CN102453702A - 变异葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于，所述氨基酸序列的相应于326位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。

Description

变异葡萄糖脱氢酶

技术领域

本发明涉及底物特异性提高的变异葡萄糖脱氢酶。具体而言，本发明涉及包含下述变异型α亚单位的葡萄糖脱氢酶及其基因，所述变异型α亚单位是在构成包含细胞色素C的葡萄糖脱氢酶(下文中也称为CyGDH)的α亚单位氨基酸残基中引入变异的。本发明的葡萄糖脱氢酶可以适用于葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒等，在生物化学领域、临床领域等中有用。

背景技术

目前，野生型的CyGDH及以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的PQQGDH用于血糖自测传感器。野生型的CyGDH及PQQGDH有如下缺点：由于其不仅与葡萄糖反应而且还与麦芽糖反应，因此在患者的血中麦芽糖浓度高的情况下，不能测定准确的血糖值。特别是在日本和英国，使用麦芽糖作为输液中的能量物质，实际上，利用腹膜透析等施用输液的低血糖患者，还会发生因用PQQGDH型的血糖传感器而被误认为高血糖的事故。

野生型CyGDH对麦芽糖的反应性比对葡萄糖的反应性高，在葡萄糖浓度为50mg/dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果显示出170％的高值。

鉴于如上所述的情况，发明了CyGDH的变异体酶(在α亚单位的氨基酸残基的326位和365位上引入变异，分别取代成谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)的变异葡萄糖脱氢酶(以下也可称为CyGDH(QY)或者简称为QY、QYA))(国际公开号2006/137283)，在葡萄糖浓度为50mg/dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果能够被控制到36％的高值。但是，还不能说是规避麦芽糖影响的效果彻底的物质。

发明内容

本发明的课题在于，提供与CyGDH(QY)相比对葡萄糖的底物特异性提高的CyGDH。

本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代构成CyGDH的α亚单位的氨基酸残基中相应于326位和365位的位点，并且进一步用酪氨酸取代相应于472位的位点，与CyGDH(QY)相比，底物特异性进一步提高，而且，即使将GDH的同源物中的相应于326位、365位及472位的位点分别用谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代也可带来同样的效果，从而完成了本发明。

即，本发明为以下的内容。

(1)变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于：

所述氨基酸序列的相应于326位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代；

对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。

(2)如(1)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90％的同一性的氨基酸序列。

(3)如(1)或(2)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于于326位、365位及472位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。

(4)如(1)或(2)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。

(5)如(1)或(2)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。

(6)如(1)或(2)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。

(7)如(1)或(2)所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于326位和365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。

(9)如(1)～(8)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。

(10)变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含(1)～(9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。

(11)如(10)所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色素C。

(12)编码(1)～(9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。

(13)微生物，其保持(12)所述的DNA，产生(1)～(9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者(10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。

(14)葡萄糖检测试剂盒，其包含(1)～(9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、(10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(13)所述的微生物。

(15)葡萄糖传感器，其包含(1)～(9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、(10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(13)所述的微生物。

附图说明

图1是表示葡萄糖传感器的结构的图。

图2是表示葡萄糖传感器的各试剂部的图。

图3是表示使用比色式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。

图4是表示使用电极式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。

图5是表示电极式葡萄糖传感器的结构的图。

具体实施方式

下面，详细地说明本发明。

本发明的变异GDH可以通过将特定的变异引入野生型GDH的α亚单位来制造。野生型GDH可例如是洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)产生的GDH。洋葱伯克霍尔德菌的GDH，例如是洋葱伯克霍尔德菌KS1株、JCM2800株或JCM2801株产生的GDH。KS1株在2000年9月25日以保藏号码为第FERM BP-7306保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。

包含KS1株的GDHα亚单位基因及β亚单位基因的一部分的染色体DNA片段的碱基序列如序列号1所示(美国专利申请公开第2004/0023330号)。该碱基序列中存在3个开放阅读框(ORF)，从5′末端侧开始第2及第3个ORF分别编码α亚单位(序列号3)及β亚单位(序列号4)。另外，推测第1个ORF编码γ亚单位(序列号2)。另外，序列号5中示出含有β亚单位基因全长的片段的碱基序列。而且，β亚单位的氨基酸序列示于序列号6中(欧洲专利申请公开第1498484号)。推测序列号6中氨基酸号码1～22为信号肽。

