CN1671839A - 葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改进型葡萄糖脱氢酶，其特征是：在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，在来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域或其他种类中的同等区域中的1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。另外本发明提供编码上述改进型葡萄糖脱氢酶的基因、含有该基因的载体和含有该基因的转化体，以及含有本发明改进型葡萄糖脱氢酶的葡萄糖分析试剂盒和葡萄糖传感器。

Description

葡萄糖脱氢酶
技术领域
本发明涉及到以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制备、以及在葡萄糖定量中的使用。
背景技术
血中葡萄糖浓度是糖尿病的重要标志。另外在使用微生物的发酵生产中，为了监测工序，对葡萄糖浓度进行定量。以往，葡萄糖是通过使用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶法定量的。而在使用GOD的方法中为了要对伴随着葡萄糖氧化反应的同时产生的过氧化氢进行定量，需要向分析系统中添加过氧化氢酶或过氧化物酶。G6PDH可以用于根据分光学手法的葡萄糖定量中，但一定要向反应体系中添加辅酶NAD(P)。
因此，作为取代到目前为止一直用于葡萄糖酶定量方法的酶的新酶，PQQGDH的应用引人注目。PQQGDH是以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶，催化使葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的反应。
已知PQQGDH中存在着膜结合性酶和水溶性酶。膜结合性PQQGDH是分子量约87kDa的信号肽蛋白质，广泛存在于各种革兰氏阴性菌中。例如，请参照AM.Cleton Jansen et al.，J.Bacteriol.(1990)172，6308-6315。而水溶性PQQGDH确认存在于乙酸钙不动杆菌的几个菌株中(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，其结构基因已被克隆，氨基酸序列已阐明(Mol.Gen.Genet.(1989)，217：430-436)。来自A.calcoaceticus的水溶性PQQGDH是分子量约50kDa的均二聚物。与其他的PQQ酶在蛋白质的一级结构上基本没有同源性。
最近，报告了来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的水溶性PQQGDH的X线晶体结构解析的结果，阐明了以活性中心为首的该酶的高级结构。(A.Oubrie etal.，J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)；A.Oubrie et al.，The EMBOJournal，18(19)5187-5194(1999)；A.Oubrie et al.PNAS，96(21)，11787-11791(1999))。通过这些论文，阐明了水溶性PQQGDH是由6个W-基元构成的βプロペラ蛋白质。
由于PQQGDH对葡萄糖具有高的氧化活性，以及PQQGDH是结合辅酶型的酶，不需要氧作为电子受体，有望在以葡萄糖传感器的识别元件为代表的分析领域中应用。然而，存在着PQQGDH对葡萄糖的选择性低的问题。
因此，本发明的目的是提供对葡萄糖的选择性高的改进型水溶性PQQGDH。
发明内容
本发明人对水溶性PQQGDH进行基因工程学改进，提高他对葡萄糖的选择性，进行了开发可应用于临床检查和食品分析等的改进型PQQGDH的锐意研究，结果通过在水溶性PQQGDH的特点区域导入氨基酸突变，成功地获得了对葡萄糖选择性高的酶。
即，本发明提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的水溶性葡萄糖脱氢酶中，天然水溶性葡萄糖脱氢酶的1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换，而且与上述天然的水溶性葡萄糖脱氢酶比较，对葡萄糖具有高的选择性的改进型葡萄糖脱氢酶。本发明的改进型葡萄糖脱氢酶与天然的水溶性葡萄糖脱氢酶比较，对葡萄糖有高的选择性。优选本发明的改进型PQQGDH，与对葡萄糖的反应性相比，对乳糖或麦芽糖的反应性比野生型酶低。更优选当以对葡萄糖的反应性作为100％时，对乳糖或麦芽糖的活性在50％以下，更优选在40％以下更好，进一步优选在30％以下。
在本发明的一种方式中，本发明的改进型葡萄糖脱氢酶中，来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域或其他菌种中的同等区域中的1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基(即与天然存在的PQQ葡萄糖脱氢酶中的对应氨基酸残基不同的氨基酸残基)置换。在本说明书中，氨基酸的位置是以起始蛋氨酸作为1编号的。
在本说明书中使用氨基酸残基的位置或区域时，「同等」这一用语表示在结构上类似，但不是同一蛋白的2种以上蛋白质中，某个氨基酸残基或区域具有等价的生物学或生物化学功能。例如认为来自乙酸钙不动杆菌以外生物的水溶性PQQGDH中存在与来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域，氨基酸序列类似性高的区域，而且合理地认为从蛋白质的二级结构看，该区域在该蛋白质中起到同样作用时，该区域称为「与来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域同等的区域」。另外，该区域的第7位氨基酸残基称为「与来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第192位残基同等位置的氨基酸残基」。
优选的本发明的改进型葡萄糖脱氢酶，来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的第192位的谷氨酰胺残基或193位的亮氨酸残基或其他种类的的同等位置的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。
在本发明的另一种方式中，提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被其他氨基酸残基置换的改进型葡萄糖脱氢酶。优选是序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。
在本发明的另一种方式中，提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基和第167位的天冬氨酸残基同时被其他氨基酸残基置换的改进型葡萄糖脱氢酶。优选是序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。另外优选是序列编号1表示的氨基酸序列第167位的天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换，而且第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。
