粒中，并受控于控制元件例如启动子、增强子、终止子等。然后可以用这些载体转化宿主细胞，例如原核细胞或真核细胞如植物细胞或动物细胞，但尤其是原核细胞如大肠杆菌，使得该细胞表达所需的荧光素酶。利用本领域所熟知的条件培养如此转化的细胞，将导致产生所述荧光素酶，然后可以从培养基中分离所述酶。当这些细胞为植物细胞或动物细胞时，可以从所述细胞繁殖出植物或动物。然后可以从植物中提取所述蛋白质，或者当为转基因动物时，可以从乳中回收所述蛋白质。载体、转化的细胞、转基因植物和转基因动物以及通过培养这些细胞生产酶的方法全部构成本发明的其它方面。
通过下文所述随机突变构建了Photinus pyralis D357Y突变型荧光素酶。已经发现，D357Y单点突变在发射光的波长上产生了一个大的色位移，而且与野生型荧光素酶相比具有更强的热稳定性。另外的研究揭示，在这个位置上许多取代会产生良好的热稳定性和/或大的色位移。
落入本发明范围的Photinus pyralis突变型酶的具体实例包括下列：
D357Y
D357F
D357W
D357K
D357N
D357I
E354I/D357Y
E354V/D357Y
E354C/D357Y
E354R/D357Y
E354S/D357Y
E354N/D357Y
E354K/D357M
E354R/D357L
E354W/D357W
E354H/D357W
E354R/D357F
E354K/D357F
E354S/D357F
E354M/D357F
E354A/D357R
E354A/D357F
E354T/D357Y
E354A/D357N
I351M/E354R/D357V
E354S/D357V
E354R/D357W
E354R/D357M
E354R/D357S
E354N/D357S或是来源于其他物种的这些荧光素酶中任一种的等同物。
将用于构建上述突变体的所述突变通过定点诱变、(PCR)或组合盒式突变，导入到质粒pET23的荧光素酶基因中。加入到PCR反应中用于实现相关突变的寡核苷酸在下面给出。
先前已经报道过，在354位上和215位上点突变的作用是加性的。本发明提供了联合三个或更多这样的突变的可能性，为具有大的色位移的突变型酶提供高的热稳定性。
本发明的荧光素酶蛋白可以有利地应用于任何利用荧光素酶/荧光素反应作为信号指示的生物发光测定。有许多这种检测在文献上发表过。因此所述蛋白质可以包含在为进行这种检测而制备的试剂盒中，所述试剂盒任选地具有荧光素和进行所述特定测定所需要的任何其他试剂。
现在本发明会通过实施例来详细描述，并参考附图，其中：
图1是显示在45℃下温育几种本发明的突变型酶的残留活性％与温育时间关系的对数图；
图2显示通过在含有D-荧光素的柠檬酸缓冲液中培养表达荧光素酶的大肠杆菌细胞所获得的光谱峰，其中所使用的酶是(a)重组野生型Photinus pyralis荧光素酶，(b)D357K突变体，(c)D357N突变体，(d)D357W突变体，(e)D357I突变体，(f)D357F突变体，(g)D357Y突变体和(h)E354I+D357Y双重突变体；
图3是显示三种突变型酶E354I、D357Y和E354I/D357Y双重突变体(DM)的残留活性％与时间关系的图；
图4显示(a)重组野生型酶和(b)E354I/D3357Y双重突变体(DM)的发射光谱；
图5是显示重组野生型酶(◆)r-wt和D357K突变型酶()光子发射衰减率的图；
图6显示分子建模图，它图解了在荧光素酶中一个潜在的CoA结合口袋；
图7显示培养于(a)LB；(b)基本培养基和乙酸钠；(c)基本培养基和葡萄糖中表达P.pyralis荧光素酶D357Y突变体的大肠杆菌细胞所发射的体内生物发光光谱；
图8显示培养于(a)LB；(b)基本培养基和乙酸钠；(c)基本培养基和葡萄糖中表达P.pyralis荧光素酶E354K/D357M突变体的大肠杆菌细胞所发射的体内生物发光光谱；
图9是一幅图，显示CoA对P.pyralis荧光素酶D357Y突变体所发射光光谱分布的影响；
图10是一幅图，显示CoA对P.pyralis荧光素酶D357Y突变体所发射光光谱分布的影响的标准化数据；
图11是一幅图，显示CoA对P.pyralis荧光素酶E354I/D357Y突变体所发射光光谱分布作用(图11a)和标准化数据(图11b)；
图12图解用于构建合成荧光素酶基因的限制性位点修饰；
图13图解用于合成一个荧光素酶基因的构建体；
图14显示了合成荧光素酶基因的cDNA序列(包括构成部分核糖体结合位点但不编码的1-8核苷酸)(SEQ ID NO 1)和从用向上箭头指示的甲硫氨酸残基开始的所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)；和
图15图解包括所述合成基因编码的突变体在内的突变体在50℃下的热稳定性。
实施例1 突变型荧光素酶的鉴定和表征
制备用易错聚合酶链式反应[M.Fromant等，Anal.Biochem.(1995)224，347-353]建立的两个萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶文库。其中一个文库是由克隆到T7表达系统pET23a(Novagen Inc.，Madison，WI，U.S.A.)中的全长luc基因的易错聚合酶链式反应产物组成的。第二个文库是由克隆到pBSK(+)载体(Stratagene，La Jolla，CA，U.S.A.)中包括氨基酸199-352的luc基因短区段的易错聚合酶链式反应产物组成的。
pET23a文库在大肠杆菌BL21(DE3)菌株(大肠杆菌B F dcmompT hsdS(rB -mB -)galλ(DE3))表达。
pBSK(+)文库在HB101大肠杆菌细胞(supE44 ara14 galK2 lacY1
Figure A0081773600261
(gpt-proA)62 rpsL 20(Strr)xyl-5 mtl-1 recA13 (mrcC-mrr)HsdS-(r-m-))中表达。pET23a和pBSK(+)都携带β-内酰胺酶基因，因而赋予带有所述质粒的大肠杆菌细胞氨苄青霉素抗性。
利用BIORAD大肠杆菌脉冲发生器，通过电穿孔用所制备的文库转化大肠杆菌，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上于37℃生长过夜。将细胞转移到尼龙膜上(Osmonics，Minnetonka，Minnesota，U.S.A.)，然后用荧光素溶液(500μM D-荧光素，钾盐，溶于100mM柠檬酸钠缓冲液中，pH 5.0)喷涂。用AlphaImagerTM 1200记录和分析系统(Flowgen，Lichfield，Staffordshire，UK)观察菌落。累积在规定时间内发射的生物发光，从而产生由菌落发出的光的图像。荧光的亮度被看作是荧光素酶热稳定性的一个指标。
然后根据热稳定性对所述菌落进行筛选。根据发射光的亮度选择菌落，然后根据另外的特性分离菌落。在某些筛选中，在筛选前将大肠杆菌菌落在42℃培养2小时，使得热稳定突变体能够被选择出。将从初次筛选中分离的菌落贴片(patch)到尼龙膜上，然后也在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜。用荧光素溶液喷涂该膜片，然后在AlphaImagerTM中观察。第二次的筛选有助于可靠地鉴定用于体外分析荧光素酶活性的菌落。在体外检测表达可能的热稳定性酶的大肠杆菌菌落的荧光素酶活性和热稳定性。
体外荧光素酶活性检测在室温下利用Promega荧光素酶检测系统(Promega Corpartion，Madison，WI，U.S.A.)进行。
通过加入10μl细胞粗提物到100μl Promega荧光素酶检测混合物(1∶2稀释)中启动荧光素酶反应。产生的生物发光利用Biotrace M3发光计来测量。
细胞粗提物是按照Promega technical bulletin no.101所述方法制备的。大肠杆菌过夜培养物的等分样品在细胞培养物裂解试剂(25mMTris磷酸盐pH 7.8，2mM二硫苏糖醇(DTT)，2mM 1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸，10％甘油，1％Triton X-100，1.25mg/ml鸡溶菌酶)中室温裂解10分钟。然后粗裂解液在检测前保存于冰块中。
在时间依赖失活研究中进一步测试所述酶的特性。将装有50μl细胞粗提物等分样品的Eppendorf管在给定温度下于水浴中温育。在设定的时间点取出Eppendorf管并在检测前于冰中冷却。残留荧光素酶活性以原始活性的百分比来表示。
绘制残留活性百分比-温育时间关系的对数图，并用对数图来计算t1/2值。T1/2是所述酶在给定温度温育后丧失50％原始活性所需的时间。T1/2(活性降至50％原始活性的时间)是在37℃粗提物中根据残留活性百分比与时间关系对数图确定的(未显示)。
对上面所确定的来自表达最高热稳定性荧光素酶的大肠杆菌菌落的质粒DNA进行测序，来确定决定所述酶热稳定性的突变。
按照使用微量离心机的方法(QIAprep Miniprep Handbook04/98)，利用QIAGEN QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN Ltd，Crawlay，W.Sussex，UK)制备质粒DNA。
所有的DNA序列测定由Babraham Technix，Cambridge，UK负责，使用ABI PRISMTM 377 DNA测序仪和ABI PRISMTM BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin ElmerApplied Biosystems)，该试剂盒是建立在双脱氧链终止DNA测序方法[F.Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74，(1997)5463-5467]基础上的。
这个工作的结果是鉴定出新型突变体D357Y。
荧光素酶的晶体结构[E.Conti等，Structure，4，(1996)287-298]显示357位位于所述蛋白质的表面，并靠近可能影响热稳定性和光谱特性的354位。这表明，这个区域在所述酶的热稳定性上是重要的。
D357Y是一个热稳定性特别高的突变体，是热稳定性最高的荧光素酶，只有一个单一氨基酸改变。实施例2 构建其他357突变体的定点诱变
为了评估在357位的不同突变，利用Stratagene QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，U.S.A.)进行定点诱变。质粒pPW601a J54(PJW，MoD Report，3/96)被用于所有的定点诱变。将诱变反应的所有产物转化到大肠杆菌XL1-Blue菌株[e14-(mcrA-)
Figure A0081773600281
Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relal lac recBrecJ sbcC umcC∷Tn5(Kanr)uvrC[F’proAB laclqZΔM15 Tn 10(Tetr)Amy Camr]中。寡核苷酸引物由Sigma-Genosys Ltd.，Cambridge，UK合成，是利用智能掺杂系统(intelligent doping system)[A.R Arkin等，Bio-technology，(1992)10，297-300，W，.Huang等，Anal.Biochem.218，454-457]设计的，该系统用于设计简并寡核苷酸引物来产生多组可能的突变，而不是对每一种氨基酸取代使用个别引物。
通过这种方法建立了氨基酸被取代的荧光素酶的文库。
使用下列寡核苷酸(和它们的互补配偶体)：
表1
寡核苷酸引物(5’→3’) 氨基酸取代
cacccgagggggat[tat]aaaccgggcgcgg(SEQ ID NO4) Y
cacccgagggggat[(gac)(tc)(c)]aaaccgggcgcggtcgg(SEQ ID NO 5) A，I，L，T，V，P
cacccgagggggat[(t)(gat)(gc)]aaaccgggcgcggtcgg(SEQ ID NO 6) C，F，L，W，Y，X
cacccgagggggat[(ac)(ga)(gc)]aaaccgggcgcggtcgg(SEQ ID NO 7) R，S，K，N，H，Q
如前所述，根据热稳定性对突变体文库进行筛选。利用以下公式[S.Climie等，J.Biol.Chem.265(1990)18776-18779]计算要筛选的菌落数
N＝[ln(1-P)]/[ln((n-1)/n)]。其中N是要筛选出的菌落数，n是在靶位置上可能的密码子数，P是混合物中的每一个密码子为了筛选而被取样至少一次的概率。计算是建立在P＝0.95基础上的。对从定点诱变中获得的突变体进行荧光素酶活性的测定，并进行在时间依赖热失活研究中进行特征鉴定。
以这种方法鉴定的突变体在含有氨苄青霉素的400ml LB培养基中生长到A260≈0.5。然后加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，来诱导荧光素酶的表达。然后细胞在30℃振荡培养3小时，其后进行离心收获。按照用于Maxi-Scale细菌蛋白质提取的B-PERTM方案，将所产生的细胞沉淀重悬浮于10ml B-PERTM蛋白质提取试剂(Pierce Chemical Company，Rochford，U.S.A.)和1mM DTT中，制成粗提物。为了抑制内源蛋白酶，在B-PERTM溶液中加入500μl重建的Sigma蛋白酶抑制剂混合物(产品号：P8465，Sigma，Saint Louis，Missouri，U.S.A.)。然后细胞裂解液以30000g离心30分钟。
用硫酸铵把粗提物的上清液分级分离。在30％至55％饱和度之间沉淀的部分具有荧光素酶活性。将该材料重悬浮于0.5ml Tris-HCl pH8.0，1mM DTT中，然后用于热失活和光谱研究。
引入取代D357L、D357T、D357V、D357W、D357R、D357I、D357S、D357K、D357N和D357F。对这些突变体在粗提物的体外热失活研究中进行特征鉴定。
部分纯化的提取物以1∶11稀释到热失活缓冲液(含有10％饱和度硫酸铵的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.8、1mM二硫苏糖醇和0.2％BSA)中。
在设定的时间段内将110μl蛋白质溶液等分样品于40℃或45℃下温育，检测前于冰上冷却。然后如实施例1中所述，用Promega荧光素酶检测试剂(1∶2稀释)测量荧光素酶活性。
结果显示于表2、表3和图1中。在40℃(表2)和45℃(表3)下在粗提物中测定T1/2值。
      表2                        表3
突变体  T1/2
D357K  2.2
D357R  4.2
D357S  4.6
D357N  4.8
D357V  5.9
D357T  7.3
D357L  11.3
D357I  18.0
rWT ＜1.0
 突变体  T1/2
 D357W  2.5
 D357F  6.5
 D357Y  10.4
 RWT  ＜1.0
与重组野生型相比，所有所述取代物都显示出热稳定性增强了。实施例3 发射光的波长变化
同样发现在357位上的氨基酸取代可以影响所述酶体内发射光光谱。将如实施例2中所述的大肠杆菌细胞培养物的一个等分样品(250μl)在37℃生长过夜，然后在微量离心机中离心并除去上清液。将表达不同突变型荧光素酶的细胞培养于含有150μl D-荧光素的柠檬酸缓冲液(pH 5.0)中，通过利用SPECTRAmax小平板荧光分光光度计(MolecularDevices Corp.California，U.S.A.)测量发射光谱，来分析体内反应所发出的光。发现突变体D357Y、D357F和D357I(图2(a)-(g))的光谱峰和波长分布有大的变化。这些结果在下面的表4中进行了总结。
另外，在暗室中通过肉眼来评价突变体的体内发光。D357突变体在它们的发光光谱上显示出各种各样的颜色。详细来说，D357Y、D357F和D357I显示出发射光明显向更长的波长方向的移动。
在某些情况下(例如D357F)，发射光颜色的变化看来是由于λmax的移动和与不同波长可见光对光谱的贡献不同这两个原因所致。
               表4
 突变体  λmax(nm) 与rWT的偏差(nm)
 rWT  558 -
 D357K  556 -2
 D357N  558 0
 D357W  558 0
 D357I  606 +48
 D357F  611 +53
 D357Y  613 +55
重组野生型(r-wt)酶用作某些357突变体体内发射光λmax的对比。D357Y、D357F和D357I显示出其最大波长有相当大的移动。实施例4 存在或缺少CoA情况下酶的特性
如实施例1中所述，通过硫酸铵沉淀，部分纯化突变体D357Y。将这种部分纯化的D357Y酶(5μl)与150μl Promega荧光素酶检测试剂混合。将另一等分样品与缺少CoA的等同检测缓冲液(25mM TrisTricine pH 7.8，5.0mM MgSO4，0.1mM EDTA，2mM DTT，470μM-D-荧光素，530μM ATP)混合。测量所述两个反应的发射光谱并显示于图9和图10中。
该光谱显示了在缺少和存在CoA情况下生物发光发射明显不同，即λmax有显著的移动。CoA对荧光素酶反应动力学的影响也可以通过RLU范围(RLU-相对光单位)的差异来观察到。
这种在发射上的差异产生了把所述酶应用于检测CoA存在的测定中的可能性。实施例5 双重突变体的制备和特性
如实施利2中所述应用定点诱变，对E354I+D357Y双重突变体进行工程改造，以研究对于热稳定性和发射光颜色的任何累积作用。
将部分纯化的双重突变体E354I+D357Y以1∶11稀释到热失活缓冲液(含有10％饱和度硫酸铵的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.8、1mM二硫苏糖醇和0.2％BSA)中。
在设定的时间段内将110μl蛋白质溶液等分样品于45℃下保温，检测前于冰上冷却。然后如前所述，用Promega荧光素酶检测试剂(1∶2稀释)测量荧光素酶活性。
所述双重突变体与单突变体E354I和单突变体D357Y分别相比在热稳定性上表现出明显的增强(见图3)。部分纯化双重突变体的热失活研究证实所述突变体热稳定性增强，在45℃下失活时t1/2值为7.7分钟。
注意到所述双重突变体比单突变体E354I和D357Y呈现出更深的红色发光，显示出发光颜色的相加性。
利用实施例3所述的检测缓冲液，也测量了重组野生型和双重突变体E354I+D357Y粗提物的发射光谱。
体内测量发射光谱的λmax为611nm。无论如何，所述光谱中来自波长红区的荧光更多，这就导致当通过肉眼观察时呈现出更深的红色。与rWT相比，粗提物的发射光谱表现出光谱形状的明显变化和44nm的波长移动(见图4)。
所述双重突变体的体内发射光谱显示出发射光峰波长(613nm)带宽变尖，并且来自光波长在540nm-560nm区域的光减少。
这些突变的明显作用表明所述酶的这个区域对于生物发光颜色的重要性。实施例6 光子通量的增加
发现表达D357K突变体的大肠杆菌细胞的体内生物发光相对于这个位置上其他突变体的体内生物发光而言非常亮。利用可以测量一定时间内光子发射率的发光计来分析这个酶的闪光动力学。将含有重组野生型酶或所述D357突变体的大肠杆菌无细胞提取物等分样品加入到荧光素酶检测混合物中，该混合物不含任何能够促进荧光动力学的试剂(如辅酶A)。在一定时间内(15s)测量两种酶的光子发射衰减率，发现突变体D357K的衰减率明显放慢了(图4)。换句话说，与重组野生型酶相比，所述突变型酶的反应动力学至少在反应开始的15秒内受抑制的程度更低。实施例7 在E354和D357位的组合盒式诱变 步骤1 用于盒式诱变的pPW601aJ54工程质粒
用两对合成的寡核苷酸(见下面)，将两个新的单一限制性位点导入质粒pPW601a/J54的luc基因中。总共6个沉默突变在该基因中导入了一个SpeI和一个KpnI限制性位点，这两个位点间隔63个碱基对。含有这些新位点的质粒被称为pPW601aJ54SpeI/KpnI。这些限制性位点的出现和邻近使得有可能利用组合盒式诱变来研究萤火虫荧光素酶原始序列中氨基酸位置354和357上随机取代的作用。SpeI(a)5′-gggctcactgagact gctattatgattacacccg-3′ nt1021-nt1060(SEQ ID NO 8)SpeI(b)5′-cgggtgtaatcagaatagc agtctcagtgagccc-3′(SEQ ID NO 9)KpnI(a)5′-ggcgcggtcggtaaagt attttttgaagcg-3′nt1078- nt1113    (SEQID NO 10)KpnI(b)5′-cgcttcaaaaaat
Figure A0081773600344
actttaccgaccgcgcc-3′(SEQ ID NO 11)
用粗体突出的核苷酸构成核酸内切酶的识别位点，大写的那些核苷酸是构建所述位点所必需的点突变位置。步骤2 盒的设计和文库构建
合成了一对合成寡核苷酸，所述寡核苷酸当退火时构建了一个双链盒，该盒能够直接连接到在所述新限制性位点上消化的pPW601aJ54SpeI/KpnI质粒中。所述盒设计用以在原始序列354位和357位上导入20种天然存在氨基酸的所有可能组合。Looplib2A                                                    5′-ctagtgctattctgattacacccNNG/CggggatNNG/Caaaccgggcgcggtcggtaaagtggta-3′         (SEQ ID NO 12)Looplib2B                                                    5′-cactttaccgaccgcgcccggtttG/CNNatccccG/CNNgggtgtaatcagaatagca-3′(SEQ ID NO 13)