另外，除此之外，作为洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDH的同源物，新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)J2315株的假定的氧化还原酶(putative oxidoreductase)(序列号7)、Burkholderia thailandensisTXDOH株的假定蛋白BthaT-07876(序列号8)、皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)12D株的FAD依赖型氧化还原酶(FAD dependentoxidoreductase)(序列号9)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)IPO1609株的跨膜脱氢酶(transmembrane dehydrogenase)(序列号10)及Burkholderia phytofirmans PsJN株的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductase)(序列号11)的各α亚单位也可以和洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDH同样使用。

此外，关于序列号7～11所示的氨基酸序列，均在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中登录。各自的登录号码分别为：序列号7为YP-002234347、序列号8为ZP-02370914、序列号9为YP-002980762、序列号10为YP-002260434、序列号11为YP-001890482。

另外，新洋葱伯克霍尔德菌J2315株以LMG16656、ATCCBAA-245、CCM4899、CCUG48434、NCTC13227保藏。Burkholderia phytofirmansPsJN株以LMG22487、CCUG49060保藏。

另外，作为和洋葱伯克霍尔德菌KS1株同属的洋葱伯克霍尔德菌株，来自例如JCM2800、JCM2801、JCM5506、JCM5507、IFO14595的各GDH的α亚单位(序列号12～16)也可以和洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDH同样地使用。此外，JCM2800、JCM2801、JCM5506及JCM5507保存于日本独立行政法人理化学研究所微生物菌种保藏中心(Japan Collection ofMicroorganisms，JCM)。IFO14595保存于日本财团法人发酵研究所(IFO)。

本发明的变异GDH可以仅为α亚单位，也可以为α亚单位和β亚单位的复合体，α亚单位和γ亚单位的复合体，或包括α亚单位、β亚单位及γ亚单位的复合体。在本说明书中，将含有β亚单位的GDH复合体称为CyGDH，将不含β亚单位的GDH复合体称为GDH。对于本发明的变异GDH而言，在任何情况下，在α亚单位中均引入特定的变异(326位、365位及472位中的变异，或对应于这些位点的位置中的变异)，但是除该特定的变异之外，也可以具有保守变异(保存的な変異)。另外，其它的亚单位可以为野生型，也可以具有保守的变异。需要说明的是，所谓“保守的变异”是指对GDH活性没有实质影响的变异。

本发明的变异型α亚单位优选除上述特定的变异以外具有序列号3、7～11所示的氨基酸序列。另外，对于变异型α亚单位而言，只要具有GDH活性，也可以具有如上所述的保守的变异。即，可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列号3、7～11的氨基酸序列中，除了具有上述特定的变异之外，还取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基。此外，在序列号3中示出了可利用序列号1的碱基序列编码的氨基酸序列，但是N末端的甲硫氨酸残基有可能会在翻译后脱落。上述所谓的“一个或多个”优选为1～10个、更优选为1～5个、特别优选为1～3个。此外，本发明的变异型α亚单位相对于序列号3中所示的氨基酸序列而言，具有至少80％、优选85％、更优选90％的氨基酸同一性。

另外，β亚单位典型地具有序列号6的氨基酸序列。但是，只要可以作为CyGDH的β亚单位起作用，也可以为具有在包括序列号6的氨基酸号码23～425的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。另外，只要可以作为CyGDH的β亚单位起作用，也可以为具有KS1株以外的β亚单位及该β亚单位的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。上述所谓的“一个或多个”优选1～20个、更优选为1～10个、特别优选为1～5个。

此外，所谓的作为CyGDH的β亚单位起作用，是指在和α亚单位一起形成复合体时作为不损害该复合体的GDH活性的电子传递亚单位、即细胞色素C起作用。

作为野生型α亚单位基因，具体可例如包含包括序列号1的碱基号码764～2380的碱基序列的DNA。另外，α亚单位基因也可以为具有包括序列号1中的碱基序列的碱基号码764～2380的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码具有GDH活性的蛋白质的DNA。