在本发明的另一种方式中，提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被其他氨基酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换的葡萄糖脱氢酶。优选是序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换。另外优选是序列编号1表示的氨基酸序列第167位的天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被苏氨酸残基置换。
在本发明的另一种方式中，提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被其他氨基酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换的改进型葡萄糖脱氢酶。优选是序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换，而第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换。另外优选是序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被苏氨酸残基置换。
在本发明的另一种方式中，提供在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列1表示的氨基酸序列第193位亮氨酸残基被其他氨基酸残基置换的改进型葡萄糖脱氢酶。优选是序列编号1的氨基酸序列第193位亮氨酸残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、蛋氨酸残基、色氨酸残基或赖氨酸残基置换。
在另一观点中，本发明的改进型葡萄糖脱氢酶含有序列
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(式中，Xaa1、Xaa2是任意的天然氨基酸残基，但是当Xaa1是Gln时，Xaa2不是Leu)。优选Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asp，Xaa2是Ala或Gly。
本发明另外提供编码上述改进型葡萄糖脱氢酶的基因、含有该基因的载体和含有该基因的转化体，以及含有本发明改进型葡萄糖脱氢酶的葡萄糖分析试剂盒和葡萄糖传感器。
本发明的改进型葡萄糖脱氢酶的酶蛋白对葡萄糖表现出很高的选择性，而且对葡萄糖具有高的氧化活性，所有可以应用于葡萄糖的高选择性而且高灵敏度的测定中。
附图的简单说明
图1表示用于做成编码本发明改进型PQQGDH的突变基因的质粒pGB2的构造。
图2表示用于做成编码本发明的改进型PQQGDH的突变基因的方法。
图3表示本发明的改进型PQQGDH的活性与底物浓度关系的曲线。
具体实施方式
改进型PQQGDH的结构
在本发明的优选改进型葡萄糖脱氢酶中，在来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域或其他种类中的同等区域中，1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。本发明的改进型PQQGDH优选是序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基或甘氨酸残基置换，或第193位亮氨酸被丙氨酸残基、蛋氨酸残基、甘氨酸残基、色氨酸残基或赖氨酸置换。
在另外的方式中，本发明的改进型PQQGDH除了上述置换之外，序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基同时被其他氨基酸残基，优选是被谷氨酸置换。另外本发明的改进型PQQGDH除了上述置换之外，优选是第452位天冬酰胺残基同时被其他氨基酸残基，特别优选是被苏氨酸残基置换。有关第167位天冬氨酸残基和第452位天冬酰胺残基参与PQQGDH对底物的识别和结合分别在特开2001-346587和特开2001-197888中有报道。然而，一般来说，通过对存在于不同结构域的氨基酸残基同时导入突变，关于底物的选择性或酶活性怎样变化完全不能预测。有时酶活性会完全丧失。因此，在本发明中，令人惊奇地发现通过同时导入这些突变，葡萄糖的选择性得到提高。
在另一观点中，本发明的改进型葡萄糖脱氢酶含有序列：
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(式中，Xaa1、Xaa2是任意的天然氨基酸残基，但是当Xaa1是Gln时，Xaa2不是Leu)优选Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asn，Xaa2是Ala或Gly。
改进型PQQGDH的制造方法
序列编号2规定了编码来自天然的乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的基因序列。编码本发明的改进型PQQGDH的基因可以通过在编码天然的水溶性PQQGDH的基因中，将编码要置换的氨基酸残基的碱基序列置换为编码所期望的氨基酸残基的碱基序列构建。用于这样定点突变的碱基序列置换的各种方法在该技术领域中都了解，例如Sambrook等人：“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York报道的方法。
将这样获得的突变基因插入基因表达用载体(例如质粒)，用他转化适当的宿主(例如大肠菌)。在该技术领域已知有用于使外源蛋白表达的很多载体、宿主系，作为宿主可以使用细菌、酵母、培养细胞等各种宿主。
在本发明的改进型PQQGDH中，只要是具有所期望的葡萄糖脱氢酶活性，也可以进一步缺失或置换其他的一部分氨基酸残基，或附加其他的氨基酸残基。用于这样的定点突变的碱基序列置换的各种方法在该技术领域已为人们所熟悉。
另外，本领域技术人员对于来自其他细菌的水溶性PQQGDH也可以将蛋白质的一级结构进行比对，或以该酶的一级结构为基础预测的二级结构进行比对，可以容易识别与来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域同等的区域，根据本发明，通过将该区域的氨基酸残基用其他氨基酸残基置换，可以获得葡萄糖选择性提高的改进型葡萄糖脱氢酶。这些改进型葡萄糖脱氢酶也包括在本发明的范围内。
对上述得到的表达改进型PQQGDH的转化体进行培养，通过离心分离等从培养液中回收菌体后，将菌体用French挤压机等破碎，或通过渗透压变化将胞质酶释放到培养基中。然后经超离心分离，可以得到含有PQQGDH的水溶性级分。或者通过使用适当的宿主载体系，也可以将表达的PQQGDH分泌到培养液中。将得到的的水溶性级分通过离子交换层析、亲和层析、HPLC等纯化，制备本发明的改进型PQQGDH。
酶活性的测定方法
本发明的PQQGDH具有以PQQ作为辅酶，催化葡萄糖氧化、生成葡萄糖酸内酯反应的作用。酶活性的测定可以通过利用氧化还原色素的呈色反应对PQQGDH催化葡萄糖氧化同时被还原的PQQ的量进行定量。作为呈色试剂，例如可以使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚吲哚酚)、铁氰化钾、二茂(合)铁等。
对葡萄糖的选择性
本发明PQQGDH对葡萄糖的选择性，作为底物使用2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖和麦芽糖等各种糖，象上述那样测定酶活性，通过研究相对于以葡萄糖为底物时活性的相对活性，进行评价。
本发明的改进型PQQGDH与野生型酶比较，对葡萄糖的选择性高。特别是与对麦芽糖的反应性比较，对葡萄糖的反应性高。因此，使用本改进型酶做成的分析试剂盒或酶传感器具有在葡萄糖测定中选择性高、而且即使有各种糖存在的样品中也可以高灵敏度地检测葡萄糖的优点。
葡萄糖分析试剂盒