将2μg每一种环文库(loop library)寡核苷酸混合到含有50mMTris-HCl pH 7.4，25mM NaCl的缓冲液中，然后加热到100℃保持3分钟。然后在加热块中将这个溶液缓慢冷却到＜50℃，以使互补序列退火。然后将退火的寡核苷酸连接到已经用SpeI和KpnI消化过的pPW601aJ54SpeI/KpnI质粒中。然后利用电穿孔方法，用连接反应产物的等分样品转化大肠杆菌HB101细胞。电穿孔后将转化细胞铺到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37℃生长过夜。第二天从该平板上随机挑取869个菌落，用来接种96方孔板(Beckman)内含有氨苄青霉素的1ml LB中。覆盖该96孔板，然后将所述细胞在37℃振荡生长过夜。步骤3 随机选择菌落的体内筛选
第二日早晨，将稳定期过夜培养物的50μl等分样品转移到两个透明塑料圆底96孔微量滴定板(Dynex)上。其中一块板被覆盖并在烘箱中温育8分钟(加热块表面温度45℃)，而另一块板保持于37℃。室温下，在各孔中加入50μl含有0.5mM D-荧光素的100mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.0，然后将该板转移到一个摄像机图像捕获系统(Alpha Imager)中，检测和记录来自所述两个板的细胞的体内荧光素酶活性。累积加热的培养物和对照培养在1分钟或2分种内发出的光，然后将该图像纪录到热敏纸薄膜上。
挑选出通过纪录到薄膜上图像的亮度所测定的呈现最多生物发光的79个培养物进行第二轮的筛选。这一次所述培养物在检测之前要在加热块中温育16分钟。在由体内热稳定性筛选中选择的55个克隆中，挑选25个进行体内光谱分析。这些克隆在LB中37℃生长过夜，第二日早晨取200μl过夜培养物进行离心，然后将大肠杆菌细胞沉淀重悬浮于150μl含有0.5mM D-荧光素的100mM柠檬酸缓冲液pH 5.0中。然后将重悬浮的细胞置于一块白色的塑料微量滴定板上，利用Molecular Devices Spectramax 96孔板荧光计，分析每种所述突变型荧光素酶发出的体内生物发光发射光谱。结果总结于以下表1中。步骤4 突变的鉴定
从通过体内筛选选择的25个克隆中制备质粒DNA，然后用基因特异性测序引物进行测序。鉴定了导致原始序列中354位和357位上氨基酸变换的突变。其中一个突变体还包括一个导致I351位上氨基酸取代的额外突变(表5)。表5 突变型酶        突变         峰波长(nm)1         E354V/D357Y          6142         E354I/D357Y          6123         E354C/D357Y          6124         E354R/D357Y          6005         E354S/D357Y          6126         E354N/D357Y          6087         E354K/D357M          556，6068         E354R/D357L          5889         E354W/D357W          61010        E354H/D357W          60611        E354R/D357F          59612        E354K/D357F          608突变型酶      突变         峰波长(nm)13      E354S/D357F          61014      E354M/D357F          61015      E354A/D357R          55616      E354A/D357F          61017      E354T/D357Y          61218      E354A/D357N          56019      I351M/E354R/D357V    60620      E354S/D357V          556，60821      E354R/D357W          60022      E354R/D357M          59623      E354R/D357S          59224      E354N/D357S          600rWT     E354/D357            552
其中rWT表示重组野生型。
从有关热稳定性的体内检测中选择一些突变型荧光素酶。这些荧光素酶中的大多数同样在发射光体内光谱上显示出大的变化，许多显示出来自更长波长(＞580nm)的光更多。一些光谱同样显示出在610-614nm单峰周围的带宽明显变窄。
E354和D357分别被一个疏水氨基酸和一个芳香族氨基酸所取代如E354V、D357Y导致体内光谱最大的变化，它显示出在612nm附近具有一个窄带宽的单峰。实施例8 有关热稳定性的体外筛选
通过裂解制备所选择克隆的无细胞提取物，并在热失活实验中测定每一提取物中荧光素酶的热稳定性。将50μl每一种提取物加入到一个eppendorf管中，然后在加热至45℃的水浴中分别温育4分钟、9分钟和16分钟。在所述适当时间点取出等分样品，并测量残留荧光素酶活性。表6显示了全部突变型酶以及重组野生型荧光素酶残留活性百分比与时间的关系。
表6
酶编号(参见表5)     在45℃温育后残留活性百分比0分钟                     4分钟                     9分钟                    16分钟
 1  100  95  87  75.4
 2  100  99  84.7  67.7
 3  100  92  73  53.3
 4  100  94  89  71.4
 5  100  85  72.2  53
 6  100  93  84.8  71
 7  100  63.7  31  11.7
 8  100  58.6  19  4.9
 9  100  85.4  65.3  42.3
 10  100  65.5  27.8  10.6
 11  100  88.6  70  54
 12  100  90  69  52
 13  100  83  60.5  39
 14  100  80  61  39
 15  100  1.7  0.1  nd
 16  100  90  76  63
 17  100  91  78  60
 18  100  19  1.8  nd
 19  100  17  1.4  nd
 20  100  17  1.1  nd
 21  100  71  63  34
 22  100  80  40  21
 23  100  29  4  0.6
 24  100  28  4  0.4
 25(D357K)  100  0.1  nd  nd
 rWT  100  0.05  nd  nd
其中“nd”表明未测量。
结果表明，大多数热稳定荧光素酶是那些在357位具有一个芳香族氨基酸(Y、F或W和在354位具有一个大的疏水性氨基酸(V或I)、一个极性氨基酸(N)或一个带有正电荷的氨基酸(K或R)的酶。实施例9 生长条件对于发射光体内光谱的作用
研究了不同碳源对于表达D357Y或E354K+D357M(上面的7号酶)突变型荧光素酶的大肠杆菌BL21(DE3)细胞发射光谱的影响。
50ml的细胞培养物在LB培养基中生长到对数中期后，通过离心收获。把所述细胞沉淀重悬浮于1ml无菌蒸馏水中，然后用这个悬浮液的100μl等分样品分别接种25ml无菌培养管中的5ml新鲜LB培养基、M9基本培养基+2mM乙酸钠或M9基本培养基+2mM葡萄糖。让这些培养物继续在37℃振荡生长，90分钟(D357Y)或120分钟(7号酶)后，取出这些细胞的200μl等分样品进行离心，然后重悬浮于150μl含有0.5mM D-荧光素的100mM柠檬酸缓冲液pH 5.0中。然后将重悬浮的细胞置于一块微量滴定板上，利用Molecular Devices Spectramax96孔板荧光计，分析每一种所述突变型荧光素酶发出的体内生物发光发射光谱。所述结果显示于图7和图8中。
所述结果显示，从丰富培养基(LB)(图7a、图8a)转移到含有作为唯一碳源的柠檬酸盐(图7b、图8b)或葡萄糖(图7c、图8c)的合成培养基中，导致发射光向更长波长处的移动，并且来自较短波长的光的减少。实施例10 重组野生型荧光素酶和突变型荧光素酶的纯化和光谱鉴定
将重组野生型Photinus pyralis荧光素酶和D357Y或E354I+D357Y突变型荧光素酶纯化到均质，以分析辅因子辅酶A对生物发光反应光谱的影响。所有这三种荧光素酶是作为与来自厌氧真菌Piromyces eguii的143个氨基酸的糖结合模块(module)(CBM)的融合体来纯化的。已经显示出这个CBM选择性地结合酸膨胀性纤维素以及可溶性糖半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，它构成了简易一步亲和纯化方案的基础。
与CBM融合的荧光素酶可以结合到粗细胞提取物中纤维素上，经过洗涤，然后用可溶性多糖选择性洗脱。通过这种方法纯化的融合蛋白用于测量含有不同量辅酶A的反应中所发射光波长的检测中。将酶(5μl)加入到100μl含有不同量辅酶A的检测试剂中：25mM TrisTricine pH 7.8、5.0mM MgSO4、0.1mM EDTA、530μM ATP和470μMD-荧光素。图9-11显示了增大辅酶A浓度对于纯化的D357荧光素酶和E354I+D357Y荧光素酶发射光光谱的影响。
对表达与所述真菌CBM的C-末端融合的萤火虫荧光素酶的大肠杆菌细胞所发出的生物发光谱的体内检测，并没有显示出与表达天然荧光素酶的细胞的生物发光谱有任何明显的差异。同样，对市售来源的纯化重组型荧光素酶(Promega)发射光的生物发光光谱的体外检测，与对所述融合蛋白发射的光谱的体内检测是相同的。
因此所观察到的差异与CoA的浓度相关。随着辅酶A浓度的增加，光谱分布变化了，在最高浓度CoA下，光谱中波长主要在590-630nm区域内，在610nm处有一明显的峰。对于双重突变体来说它的光谱移动最为明显，其中在610nm波长的单一峰周围的带宽明显变窄。实施例12 经突变使得具有214C/354K/357F的合成Photinus pyralis荧光素酶的 产生
设计一个合成luc基因，并且利用上面概括的合成策略由寡核苷酸组装。该基因序列经工程改造，以产生具有214C、354K和357F氨基酸的荧光素酶。
由Sigma-Genosys Ltd合成29个碱基对的重叠合成寡核苷酸，通过PAGE纯化，然后连接到三个大约550bp的组件(assembly)(IDRIS 1、2和3，图13)中。然后把每一个组件分别连接到pBSK(+)载体上，产生的构成物用于转化大肠杆菌XL1-Blue细胞。由含有已装配插入片断的克隆来制备质粒DNA，然后进行测序以证实所述ORF的保真性。在所述组件中n-1寡核苷酸(寡核苷酸合成的副产品)的出现使得构建过程复杂化了。DNA测序鉴定出IDRIS 2的单校正组件，利用PCR校正在该构建体5’末端包括一个单碱基对缺失的IDRIS 3的一个组件。通过连接含有IDRIS 1以及IDRIS 2和IDRIS 3的质粒混合物，获得完整ORF的组件。