另外，作为β亚单位基因，具体可例如包含包括序列号5的碱基号码187～1398的碱基序列的DNA。另外，β亚单位基因也可以为具有包括序列号5的碱基号码187～1398的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码可作为β亚单位起作用的蛋白质的DNA。

上述严谨条件可例如是具有优选80％、更优选90％以上、特别优选95％以上的同源性的DNA之间杂交的条件，具体可例如是0.1×SSC、0.1％SDS、60℃。

α亚单位基因及β亚单位基因例如可以利用以洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA为模板进行PCR来获取。PCR用引物可以基于上述的碱基序列通过化学合成来制备。另外，还可以利用以基于上述序列制备的寡核苷酸为探针的杂交，由洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA来获取。此外，也可以使用KS1株以外的新洋葱伯克霍尔德菌J2315株、Burkholderia thailandensis TXDOH株、皮氏罗尔斯顿氏菌12D株、茄科雷尔氏菌IPO1609株及Burkholderia phytofirmans PsJN株。

对本发明的变异GDH而言，通过使如上所述的野生型GDH或具有保守的变异的GDH具有特定的变异，对葡萄糖的底物特异性提高。所谓“对葡萄糖的底物特异性提高”包含如下含义：在实质上保持对葡萄糖的反应性的情况下，对其它单糖类、二糖类或低聚糖等糖类例如麦芽糖、半乳糖、木糖等的反应性下降；或对葡萄糖的反应性与对其它糖类的反应性相比提高了。例如，即使对葡萄糖的反应性下降，但对其它糖类的反应性也下降更多的话，则对葡萄糖的底物特异性是提高的。另外，即使对其它糖类的反应性升高，但对葡萄糖的底物特异性升高更多的话，则对葡萄糖的底物特异性提高。具体而言，例如，如果变异型酶相对野生型酶的底物特异性(对葡萄糖的比活性和对其它糖类例如麦芽糖的比活性之比)的提高(用下述式表示)为10％以上、优选20％以上、更优选40％以上，则对葡萄糖的底物特异性提高。例如，底物特异性在使用野生型酶为60％、使用变异型GDH时为40％的情况下，对葡萄糖的底物特异性升高了33％。

底物特异性＝(对葡萄糖以外的糖类的比活性/对葡萄糖的比活性)×100

底物特异性的提高＝(A-B)×100/A

A：野生型酶的底物特异性

B：变异型酶的底物特异性

另外，变异型GDH对麦芽糖的反应性(比活性)为对葡萄糖的反应性(比活性)的1％以下、优选0.5％以下。

较之优选在序列号3所示的氨基酸序列的相应于326位及365位的氨基酸残基分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代而472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比，本发明的变异型GDH对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性下降。

本发明中的所谓变异，具体而言如下所述。

(1)序列号3所示的氨基酸序列的相应于326位的丝氨酸残基被谷氨酰胺取代。

(2)序列号3所示的氨基酸序列的相应于365位的丝氨酸残基被酪氨酸取代。

(3)序列号3所示的氨基酸序列的相应于472位的丙氨酸残基被酪氨酸取代。

上述氨基酸取代变异的位置为序列号3(即洋葱伯克霍尔德菌KS1株的野生型GDHα亚单位)的氨基酸序列中的位置，但是在序列号3的氨基酸序列中除上述特定的变异以外还具有取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的GDHα亚单位的同源物或变体中，在和序列号3的氨基酸序列的比对中，表示相当于上述氨基酸取代的位置的位置。例如，在1～364位的区域中具有1个氨基酸残基缺失的GDHα亚单位的保守变体中，所谓365位表示上述变体的364位。

在序列号7中，相应于序列号3的326位、365位及472位的残基分别为同样的326位、365位及472位。

在序列号8中，相应于序列号3的326位、365位及472位的残基分别为324位、363位及470位。

在序列号9中，相应于序列号3的326位、365位及472位的残基分别为327位、366位及473位。

在序列号10中，相应于序列号3的326位、365位及472位的残基分别为327位、366位及473位。

在序列号11中，相应于序列号3的326位、365位及472位的残基分别为322位、361位及466位。

此外，对于序列号3所示的氨基酸序列而言，相对于序列号7～11，分别具有96％、93％、82％、82％、63％的氨基酸序列同一性。

在以下的表1中，示出了序列号3、7～11的氨基酸序列比对。

[表1-1]