另外，本发明的特征在于提供含有改进型PQQGDH的葡萄糖分析试剂盒。本发明的葡萄糖分析试剂盒含有至少分析1次所足够量的改进型PQQGDH。典型的试剂盒不仅含有本发明的改进型PQQGDH，而且含有分析所必要的缓冲液、介质、用于制作标准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用的指针。本发明的改进型PQQGDH可以有各种形式，例如冻结干燥的试药，或者合适的保存溶液中的溶液。优选的本发明的改进型PQQGDH可以以全酶(ホロ)的形式提供，以脱辅基(apo)酶的形式提供，也可以使用时全酶化。
葡萄糖传感器
本发明另一个特征是使用本发明的改进型PQQGDH的葡萄糖传感器。作为电极使用碳电极、金电极、白金电极等，将本发明的酶固定在上述电极上。作为固定方法，有使用交联试剂的方法、封入到高分子基质(matrix)中的方法、用透析膜包被的方法、光交联性聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等，或者与二茂(合)铁或其衍生物为代表的电子传递体一起固定在聚合物中或吸附固定于电极上，也可以将他们组合使用。本发明的改进型PQQGDH优选是以全酶形式固定于电极上，也可以以脱辅基酶形式固定，将PQQ作为另外的一层或在溶液中提供。典型的是使用戊二醛将本发明的改进型PQQGDH固定在碳电极上后，用含有氨基的试剂进行处理，对戊二醛进行封闭(blocking)。
葡萄糖浓度的测定可以象以下那样进行。将缓冲液加到恒温杯中，加PQQ和CaCl2、以及传递体，维持在一定温度。作为传递体可以使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等。作为作用电极使用固定了本发明的改进型PQQGDH的电极，使用对电极(例如白金电极)和参此电极(例如Ag/AgCl电极)。向碳电极外加一定的电压，电流恒定后，加含有葡萄糖的样品，测定电流的增加。根据通过标准浓度葡萄糖溶液制作的标准曲线，可以计算样品中的葡萄糖浓度。
在本说明书中，明确引用的所有专利和参考文献的内容全部作为本说明书的一部分在这里引用。另外，本申请具有的优先权的基础的申请日本专利申请2003-71760以及2002-196177号说明书和图记载的内容全部作为本说明书的一部分在这里引用。
以下通过实施例对本发明进行更具体说明，但本发明并不限定于
实施例。
实施例1
改进型酶PQQGDH基因的构建
以序列编号2所示的来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的结构基因为基础，导入突变。质粒pGB2是将编码来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的结构基因插入到载体pTrc99A(フアルマシア公司生产)的多克隆部位的质粒(图1)。按照常规方法通过定点突变法将编码第192的谷氨酰胺残基或193的亮氨酸残基的碱基序列分别置换为编码丙氨酸残基、甘氨酸残基、蛋氨酸残基、色氨酸残基或赖氨酸残基的碱基序列。另外，将编码第167的天冬氨酸残基或第452的天冬酰胺残基的碱基序列分别置换为编码谷氨酸残基或甘氨酸残基的碱基序列。定点突变使用质粒pGB2，按图2所示的方法进行。表1给出了突变中使用的合成寡核苷酸靶引物的序列。为了做成具有2处突变的突变体，同时使用2种寡核苷酸靶引物，与上述同样导入突变。
表1
 Gln192Ala  5＇-ata agc aag cgg gtt acg ccc-3′
 Gln192Gly  5′-caa ata agc aag ccc gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Leu  5′-caa ata agc aag cag gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Phe  5′-caa ata agc aag aaa gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Ser  5′-caa ata agc aag gct gtt acg ccc ttg-3＇
 Gln192Asn  5′-caa ata agc aag gtt gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Asp  5′-caa ata agc aag atc gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Glu  5′-caa ata agc aag ttc gtt acg ccc ttg-3′
 Gln192Lys  5′-caa ata agc aag ttt gtt acg ccc ttg-3′
 Leu193Ala  5′-caa ata agc agc ctg gtt acg-3′
 Leu193Gly  5′-gaa caa ata agc acc ctg gtt acg ccc-3′
 Leu193Met  5′-gaa caa ata agc cat ctg gtt acg ccc-3′
 Leu193Trp  5′-gaa caa ata agc ttt ctg gtt acg ccc-3′
 Leu193Lys  5′-gaa caa ata agc cca ctg gtt acg ccc-3′
 Asp167Glu  5′-cc tga ctg atg ttc ttt tga tga agg-3′
 Asn452Thr  5＇-c atc ttt ttg gac agt tcc ggc agt at-3′
将含有编码来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的基因的一部分的KpnI-Hind III片段整合到载体质粒pKF18k(宝酒造(株))，以他作为模板。将该模板50fmol和宝酒造(株)生产Mutan(登录商标)-ExpressKm试剂盒所附带的选择引物5pmol、磷酸化的靶引物50pmol与总量(20μl)的1/10量的同试剂盒的退火缓冲液一起混合，于100℃下进行3分钟热处理使质粒变性，形成单链。选择引物是用于使处于pKF18k的卡那霉素抗性基因上的双重琥珀型突变恢复的引物。将该引物置于冰上5分钟，使引物退火。向该引物中加3μl的同试剂盒延伸缓冲液、1μl的T4 DNA连接酶、1μl的T4 DNA聚合酶和5μl的灭菌水，合成互补链。用该互补链转化DNA的错配修复能力缺损株E.coli BMH71-18mutS，振荡培养过夜，使质粒扩增。
然后用从培养中提取的质粒转化E.coli MV1184，从他们的菌落中提取质粒。然后对这些质粒进行测序，确认目的突变的导入。用这些片段替换质粒pGB2上的编码野生型PQQGDH的基因的Kpn I-HindIII片段，构建改进型PQQGDH的基因。
实施例2
改进型酶的制备
将编码野生型或改进型PQQGDH的基因插入到E.coli用的表达载体pTrc99A(Phamarsham公司生产)的多酶切位点，用构建的质粒转化E.coli DH5α株。使用坂口烧瓶在450ml的L培养基(含有氨苄青霉素50μg/ml、氯霉素30μg/ml)中对转化体于37℃振荡培养过夜，接种到含有1mMCaCl2、500μMPQQ的71的L培养基。培养开始后约3小时，添加终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷，然后再培养1.5小时。经离心分离(5000×g、10分钟、4℃)从培养液中回收菌体，将该菌体用0.85％NaCl溶液洗2次。收集的菌体用Freeh挤压机破碎，经离心分离(10000×g、15分钟、4℃)将未破碎的菌体除去。对上清进行超离心分离(160500×g(40000r.p.m)、90分钟、4℃)，得到水溶性级分。将该级分作为粗纯化酶标准品用于以下实施例。