然后用连接的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue细胞，利用体内检测来选择表达活性酶的克隆。挑选几个克隆然后测序，以证实具有图14所显示序列的合成luc基因的存在和保真性。所述完整的ORF被称为IDRIS(FA)。
将所述合成基因组装到pBSK(+)载体多位点接头中BamI位点和SalI位点之间。在这个位置上所述基因与所述α-肽的读框不符，并与lac启动子具有明显的距离。然而，制备足够的荧光素酶，使得能够进行该酶的初步鉴定。利用Promega裂解方法，从过夜培养物中制备表达IDRIS(FA)的大肠杆菌XL1-Blue细胞的无细胞粗提物。
然后在50℃下20分钟内检测在提取物中所述酶的热稳定性，并与热稳定突变体E354I+D357Y进行比较。密码子被优化过的新三重突变体明显要比E354I+D357Y突变体更耐热(图15)。
             序列表<110>国防部(The Secretary of State for Defence)
White，Peter J
Willey，Tara L
Price，Rachel L
Murphy，Melanie J
Squirrell，David<120>新型酶<130>DERA/IPD/P1247/WOD<140><141><150>GB 9925161.3<151>1999-10-26<150>GB 0016744.5<151>2000-07-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1661<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(3)..(1661)<220><223>人工序列的描述：合成荧光素酶基因的cDNA序列<400>1gg atc caa atg gaa gac gcc aaa aac atc aag aaa ggc ccg gcg cca    47Ile Gln Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro
    -1   1               5                  10ttc tat cct ctg gag gat ggc acc gct ggc gag caa ctg cat aag gct   95Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala
 15                  20                  25atg aag cgt tac gcc ctg gtt cct ggt aca att gct ttt aca gat gca   143Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala30                  35                  40                  45cat atc gag gtg aac atc acg tac gcg gaa tac ttc gaa atg tcc gtt   191His Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val
             50                  55                  60cgc ctg gca gaa gct atg aaa cgc tat ggt ctg aat aca aat cac cgt   239Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg
         65                  70          75atc gtc gta tgc agt gaa aac tct ctt caa ttc ttt atg ccg gtg ctg   287Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu
     80                  85                  90ggc gcg ctt ttt atc ggt gtt gca gtt gcg ccg gcg aac gac att tat   335Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr
 95                 100                 105aat gaa cgt gaa ctg ctt aac agt atg aac att tcg cag cct acc gta   383Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val110                 115                 120                 125gtc ttt gtt tcc aaa aag ggc ctg caa aaa att ctc aac gtg caa aaa   431Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys
                130             135                 140aaa ctg cca att atc cag aaa att att atc atg gat tct aaa acg gat   479Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp
            145                 150             155tac cag ggc ttt cag tcg atg tac acg ttc gtc aca tct cat ctg cct   527Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro
    160                 165                 170ccg ggt ttt aat gaa tac gat ttt gta cca gag tcc ttt gat cgt gac   575Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp
175                 180                 185aaa aca att gca ctg atc atg aat tcc tct ggc tct act ggt ctg cct   623Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro190                 195                 200                 205aag ggt gtg gcc ctt ccg cat cgt tgt gcc tgc gtc cgt ttc tcg cat   671Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg Cys Ala Cys Val Arg Phe Ser His
            210                 215                 220gcc cgc gat cct att ttt ggt aac caa atc att ccg gat act gcg att   719Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile
        225                 230                 235ctg agt gtt gtt cca ttc cac cat ggt ttt ggc atg ttt act aca ctc   767Leu Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu
        240             245                 250ggc tat ctg atc tgt ggc ttt cgt gtc gtc ctc atg tat cgc ttt gaa   815Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu
255                 260                 265gaa gag ctg ttt ctg cgc tcc ctg cag gat tac aaa att caa agt gcg   863Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala270                 275                 280                 285ctt ctg gtg cca acc ctg ttt tca ttc ttc gcc aaa agc act ctg att   911Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile
            290                 295                 300gac aaa tac gat ctg tct aat ctt cac gaa att gct agc ggc ggt gca   959Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala
        305                 310                 315cct ctt tcg aaa gaa gtc gga gaa gcg gtt gca aaa cgc ttc cat ctt   1007Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu
    320                 325                 330cca ggc atc cgt caa ggc tat ggt ctc act gag act act agt gct att   1055Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile
335                 340                 345ctg att aca ccg aag ggc gat ttc aaa ccg ggc gcg gtc ggt aaa gtg   1103Leu Ile Thr Pro Lys Gly Asp Phe Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val350                 355                 360                 365gta cca ttt ttt gaa gcg aag gtt gtg gat ctg gat acc ggc aaa acg   1151Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr
            370                 375                 380ctg ggc gtt aat cag cgt ggc gaa ctg tgt gtc cgc ggt cct atg att   1199Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile
        385                 390                 395atg tcc ggt tat gta aac aat ccg gaa gcg acc aac gcc ctt att gac   1247Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp
    400                 405                 410aag gat ggc tgg ctg cat tct ggc gac atc gct tac tgg gac gaa gac   1295Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp
415                 420                 425gaa cac ttc ttc atc gtt gac cgc ctg aag tct ctc att aaa tac aaa   1343Glu His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys430                 435                440                  445ggc tat cag gtg gcc cca gct gaa ctg gaa tcg atc ctc ctg caa cac   1391Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His
            450                 455                 460cca aac atc ttc gac gcg ggc gtg gca ggt ctt ccg gac gat gac gcc   1439Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala
        465                 470                 475ggt gaa ctt ccg gcc gcc gtt gtt gtt ctc gag cac ggt aag acg atg   1487Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met
    480                 485                 490acg gaa aaa gag atc gtg gat tac gtc gcc agt caa gta aca acc gcg   1535Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala
495                 500                 505aaa aag ctg cgc ggt ggc gtt gtg ttt gtg gac gaa gta ccg aaa ggt   1583Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly510                 515                 520                 525ctt acc ggc aaa ctc gac gca cgt aaa atc cgc gag atc ctc att aag   1631Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys
            530                 535                 540gcc aag aag ggc ggt aag tcc aag ctt taa                           1661Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu
        545                 550<210>2<211>552<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成荧光素酶基因cDNA序列所编码的氨基酸序列<400>2Ile Gln Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe
-1   1               5                  10Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met15                  20                  25                  30Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His
            35                  40                  45Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg
        50                  55                  60Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile
    65                   70                  75Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly
 80                  85                  90Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn95                         100         105                 110Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val
            115                 120                 125Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys
        130                 135                 140Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr
        145                 150             155Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro
160                 165                 170Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys175                 180                 185                 190Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
            195                 200                 205Gly Val Ala Leu Pro His Arg Cys Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala
        210                 215                 220Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu
    225                 230                 235Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
240                 245                 250Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu255                 260                 265                 270Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu
            275                 280                 285Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp
        290                 295                 300Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
    305                 310                 315Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro
320                 325                 330Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu335                 340                 345                 350Ile Thr Pro Lys Gly Asp Phe Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val
            355                 360                 365Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu
        370                 375                 380Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met
    385                 390                 395Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys
400                 405                 410Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu415                 420                 425                 430His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
            435                 440                 445Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro
        450                 455                 460Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly
    465                 470                 475Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr
480                 485                 490Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr ValAla Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys495                 500                505                 510Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
            515                 520                 525Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala
        530                 535                 540Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu
    545                 550<210>3<211>1661<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成荧光素酶基因的cDNA序列<400>3ttaaagcttg gacttaccgc ccttcttggc cttaatgagg atctcgcgga ttttacgtgc 60gtcgagtttg ccggtaagac ctttcggtac ttcgtccaca aacacaacgc caccgcgcag 120ctttttcgcg gttgttactt gactggcgac gtaatccacg atctcttttt ccgtcatcgt 180cttaccgtgc tcgagaacaa caacggcggc cggaagttca ccggcgtcat cgtccggaag 240acctgccacg cccgcgtcga agatgtttgg gtgttgcagg aggatcgatt ccagttcagc 300tggggccacc tgatagcctt tgtatttaat gagagacttc aggcggtcaa cgatgaagaa 360gtgttcgtct tcgtcccagt aagcgatgtc gccagaatgc agccagccat ccttgtcaat 420aagggcgttg gtcgcttccg gattgtttac ataaccggac ataatcatag gaccgcggac 480acacagttcg ccacgctgat taacgcccag cgttttgccg gtatccagat ccacaacctt 540cgcttcaaaa aatggtacca ctttaccgac cgcgcccggt ttgaaatcgc ccttcggtgt 600aatcagaata gcactagtag tctcagtgag accatagcct tgacggatgc ctggaagatg 660gaagcgtttt gcaaccgctt ctccgacttc tttcgaaaga ggtgcaccgc cgctagcaat 720ttcgtgaaga ttagacagat cgtatttgtc aatcagagtg cttttggcga agaatgaaaa 780cagggttggc accagaagcg cactttgaat tttgtaatcc tgcagggagc gcagaaacag 840ctcttcttca aagcgataca tgaggacgac acgaaagcca cagatcagat agccgagtgt 900agtaaacatg ccaaaaccat ggtggaatgg aacaacactc agaatcgcag tatccggaat 960gatttggtta ccaaaaatag gatcgcgggc atgcgagaaa cggacgcagg cacaacgatg 1020cggaagggcc acacccttag gcagaccagt agagccagag gaattcatga tcagtgcaat 1080tgttttgtca cgatcaaagg actctggtac aaaatcgtat tcattaaaac ccggaggcag 1140atgagatgtg acgaacgtgt acatcgactg aaagccctgg taatccgttt tagaatccat 1200gataataatt ttctggataa ttggcagttt tttttgcacg ttgagaattt tttgcaggcc 1260ctttttggaa acaaagacta cggtaggctg cgaaatgttc atactgttaa gcagttcacg 1320ttcattataa atgtcgttcg ccggcgcaac tgcaacaccg ataaaaagcg cgcccagcac 1380cggcataaag aattgaagag agttttcact gcatacgacg atacggtgat ttgtattcag 1440accatagcgt ttcatagctt ctgccaggcg aacggacatt tcgaagtatt ccgcgtacgt 1500gatgttcacc tcgatatgtg catctgtaaa agcaattgta ccaggaacca gggcgtaacg 1560cttcatagcc ttatgcagtt gctcgccagc ggtgccatcc tccagaggat agaatggcgc 1620cgggcctttc ttgatgtttt tggcgtcttc catttggatc c                     1661<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>4cacccgaggg ggattataaa ccgggcgcgg                                30<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>5cacccgaggg ggatvycaaa ccgggcgcgg tcgg                            34<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>6cacccgaggg ggattdsaaa ccgggcgcgg tcgg                             34<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>7cacccgaggg ggatmrsaaa ccgggcgcgg tcgg                             34<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>8gggctcactg agactactag tgctattatg attacacccg                       40<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>9cgggtgtaat cagaatagca ctagtagtct cagtgagccc                       40<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>10ggcgcggtcg gtaaagtggt accatttttt gaagcg                         36<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>11cgcttcaaaa aatggtacca ctttaccgac cgcgcc                           36<210>12<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(24)..(25)<223>n＝a或g或c或t<220><221>misc_feature<222>(33)..(34)<223>n＝a或g或c或t<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>12ctagtgctat tctgattaca cccnnsgggg atnnsaaacc gggcgcggtc ggtaaagtgg    60ta                                                                   62<210>13<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(27)<223>n＝a或g或c或t<220><221>misc_feature<222>(35)..(36)<223>n＝a或g或c或t<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>13cactttaccg accgcgcccg gtttsnnatc cccsnngggt gtaatcagaa tagca      55