[表1-2]

为了较之变异体葡萄糖脱氢酶(CyGDH(QY))而言增加对葡萄糖的底物特异性，本发明人使用遗传算法，对最佳的326位、365位及472位的组合进行了研究。其结果发现了可以提高底物特异性的组合。

以下示出了本发明的变异型GDH的优选变异方式。

(数字表示氨基酸序列中的位置，氨基酸残基表示上述位置中的取代后的氨基酸残基，“+”表示同时具有2个氨基酸取代。)

326Gln+365Tyr+472Tyr

具有期望的变异的GDHα亚单位可通过如下方法来获取，利用位点特异性变异法，在编码GDHα亚单位的DNA(α亚单位基因)上，引入对应于期望的氨基酸变异的核苷酸变异，将获得的变异DNA用适当的表达体系来表达。另外，通过将编码变异GDHα亚单位的DNA、与编码β亚单位的DNA(β亚单位基因)或β亚单位基因和编码γ亚单位的DNA(γ亚单位基因)一起表达，可以获得变异CyGDH复合体。此外，向编码GDHα亚单位的DNA引入变异，也可以使用将γ亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段。

可以通过如下方法来确定引入了变异的GDHα亚单位或CyGDH复合体的底物特异性，即，利用实施例中记载的方法，研究对各种糖类的反应性，并和野生型GDHα亚单位或野生型CyGDH复合体的反应性相比较。

对于将γ亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段，可以利用例如以洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA为模板、将具有序列号19、20的碱基序列的寡核苷酸作为引物的PCR来获取(参照后述实施例)。

作为用于获取GDH的各亚单位的基因、引入变异、表达基因等的载体，可举出例如通过Escherichia属细菌起作用的载体，具体可例如：pTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等。作为用于基因表达的启动子，可例如lac、trp、tac、trc、P_L、tet、PhoA等。另外，通过在包含启动子的表达载体的适当位点插入α亚单位基因或其它亚单位基因，由此可以在同一步骤中进行向这些基因的载体的插入和启动子的连接。作为如上所述的表达载体，可例如：pTrc99A、pBlucscript、pKK223-3等。

另外，α亚单位基因或其它亚单位基因可以以能够表达的方式整合进宿主微生物的染色体DNA中。

在使用重组载体转化微生物时，可例如利用钙处理的感受态细胞法、原生质粒法或电穿孔法等。

宿主微生物可例如是：枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌、酿酒酵母等酵母、黑曲霉等丝状真菌，但是不限于这些，只要是适合生产异源蛋白质的宿主微生物就可以使用。

本发明的变异α亚单位或变异CyGDH复合体或者对其进行表达的微生物，可以作为葡萄糖传感器的酶电极、或葡萄糖的检测试剂盒的构成要素来使用。使用洋葱伯克霍尔德菌的野生型GDH的葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒在美国专利公开第2004/0023330A1中有记载。本发明的变异GDH也可以同样操作来使用。

实施例

下面，举出实施例进一步具体地说明本发明，但是本发明不限定于这些实施例。

实施例1 表达洋葱伯克霍尔德菌的GDH或CyGDH的质粒

准备表达GDH的α亚单位及γ亚单位的质粒作为表达洋葱伯克霍尔德菌的GDH的质粒，并且，准备表达α亚单位、β亚单位及γ亚单位的质粒作为表达CyGDH的质粒。

<1>表达GDH的α亚单位及γ亚单位的质粒

使用了WO02/036779(对应于EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703A)中记载的质粒pTrc99A/γ+α作为表达α亚单位及γ亚单位的质粒。该质粒为将从洋葱伯克霍尔德菌KS1株(FERM BP-7306)染色体DNA中分离的、连续包含GDHγ亚单位结构基因和α亚单位结构基因的DNA片段，插入作为载体pTrc99A的克隆位点的NcoI/HindIII中而形成的质粒。本质粒中的GDHγα基因利用trc启动子来控制。pTrc99A/γ+α保持有氨苄青霉素抗性基因。