实施例3
酶活性的测定
将实施例2得到的的野生型和各个改进型PQQGDH的粗纯化酶标准品分别在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，进行1小时以上全酶化。按照每份187μl将他分装，加3μl的活性试剂(6mMDCIP48μl，600mMPMS 8μl，10mM磷酸缓冲液pH7.0 16μl)和各个浓度的D-葡萄糖溶液10μl，测定酶活性。
酶活性的测定在室温下于10mM MOPS-NaOH缓冲液(pH7.0)中使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚吲哚酚)，用分光光度计追踪DCIP的600nm的吸光度变化，将该吸光度的减少速度作为酶反应的反应速度。此时，将在1分钟内还原1μmol DCIP的酶活性作为1个单位。另外，DCIP在pH7.0的摩尔吸光系数定为16.3mM-1。
从底物浓度对酶活性的曲线求Km。结果如表2所示。
                     表2
对葡萄糖的Km值(mM)  Vmax(U/mg)
 野生型     30     129
 Gln192Ala     50     123
 Gln192Gly     36     94
 Leu193Ala     177     42
 Leu193Gly     157     46
 Leu193Met     98     176
 Leu193Trp     25     17
 Leu193Lys     41     36
实施例4
底物特异性的评价
就各个改进型酶的粗纯化酶标准品研究底物特异性。将实施例2得到的的野生型和各个改进型PQQGDH的粗纯化酶标准品分别在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，进行1小时以上全酶化。按照每份187μl将他分装，加3μl的活性试剂(含6mM DCIP，600mM PMS，10mM磷酸缓冲液pH7.0)和底物。作为底物加400mM的葡萄糖或其他糖使终浓度为20mM或100mM，于室温下温育30分钟，与实施例3同样测定酶活性。将以葡萄糖为底物时的活性作为100％，用相对于该值的相对活性表示活性值。结果如表3-6所示。
                                      表3
野生型   Gln192Ala   Gln192Gly  Leu193Ala   Leu193Gly
底物浓度 20mM   20mM   20mM  20mM   20mM
葡萄糖 100(％)   100(％)   100(％)  100(％)   100(％)
阿洛糖 45   29   34  50   39
3-0-m-葡萄糖 82   80   101  66   60
半乳糖 8   10   12  34   26
麦芽糖 49   20   24  39   30
乳糖 53   56   40  64   56
纤维二糖 85   138   85  84   71
                                   表4
野生型  Gln192Ala  Gln192Gly  Leu193Ala  Leu193Gly
底物浓度 100mM  100mM  100mM  100mM  100mM
葡萄糖 100(％)  100(％)  100(％)  100(％)  100(％)
阿洛糖 62  41  45  47  35
3-0-m-葡萄糖 92  93  98  86  59
半乳糖 8  6  19  25  17
麦芽糖 51  56  44  50  46
乳糖 51  56  44  50  46
纤维二糖 42  73  59  59  39
                                     表5
        野生型        Gln192Leu   Gln192Phe   Gln192Ser          Gln192Asp   Gln192Glu
底物浓度    20mM    100mM    20mM    100mM     20mM     20mM     20mM     100mM     20mM
葡萄糖    100(％)    100(％)    100(％)    100(％)     100(％)     100(％)     100(％)     100(％)     100(％)
2-脱氧葡萄糖    0    5    0    0     0     2     0     0     0
甘露糖    7    9    0    0     2     5     0     0     0
阿洛糖    41    65    70    78     31     41     26     17     16
3-0-m-葡萄糖    80    97    84    90     62     89     46     50     63
半乳糖    8    6    23    20     61     19     1     2     4
木糖    5    8    17    26     28     7     0     0     0
乳糖    58    59    63    54     105     66     57     53     60
麦芽糖    67    55    55    36     31     35     8     1     8
纤维二糖    85    44    90    55     -     -     148     82     -
                          表6
   野生型   Leu193Met    Leu193Trp   Leu193Lys
底物浓度    20mM     20mM      20mM     20mM
葡萄糖    100(％)     100(％)      100(％)     100(％)
半乳糖    11     36      24     43
木糖    7     17      6     8
乳糖    61     59      76     48
麦芽糖    61     39      17     31
另外，表7-8给出了使用包含双重突变的本发明的改进型酶，测定酶活性的结果。本发明的改进型酶无论哪一个与对麦芽糖的反应性进行比较，对葡萄糖都表现出高的反应性。
                  表7
Asp167Glu/Asn452Thr     Gln192Gly/Asn452Thr
底物浓度 20mM     20mM
葡萄糖 100(％)     100(％)
阿洛糖 2     32
3-0-m-葡萄糖 4     98
半乳糖 2     14
麦芽糖 2     46
乳糖 12     21
                                         表8
野生型     Asp167Glu/Leu192Ala    Asp167Glu/Leu192Gly   Asp167Glu/Gln192Leu     Asp167Glu/Gln192Ser   Asp167Glu/Gln192Asn   Asp167Glu/Gln192Glu   Asp167Glu/Gln192Lys
底物浓度 20mM 100mM 20mM 100mM 20mM 100mM 100mM 20mM 100mM 20mM 100mM 20mM 100mM