Claims (25)

1.一种具有荧光素酶活性而且与野生型荧光素酶具有至少60％相似性的重组蛋白，其中在所述酶的序列中，在对应于Photinus pyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基与所述对应的野生型荧光素酶相比是突变的，使得与所述对应的野生型荧光素酶相比所述荧光素酶能够发射不同波长的光和/或与所述对应的野生型荧光素酶相比所述酶的热稳定性增强。
2.一种权利要求1的重组蛋白，其中所述野生型荧光素酶的序列属于来自Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis、Hotaria paroula、Pyrophorus plagiophthalamus、欧洲萤(Lampyris noctiluca)、Pyrocoelia nayako或Photinus pennsylvanica的荧光素酶。
3.一种权利要求2的重组蛋白，其中所述野生型荧光素酶的序列是可由Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis酶获得的一种酶的序列。
4.一种权利要求1或权利要求2的重组蛋白，其中所述野生型荧光素酶的序列属于来自Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciolacruciata或Luciola lateralis、Hotaria paroula、Pyrophorusplagiophthalamus、欧洲萤或Pyrocoelia nayako荧光素酶，并且对应于Photinus pyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基不是天冬氨酸或谷氨酸。
5.一种权利要求1或权利要求2的重组蛋白，其中所述野生型荧光素酶的序列属于来自Photinus pennsylvanica的荧光素酶，并且对应于Photinus pyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基不是缬氨酸。
6.一种任一前述权利要求的重组蛋白，其中对应于Photinuspyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基不是天冬氨酸、谷氨酸或缬氨酸。
7.一种任一前述权利要求的重组蛋白，其中对应于Photinuspyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基是一个不带电荷的极性氨基酸。
8.一种权利要求7的重组蛋白，其中对应于Photinus pyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
9.一种权利要求8的重组蛋白，其中对应于Photinus pyralis荧光素酶357位残基的氨基酸残基是酪氨酸。
10.一种任一前述权利要求的蛋白质，其中所述蛋白质与来自Photinus pyralis、Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciolalateralis的荧光素酶至少具有80％的相似性。
11.一种任一前述权利要求的蛋白，所述蛋白与野生型荧光素酶相比至少具有下列突变之一：
a)对应于Photinus pyralis荧光素酶354位(Luciola荧光素酶中356位)氨基酸的氨基酸残基是突变的；
b)对应于Photinus pyralis荧光素酶215位或(Luciola荧光素酶中217位)的氨基酸残基是一个不同的疏水性氨基酸；
c)对应于Photinus pyralis荧光素酶214位残基或对应于Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶216位残基的氨基酸残基；
d)对应于Photinus pyralis荧光素酶232位残基或对应于Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶234位残基的氨基酸残基；
e)对应于Photinus pyralis荧光素酶295位残基或对应于Luciolamingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶297位残基的氨基酸残基；
f)对应于Photinus pyralis荧光素酶14位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 16位残基的氨基酸残基；
g)对应于Photinus pyralis荧光素酶35位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 37位残基的氨基酸残基；
h)对应于Photinus pyralis荧光素酶105位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 106位残基的氨基酸残基；
i)对应于Photmus pyralis荧光素酶234位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 236位残基的氨基酸残基；
j)对应于Photinus pyralis荧光素酶420位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 422位残基的氨基酸残基；
k)对应于Photinus pyralis荧光素酶310位氨基酸或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis 312位残基的氨基酸残基；不同于出现在对应野生型序列中的氨基酸，并且其中与在这个位置上具有所述对应野生型荧光素酶的氨基酸的酶相比，所述荧光素酶的热稳定性增强。
12.一种任一前述权利要求的所述蛋白，其中对应于Photinuspyralis荧光素酶354位(Luciola荧光素酶中356位)氨基酸的氨基酸残基是突变的。
13.一种权利要求12的所述蛋白，其中对应于Photinus pyralis荧光素酶214位残基或对应于Luciola mingrelica、Luciola cruciata或Luciola lateralis荧光素酶216位残基的氨基酸残基突变为一个不同的疏水性氨基酸。
14.一种核酸，所述核酸编码任一前述权利要求的荧光素酶。
15.一种权利要求14的核酸，所述核酸包含一个合成基因。
16.一种权利要求14的核酸，其中所述密码子选择已经针对特定的表达宿主进行了优化和/或引入了单一限制性位点。
17.一种权利要求14或权利要求15的核酸，所述核酸包含SEQID NO 1的核苷酸9-1661或者与其具有至少90％相似性的序列。
18.一种载体，所述载体包含权利要求14至权利要求17中任一项的核酸。
19.一种细胞，所述细胞已用权利要求18的所述载体转化。
20.一种生产权利要求1至权利要求13中任一项的所述蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求19的细胞。
21.一种权利要求1至权利要求13中任一项的所述蛋白在生物发光检测中的应用。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包含一种权利要求1至权利要求13中任一项的所述蛋白。
23.一种权利要求22的试剂盒，所述试剂盒还包含荧光素。
24.一种确定样品中CoA存在的检测，所述检测包括向怀疑含有CoA的样品中加入上面权利要求1至权利要求11中任一项的荧光素酶和使荧光素酶/荧光素反应发生所需的其他试剂，测量从所述样品中发出光的波长，并且将其与CoA的存在或不存在联系起来。
25.一种权利要求24的检测，所述检测应用于糖尿病的诊断。
CNB008177368A 1999-10-26 2000-10-26 新型酶 Expired - Fee Related CN100516223C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9925161.3 1999-10-26
GBGB9925161.3A GB9925161D0 (en) 1999-10-26 1999-10-26 Novel enzyme
GBGB0016744.5A GB0016744D0 (en) 1999-10-26 2000-07-10 Novel enzyme
GB0016744.5 2000-07-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1413252A true CN1413252A (zh) 2003-04-23
CN100516223C CN100516223C (zh) 2009-07-22