利用以上述质粒pTrc99A/γ+α为模板，以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行PCR，对包含在GDH的α亚单位C末端附加了6个组氨酸残基的DNA片段的整个质粒进行扩增。

[正向引物]

5’-ACCACCACTGATAAGGAGGTCTGACCGTGCGGAAATCTAC-3’(序列号17)

[反向引物]

5’-AGCCTGTGCGACTTCTTCCTTCAGCGATCGGTGGTGGTGG-3’(序列号18)

将扩增得到的片段两端进行平末端化后，将5’末端磷酸化，利用连接反应进行环状化。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α，采集在包含氨苄青霉素50μg/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA片段，确认了约2.1kb的插入片段。本质粒中GDH的各结构基因利用trc启动子来控制。本质粒保持有氨苄青霉素抗性基因。

<2>表达CyGDH的α亚单位、β亚单位及γ亚单位的质粒

按如下操作来制备表达CyGDH的α亚单位、β亚单位及γ亚单位的质粒。

(1)来自洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA的制备

依照通常方法，由洋葱伯克霍尔德菌KS1株来制备染色体基因。即，使用TL液体培养基(聚蛋白胨10g、酵母提取液1g、NaCl 5g、KH₂PO₄2g、葡萄糖5g；1L、pH 7.2)，将该菌株在34℃下振荡一晚。通过离心分离回收增殖的菌体。将该菌体悬浮在包含10mM的NaCl、20mM的Tris-HCl(pH 8.0)、1mM的EDTA、0.5％的SDS、100μg/ml的蛋白酶K的溶液中，在50℃处理6小时。在其中添加等量的苯酚-氯仿并在室温下搅拌10分钟，然后，通过离心分离回收上清液。向其中添加醋酸钠，使最终浓度达到0.3M，用2倍量的乙醇进行分层，使染色体DNA在中间层析出。将其用玻璃棒捞出，用70％的乙醇洗涤后，使其溶解在适量的TE缓冲剂中，制成染色体DNA溶液。

(2)编码CyGDH的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段的制备

利用以上述染色体DNA为模板、以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行PCR，扩增编码CyGDH的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段。

[正向引物]

5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(序列号19)

[反向引物]

5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(序列号20)

将扩增得到的片段的C末端侧进行平末端化后，用NcoI对N末端侧进行消化，在经同样处理的pTrc99A上进行连接。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α，采集在包含氨苄青霉素50μg/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA片段，确认了约3.8kb的插入片段。将本质粒命名为pTrc99Aγαβ。本质粒中的CyGDH的各结构基因利用trc启动子来控制。pTrc99Aγαβ保持有氨苄青霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因。

实施例2 通过向CyGDHα亚单位基因引入变异对底物相互作用 位点的探索

(1)向326位、365位及472位引入变异

在实施例1中获得的pTrc99Aγαβ所含有的GDHα亚单位基因上，以使编码该基因的α亚单位的326位的丝氨酸残基、365位的丝氨酸残基、及472位的丙氨酸残基被取代为其它氨基酸残基的方式引入变异。

具体而言，使用市售的位点特异性变异引入试剂盒(Stratagenc公司，QuikChangell Site-Directed Mutagenesis Kit)，将实施例1记载的质粒pTrc99A/γ+α及pTrc99Aγαβ中含有的GDHα亚单位基因的326位的丝氨酸的密码子(TCG)、365位的丝氨酸的密码子(TCG)、及472位的丙氨酸的密码子(GCG)取代成其它氨基酸的密码子。

用于上述氨基酸残基取代的正向引物及反向引物的序列示于下表2。另外，用于制备3个变异的反向引物示于表3。

此外，在表示变异的表述中，数字表示氨基酸序列中的位置，数字前的字母表示氨基酸取代前的氨基酸残基，数字后的字母表示氨基酸取代后的氨基酸残基。例如，R53F表示53位由精氨酸向苯基丙氨酸的取代。

对于PCR反应而言，使用下文中的反应组成，在95℃、30秒后，重复15次95℃、30秒；55℃、1分钟；68℃、8分钟的循环，在68℃进行30分钟的反应后，在4℃下保持。

[反应液组成]