葡萄糖  100(％)     100(％)  100(％)    100(％)  100(％)    100(％)      100(％)  100(％)    100(％)  100(％)    100(％)     100(％)     100(％)
2-脱氧葡萄糖 0 5 0 0 0 0 0 0 0 2 5 1 8
甘露糖  7     9  1    0  0    0      0  0    0  2    9     3     11
阿洛糖  41     65  6    5  6    7      2  1    0  16    26     5     63
3-0-m-葡萄糖 80 97 2 4 6 8 2 0 0 9 14 6 35
半乳糖  8     6  5    7  1    4      21  3    0  10    12     9     70
木糖  5     8  0    1  0    0      5  0    0  3    9     2     9
乳糖  58     59  58    61  50    43      57  61    43  49    44     54     90
麦芽糖  67     55  11    11  1    5      22  6    3  42    40     16     49
纤维二糖 85 44 - 107 215 130 195 240 131 - 61 - 74
实施例5
与底物浓度的关系
对本发明的改进型PQQGDH的活性与底物的关系进行研究。对各个改进型酶在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，进行1小时以上全酶化，于各种浓度的葡萄糖和5μMPQQ、10mM CaCl2存在下测定酶活性。方法根据实施例3所述的酶活性测定方法，以DCIP的600nm的吸光度的变化作为指标。结果如图3所示。本发明的改进型PQQGDH与野生型相比，在高葡萄糖浓度下饱和。另外，无论哪一个直到葡萄糖浓度200mM也没有看到底物抑制，Ksi在200mM以上。
实施例6
酶的纯化
将实施例2得到的野生型和Gln192Asp粗纯化酶分别吸附到用10mM磷酸缓冲液pH7.0平衡的阳离子交换层析用充填柱TSKgel CM-TOYOPEARL 650M(东曹株式会社)。将该柱用750ml的10mM磷酸缓冲液pH7.0清洗后，用含有0-0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液pH7.0将酶洗脱下来。洗脱以5ml/min流速进行。回收含有GDH活性的级分，用10mM MOPS-NaOH缓冲液(pH7.0)透析过夜。这样纯化后得到电泳均一的改进型PQQGDH蛋白质。对得到的纯化酶标准品测定对各个底物的酶活性。结果如表9-10所示。
                                                              表9
                        野生型                           Glu192Asp
Km(mM) Vmax(U/mg) kcat(sec-1)     kcat/Km(mM-1·sec-1) Km(mM) Vmax(U/mg) kcat(sec-1)      kcat/Km(mM-1·sec-1)
葡萄糖     25.0     4610     3860     154(100％)     50.0     475     398     8.0(100％)
阿洛糖     35.5     2997     2509     71(46％)     57.2     226     189     3.3(42％)
3-0-m-葡萄糖     28.7     3596     3011     105(68％)     64.4     310     260     4.0(51％)
半乳糖     5.3     277     232     44(29％)     118.9     137     115     1.0(12％)
乳糖     18.9     1982     1659     88(57％)     75.0     390     327     4.4(54％)
麦芽糖     26.0     2305     1930     74(48％)     95.8     77     64     0.7(8％)
                            表10
Asp167Glu/Asn452Thr
Km(mM)  kcat(sec-1)  kcat/Km(mM-1·sec-1)
葡萄糖 48  1193  25(100％)
阿洛糖 182  73  0.4(2％)
3-0-m-葡萄糖 198  215  1.1(4％)
半乳糖 145  89  0.6(2％)
乳糖 55  167  3(12％)
麦芽糖 147  65  0.4(2％)
纤维二糖 16  226  14(56％)
实施例7
酶传感器的制作和评价
向5单位的Gln192Ala改进型酶加碳糊20mg，使其冷冻干燥。将他们充分混合后，只填充到已填充了碳糊约40mg的碳糊电极表面，在滤纸上研磨。将该电极于含有1％的戊二醛的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中在室温下处理30分钟后，在含有20mM赖氨酸的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中于室温下处理20分钟，使戊二醛封闭。在室温下于10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中对该电极处理1小时以上，使其平衡。将电极保存在4℃。
使用制作的酶传感器进行葡萄糖浓度的测定。使用固定了本发明的改进型PQQGDH的酶传感器，可以在0.1mM-5mM范围进行葡萄糖的定量。
本发明的改进型水溶性PQQGDH由于对葡萄糖的选择性高，可用作血中葡萄糖测定用传感器的元件。
                           序列表
<110>Sode，Koji
<120>葡萄糖脱氢酶
<130>psd9010WO
<150>JP 2003-71760
<151>2003-03-17
<150>JP 2002-196177
<151>2002-07-04
<160>19
<210>1
<211>454
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>1
Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn
  1               5                  10                  15
Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu
             20                  25                  30
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly
         35                  40                  45
Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe
     50                  55                  60
Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu
 65                  70                  75                  80
Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile
                 85                  90                  95
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn
            100                 105                 110
Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu
        115                 120                 125
Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
    130                 135                 140
Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
                165                 170                 175
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
            180                 185                 190
His Thr Tyr Met Gly Lys yal Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile
        195                 200                 205
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr
    210                 215                 220
Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu
                245                 250                 255
Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys
            260                 265                 270
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys
        275                 280                 285
Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val
    290                 295                 300
Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro
305                 310                 315                 320
Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Va1 Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro
                325                 330                 335
Thr Cys Gly Glu Mer Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser
        340                 345                 350
Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu
        355                 360                 365
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile
    370                 375                 380
Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met
385                 390                 395                 400
Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly
                405                 410                 415
Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp
            420                 425                 430
Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys
        435                 440                 445
Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
    450
<210>2
<211>1612
<212>DNA
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>2
agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60
cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120
ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180
tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240
atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300
aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360
aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420
accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480
tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540
agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600
tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660
aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720
taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780
actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840
aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900
acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960
aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020
gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080
caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140
gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200
cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260
gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320
ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380
agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440
ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500
cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560
cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc         1612
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<220>
<222>4
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<222>5
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<400>3
Gly Arg Asn Xaa Xaa Ala Tyr Leu
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>4
ataagcaagc gggttacgc cc   22
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>5
caaataagca agcccgttac gcccttg  27
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>6
 caaataagca gcctggttac g  21
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>点突变的引物
<400>7
gaacaaataa gcaccctggt tacgccc  27
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>8
cctgactgat gttcttttga tgaagg  26
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>9
catctttttg gacagttccg gcagtat  27
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>10
caaataagca agcaggttac gcccttg  27
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>点突变的引物
<400>11
caaataagca agaaagttac gcccttg  27
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Claims (25)

1.改进型葡萄糖脱氢酶，在以吡咯并喹啉醌为辅酶的水溶性葡萄糖脱氢酶中，天然水溶性葡萄糖脱氢酶的1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换，而且与上述天然的水溶性葡萄糖脱氢酶比较，对葡萄糖具有高的选择性。
2.改进型葡萄糖脱氢酶，在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，在来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性PQQGDH的第186位残基至第206位残基的区域或其他种的同等区域中的1个或1个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。
3.改进型葡萄糖脱氢酶，在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第192位谷氨酰胺残基或其他种中同等位置的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。
4.改进型葡萄糖脱氢酶，在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被其他氨基酸残基置换。
5.权利要求4所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。
6.改进型葡萄糖脱氢酶，其特征是：在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基和第167位的天冬氨酸残基同时被其他氨基酸残基置换。
7.权利要求6所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被其他氨基酸残基置换，而且第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。
8.权利要求6所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换，而且第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换。
9.改进型葡萄糖脱氢酶，其中在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列的第167位天冬氨酸残基被其他氨基酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换。
10.权利要求9所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换。
11.权利要求9所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸残基被谷氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被苏氨酸残基置换。
12.改进型葡萄糖脱氢酶，其中在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺残基被其他氨基酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换。
13.权利要求12所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基置换。