Family

ID=26244619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008177368A Expired - Fee Related CN100516223C (zh) 1999-10-26 2000-10-26 新型酶

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1224294B1 (zh)
JP (1) JP5154724B2 (zh)
CN (1) CN100516223C (zh)
AT (1) ATE374820T1 (zh)
AU (1) AU772485C (zh)
CA (1) CA2387691A1 (zh)
DE (1) DE60036633T2 (zh)
DK (1) DK1224294T3 (zh)
ES (1) ES2292479T3 (zh)
NZ (1) NZ518413A (zh)
RU (1) RU2251571C2 (zh)
WO (1) WO2001031028A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597231A (zh) * 2009-11-10 2012-07-18 龟甲万株式会社 萤火虫荧光素酶、其基因和萤火虫荧光素酶的制造法
CN114350627A (zh) * 2021-12-16 2022-04-15 大连博格林生物科技有限公司 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法
CN114015664B (zh) * 2021-12-06 2023-07-21 郑州伊美诺生物技术有限公司 荧光素酶突变体及其应用

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
GB9823468D0 (en) 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme
GB9925161D0 (en) 1999-10-26 1999-12-22 Secr Defence Novel enzyme
GB0111275D0 (en) 2001-05-09 2001-06-27 Secr Defence Analytical method and kit
GB2400659B8 (en) 2003-04-17 2007-07-09 Cambrex Bio Science Nottingham Assay methods and materials
WO2005035719A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-21 Board Of Control Of Michigan Technological University Modified luciferase
GB0517005D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Enigma Diagnostics Ltd Analytical method and kit
JP4999341B2 (ja) * 2005-09-06 2012-08-15 株式会社バイオエネックス 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法
US8147842B2 (en) 2006-06-12 2012-04-03 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Mutant luciferase
JP5188771B2 (ja) 2007-09-26 2013-04-24 株式会社日立製作所 変異型ホタルルシフェラーゼ
EP2326953B1 (en) 2008-07-22 2018-03-21 Promega Corporation Adp detection based luminescent phosphotransferase or atp hydrolase assay
SG10201901453PA (en) 2009-05-01 2019-03-28 Promega Corp Synthetic oplophorus luciferases with enhanced light output
US8980603B2 (en) 2009-06-30 2015-03-17 The General Hospital Corporation Gaussia luciferase variant for high-throughput screening
ES2723773T3 (es) 2010-11-02 2019-09-02 Promega Corp Luciferasas derivadas de Oplophorus, nuevos sustratos de celenterazina y procedimientos de uso
US9487520B2 (en) 2010-11-02 2016-11-08 Promega Corporation Coelenterazine derivatives and methods of using same
JP5896679B2 (ja) * 2011-03-15 2016-03-30 オリンパス株式会社 オオオバボタル由来ルシフェラーゼ
RU2495929C1 (ru) * 2012-05-30 2013-10-20 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук УКОРОЧЕННАЯ МУТАНТНАЯ ЛЮЦИФЕРАЗА ИЗ Metridia longa ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО РЕПОРТЕРА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ
US9927430B2 (en) 2014-01-29 2018-03-27 Promega Corporation Pro-substrates for live cell applications
EP3099683B1 (en) 2014-01-29 2020-08-05 Promega Corporation Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements
WO2016040788A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Promega Corporation Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence
WO2016057084A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Promega Corporation Bioluminescent succinate detection assay
RU2674894C2 (ru) * 2017-01-30 2018-12-13 Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" Новые люциферазы и способы их использования
GB201805396D0 (en) * 2018-04-01 2018-05-16 Univ College Cardiff Consultants Ltd Modified Luciferases
CN110456052A (zh) * 2019-08-22 2019-11-15 中国科学院武汉病毒研究所 一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法及其应用
JPWO2021162123A1 (zh) 2020-02-14 2021-08-19

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3048466B2 (ja) * 1991-06-27 2000-06-05 キッコーマン株式会社 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法
EP1978091A1 (en) * 1994-01-03 2008-10-08 Promega Corporation Mutant luciferases
GB9501170D0 (en) * 1994-03-23 1995-03-08 Secr Defence Luciferases
DE69633171T2 (de) * 1995-01-20 2005-08-18 The Secretary Of State For Defence, Salisbury Mutierte luziferasen
GB9707486D0 (en) * 1997-04-11 1997-05-28 Secr Defence Enzyme assays
JP4537573B2 (ja) * 1997-09-19 2010-09-01 プロメガ・コーポレイシヨン 熱安定ルシフェラーゼと生産方法
US6602677B1 (en) * 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
GB9823468D0 (en) * 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102597231A (zh) * 2009-11-10 2012-07-18 龟甲万株式会社 萤火虫荧光素酶、其基因和萤火虫荧光素酶的制造法
CN114015664B (zh) * 2021-12-06 2023-07-21 郑州伊美诺生物技术有限公司 荧光素酶突变体及其应用
CN114350627A (zh) * 2021-12-16 2022-04-15 大连博格林生物科技有限公司 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法
CN114350627B (zh) * 2021-12-16 2022-08-05 大连博格林生物科技有限公司 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU772485B2 (en) 2004-04-29
AU1042501A (en) 2001-05-08
JP2003512071A (ja) 2003-04-02
EP1224294B1 (en) 2007-10-03
DE60036633T2 (de) 2008-07-03
CN100516223C (zh) 2009-07-22
JP5154724B2 (ja) 2013-02-27
DK1224294T3 (da) 2008-02-04
AU772485C (en) 2004-11-18
NZ518413A (en) 2004-11-26
ES2292479T3 (es) 2008-03-16
CA2387691A1 (en) 2001-05-03
DE60036633D1 (de) 2007-11-15
RU2002113653A (ru) 2004-01-27
ATE374820T1 (de) 2007-10-15
WO2001031028A3 (en) 2002-05-02
RU2251571C2 (ru) 2005-05-10
EP1224294A2 (en) 2002-07-24
WO2001031028A2 (en) 2001-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1413252A (zh) 新型酶
CN1149318A (zh) 虫荧光素酶
CN1252100A (zh) 重组卤代脂族脱卤素酶
CN1513057A (zh) 宿主微生物
US20140186918A1 (en) Luciferase mutant
CN1641019A (zh) 头孢菌素c酰基转移酶
CN1165620C (zh) 突变的异戊二烯基二磷酸合酶
CN1202244C (zh) 具有天冬氨酸酶活性的蛋白和编码该蛋白的基因dna
CN1243831C (zh) 果糖基氨基酸氧化酶
CN1501977A (zh) 葡萄糖脱氢酶
CN1324128C (zh) 变异碱性纤维素酶
CN1726228A (zh) 用于检测蛋白质加工的探测蛋白质
CN1219200A (zh) 谷氨酸脱氢酶、β－N－乙酰氨基己糖苷酶和γ－肌动蛋白基因的启动子以及它们在丝状真菌表达,分泌和反义系统中的应用
CN1693473A (zh) 果葡糖浆制备新方法与耐高温葡萄糖异构酶突变体
CN1671839A (zh) 葡萄糖脱氢酶
CN1772903A (zh) 新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途
CN1184311C (zh) L－脯氨酸3位羟基化酶的制造方法
CN1302117C (zh) 生产l－抗坏血酸的方法
CN1281763C (zh) 运用荧光pcr技术检测坂崎肠杆菌的方法
CN1172955C (zh) 新的荧光蛋白
CN1711353A (zh) 修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物
CN1254536C (zh) 新型(r)－2－羟基－3－苯基丙酸(d－苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因
CN1155906A (zh) 耐热脯氨酰内肽酶
CN101037677A (zh) 葡萄糖脱氢酶
CN1807639A (zh) 一种l－乳酸脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列和制备过程中设计的引物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: 3M CREATION CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: ENGLAND MINISTRY OF NATIONAL DEFENCE

Effective date: 20080418

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20080418

Address after: Minnesota, USA

Applicant after: 3M Innovative Properties Company

Address before: Wiltshire

Applicant before: British Ministry of Defence

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1055443

Country of ref document: HK

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090722

Termination date: 20101026