PCR反应后，在反应液中添加0.5μl的DpnI，在37℃下孵育1小时，使模板质粒分解。

使用获得的反应液转化大肠杆菌DH5α(supE44，ΔlacU169(Φ801acZΔM15)，hsdR17，recAi，endA1，gyrA96，thi-1，relA1)的感受态细胞。由数个在包含氨苄青霉素(50μg/ml)及卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂培养基(细菌用胰蛋白胨1％、酶提取液0.5％、NaCl 1％、琼脂1.5％)上生长的菌落制备质粒DNA，进行序列分析，确认了在GDHα亚单位基因中引入了目标变异。

[表2]

[表3]

实施例3 变异GDH的底物特异性的分析

使用实施例2获得的变异GDH表达质粒，制造变异GDH，研究底物特异性。

(1)培养

对于引入了变异的大肠杆菌DH5α株，使用各2ml的LB培养基(含有氨苄青霉素50μg/ml及卡那霉素30μg/ml)，用L形管在37℃下振荡培养一晚上。将这些培养液接种在含有150ml的LB培养基(含有氨苄青霉素50μg/ml及卡那霉素30μg/ml)的500ml的斜口烧瓶中，在37℃下振荡培养。培养开始3小时后，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)使最终浓度达到0.1mM，再培养2小时。

(2)粗制酶样品的制备

从上述培养的培养液中收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮在相对每0.3mg湿菌体而言1ml的含有0.2％Triton X100的10mM的磷酸钾缓冲剂(PPB)(pH 7.0)中，进行超声波粉碎。将该悬浮液进行离心分离(10000r.p.m.10分钟、4℃)并除去残渣后，对上清液进行超离心分离(50,000r.p.m.60分钟，4℃)，将获得的上清液(水溶性级分)作为粗制酶样品。另外，将该样品利用通常的疏水性色谱法(色谱柱名：辛基琼脂糖(Amersham Biosciences公司制))及离子交换色谱法(Q-琼脂糖(Amersham Biosciences公司制))进行精制，获得精制酶样品。以GDH活性为指标来进行目标酶级分的确定。

此外，如下操作来精制具有Histag的蛋白质。

从上述经培养的培养液中收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于相对于每0.3mg湿菌体而言1ml的含有0.5M氯化钠、20mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲剂(pH 7.5)中，进行超声波粉碎。将该悬浮液进行离心分离(10000r.p.m.10分钟，4℃)并除去残渣后，对上清液进行超离心分离(50,000r.p.m.60分钟，4℃)，将获得的上清液(水溶性级分)作为粗制酶样品。将该样品添加在经包含0.5M氯化钠、20mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲剂(pH 7.5)平衡的HistrapFF柱(Amersham Biosciences公司制)中，用包含0.5M氯化钠、60mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲剂(pH 7.5)洗涤后，使用包含0.5M氯化钠、150mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲剂(pH7.5)进行洗提，获得精制酶试样。以GDH活性为指标来进行目标酶级分的确定。

(3)GDH活性的测定

在上述粗制酶样品8μl中添加8μl的活性测定用试剂(在12μl的600mM的吩嗪硫酸甲酯(PMS)、120μl的6mM的2，6-二氯靛酚(2，6-dichlorophenol indophenol)(DCIP)中添加0.2(w/v)％Triton X100的10mM的PPB，制成总量480μl的溶液)。使用铝块恒温槽，将其在各反应温度下孵育1分钟后，迅速添加8μl各浓度的底物(葡萄糖或麦芽糖)或蒸馏水并搅拌，使用分光光度计测定来自DCIP的吸收波长600nm的吸光度。各试剂的最终浓度为：DCIP：0.06mM、PMS：0.6mM。底物的最终浓度为10mM或5mM。

结果示于表4。在10mM或5mM的底物浓度时，野生型GDH的反应比分别为23.32％及18.88％。

[表4]

表中，QYA表示相当于326位及365位的氨基酸残基分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代，但是472位未被取代(即依然为丙氨酸残基)的变异葡萄糖脱氢酶(即，GDH(QY))。