14.权利要求12所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基、亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、或天冬氨酸残基置换，而且第452位天冬酰胺残基被苏氨酸残基置换。
15.改进型葡萄糖脱氢酶，其特征是：在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的第193位亮氨酸残基或其他种中同等位置的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。
16.改进型葡萄糖脱氢酶，其特征是：在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中，序列编号1表示的氨基酸序列第193位亮氨酸残基被其他氨基酸残基置换。
17.权利要求16所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中序列编号1表示的氨基酸序列的第193位亮氨酸残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、蛋氨酸残基、色氨酸残基或赖氨酸残基置换。
18.改进型葡萄糖脱氢酶，其特征是：在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中含有序列
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
式中，Xaa1、Xaa2是任意天然氨基酸残基，但是当Xaa1是Gln时，Xaa2不是Leu。
19.权利要求18所述的改进型葡萄糖脱氢酶，其中Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asp，Xaa2是Ala或Gly。
20.编码权利要求1-19任一项所述的改进型葡萄糖脱氢酶的基因。
21.含有权利要求20所述的基因的载体。
22.含有权利要求20所述的基因的转化体。
23.权利要求22所述转化体，其中权利要求20所述的基因整合在主染色体中。
24.含有权利要求1-19任一项所述的改进型葡萄糖脱氢酶的葡萄糖分析试剂盒。
25.含有权利要求1-19任一项所述的改进型葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102453702A (zh) * 2010-10-27 2012-05-16 爱科来株式会社 变异葡萄糖脱氢酶
CN105331591A (zh) * 2015-10-29 2016-02-17 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置
CN105331590A (zh) * 2015-10-29 2016-02-17 英科隆生物技术（杭州）有限公司 葡萄糖特异性改善的可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶突变体、聚核苷酸及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI224136B (en) * 1999-04-30 2004-11-21 Koji Sode Glucose dehydrogenase
EP1367120A3 (en) * 2002-05-27 2004-06-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
EP1666586B1 (en) 2003-09-08 2009-10-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Pyrroloquinoline quinone (pqq)-dependent glucose dehydrogenase modification having excellent substrate specificity
US8329439B2 (en) 2007-06-21 2012-12-11 Arkray, Inc. Glucose dehydrogenase

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000350588A (ja) 1999-04-08 2000-12-19 Koji Hayade グルコース脱水素酵素
TWI224136B (en) * 1999-04-30 2004-11-21 Koji Sode Glucose dehydrogenase
JP2001346587A (ja) * 2000-06-08 2001-12-18 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
KR100519902B1 (ko) 2000-10-27 2005-10-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 변이체
EP1367120A3 (en) * 2002-05-27 2004-06-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102453702A (zh) * 2010-10-27 2012-05-16 爱科来株式会社 变异葡萄糖脱氢酶
CN102453702B (zh) * 2010-10-27 2016-02-17 爱科来株式会社 变异葡萄糖脱氢酶
CN105331591A (zh) * 2015-10-29 2016-02-17 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置
CN105331590A (zh) * 2015-10-29 2016-02-17 英科隆生物技术（杭州）有限公司 葡萄糖特异性改善的可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶突变体、聚核苷酸及其应用
WO2017071664A1 (zh) * 2015-10-29 2017-05-04 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测生物传感器
CN105331591B (zh) * 2015-10-29 2020-02-28 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置
CN105331590B (zh) * 2015-10-29 2020-02-28 英科隆生物技术（杭州）有限公司 葡萄糖特异性改善的可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶突变体、聚核苷酸及其应用
CN111073866A (zh) * 2015-10-29 2020-04-28 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及其在葡萄糖检测中的应用
US10752934B2 (en) 2015-10-29 2020-08-25 Leadway (Hk) Limited PQQ-sGDH mutant, polynucleotide and glucose detection biosensor
CN111073866B (zh) * 2015-10-29 2024-03-19 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及其在葡萄糖检测中的应用

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