其结果表明，326Glu+365Arg+472Tyr、326Gln+365Tyr+472Arg、326Lys+365Tyr+472Thr、326Ile+365Phe+472Lys、326Arg+365Arg+472Tyr、326Lys+365Tyr+472Arg、326Lys+365Tyr+472Ser、326Gln+365Tyr+472Tyr，是在维持对葡萄糖的反应性的同时还降低了与麦芽糖的反应性的、效果显著的变异。

即，在326位、365位及472位的3个位点的变异组合中的几个组合中，确认到和变异GDH(QY)同等或其以上的协同效果。

实施例4 精制酶的制备(α亚单位及γ亚单位的复合体)

对实施例3中已发现了底物特异性改善的8种变异GDH进行精制。方法如实施例3所述。将各精制酶对葡萄糖及麦芽糖的比活性(U/mg)、反应比(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性)、对葡萄糖的Km值及Vmax示于表5。

其结果，QYA和麦芽糖的反应比在10mM及5mM中分别为1％左右，相对于此，ERY及KYT的反应比下降到了1％以下，QYY和麦芽糖的反应比下降至0.3％左右。

[表5]

DCIP 0.6mM；PMS 6mM，室温

实施例5 精制酶的制备(α亚单位、β亚单位及γ亚单位的复合体)

对实施例3中已发现底物特异性改善的变异CyGDH(QYY)进行精制。方法如实施例3所述。各精制酶对葡萄糖的比活性(U/mg)示于表6。

其结果，在α亚单位、β亚单位及γ亚单位的复合体的方式中，与QYA(326Gln+365Tyr)相比，QYY(326Gln+365Tyr+472Tyr)和麦芽糖的反应性降低至约1/2～1/3。

[表6]

实施例6 对变异酶(QYX变异)的底物特异性的分析

和实施例2同样操作，在pTrc99A/γ+α中所含的GDHα亚单位基因中，以使编码该基因的α亚单位的326位的丝氨酸残基及365位的丝氨酸残基分别取代为谷氨酰胺及酪氨酸、且使472位的丙氨酸残基取代为其它氨基酸残基的方式引入变异。使用获得的变异酶表达质粒，和实施例3同样操作，制造变异酶，研究底物特异性。结果示于下表7中。

[表7]

其结果，可看出QYD、QYG、QYK、QYL、QYP、QYQ、QYR、QYT、QYV及QYY是在维持对葡萄糖的反应性的同时对麦芽糖(Maltose)的反应性下降的变异。

实施例7 精制酶的制备(α亚单位及γ亚单位的复合体)

对实施例6中已发现底物特异性改善的10种变异GDH(QYD、QYG、QYK、QYL、QYP、QYQ、QYR、QYT、QYV及QYY)进行精制。方法如实施例3所述。各精制酶对葡萄糖及麦芽糖的比活性(U/mg)、反应比(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性)、对葡萄糖的Km值及Vmax示于表8。

其结果，不管是哪种变异GDH，虽然和麦芽糖的反应比都低，但是除QYY以外酶活性都下降，这表明不适用于葡萄糖浓度的测定。即表明，在QYX所示的10种变异GDH中，QYY最适于葡萄糖浓度的测定。

[表8]

实施例8 使用变异CyGDH的血糖测定用比色式传感器的制作

对于比活性最优异的QYY，使用实施例5获得的精制变异酶制作葡萄糖传感器。

制作具有图1所示的基本结构的葡萄糖传感器。即，上述葡萄糖传感器具有借助隔板3对透明基板2层叠透明罩4(材质PET)的形式，利用各要素2～4来界定毛细管5。毛细管5的尺寸为1.3mm×9mm×50μm(图1)。透明基板2及透明罩4由厚度为250μm的PET形成，隔板3由黑色的双面胶带构成。

葡萄糖传感器具有图2所示的第1试剂部～第3试剂部，各自的成分及涂布量示于表9。表中，“Ru”表示氯化钌六胺络合物(Ru(NH₃)₆Cl₃)，ACES表示N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，WST-4表示2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰)苯基]-2H-四氮唑，SWN表示硅酸钠镁锂(Lithium Magnesium Sodium Silicate)。

[表9]

第1试剂部

含有电子传递物质的试剂部用材料液(溶剂为水)

Ru	涂布量
		60mM	0.5μl

第2试剂部

含有酶的试剂部用材料(溶剂为水)

酶浓度	棉籽糖	蔗糖单月桂酸酯	ACES(pH7.5)	涂布量
					12KU/ml	1.0％	0.1％	100mM	0.2μl

第3试剂部

含有发色剂的试剂部用材料液(溶剂为水)

WST-4	SWN	涂布量
			约50mM	0.16％	0.4μl

将测定试料供给至上述葡萄糖传感器的毛细管，标绘从供给时刻起5秒后末端的吸光度。在每次的吸光度的测定中，对于第3试剂部，沿毛细管高度方向照射光，此时接收透过葡萄糖传感器的光。通过使用发光二极管照射630nm的光来进行光的照射。在光电二极管中接收透过光。

关于麦芽糖的影响，在将麦芽糖添加到葡萄糖50mg/dl中的情况下，对于野生型而言，依赖于麦芽糖浓度吸光度大幅度增加，这表示和麦芽糖强烈反应。另一方面，对使用了变异CyGDH(QY)的传感器而言，发现与麦芽糖浓度相应的吸光度的增加受到抑制，麦芽糖的影响变小。进而，对使用了变异CyGDH(QYY)的传感器而言，发现与麦芽糖浓度相应的吸光度的增加进一步受到抑制，麦芽糖的影响变小。图3示出将这些数据换算成表观血糖上升值的结果。

对使用野生型酶的传感器而言，低血糖(50mg/dl葡萄糖)因混入麦芽糖而表观显示在正常范围以上的(174.8mg/dl葡萄糖)(变化率为300％)。另外，即使是使用了变异CyGDH(QY)的传感器，也因混入麦芽糖而表观显示为64.8mg/dl葡萄糖(变化率为54％)。另一方面，对使用了变异CyGDH(QYY)的传感器而言，即使在混入麦芽糖最多达300mg/dl的情况下，表观血糖值最大也只上升到46.1mg/dl，可以说影响受到了大幅度抑制(变化率为14％)。作为结论，表示从对葡萄糖的反应性(线性)和麦芽糖影响的观点考虑，QYY变异体最佳。

由如上结果可知，对使用了变异CyGDH(QYY)的葡萄糖传感器而言，与使用了变异CyGDH(QY)的葡萄糖传感器相比，能大幅度降低和麦芽糖的反应性。如果用使用了该变异CyGDH(QYY)的葡萄糖传感器，则在通过医院等给药的血中麦芽糖浓度上限值即200mg/dl中，可以说没有正误差，即使在上限值以上的300mg/dl中，也不会将低血糖(50mg/dl以下)判定为正常值或高血糖，可以进行安全治疗。

实施例9 使用了变异CyGDH的电极式血糖传感器的制作

对于比活性最优异的QYY，使用实施例5获得的精制变异酶制作电极式葡萄糖传感器。

(制作步骤)

参照图5将电极式葡萄糖传感器的制作方法示于下文中。准备PET制基板(长度28mm、宽度7mm、厚度250μm)作为绝缘基板1，在其一个表面上，通过碳素墨水的丝网印刷，形成由分别具有引线部2及3的作用极4及5构成的碳电极系。接着，制作绝缘性软膏，并将其丝网印刷在上述电极上制成绝缘层6，将没有形成上述绝缘层的部分制成检测部及引线部。然后，将作为合成蒙脱石的商品名“Lucentite(ル一センタイト)SWN”(日本科普化工股份有限公司(コ一プケミカル株式会社)制)0.6g悬浮在精制水100mL中并搅拌约8～24小时。在该合成蒙脱石悬浮液10mL中，依次添加10％(w/v)CHAPS(同仁化学研究所制)水溶液0.1mL、1.0M的ACES缓冲液(pH 7.4：同仁化学研究所制)5.0mL、精制水4.0mL，进而混合作为介质的[Ru(NH₃)₆]Cl₃(Aldrich株式会社制)1.0g。将该混合液1.0μL分注于检测部。然后，使其在30℃、相对湿度10％的条件下干燥10分钟，形成试剂层7。进而，在上述试剂层7上形成酶试剂层8。酶试剂层8是将2700U/mL的本申请发明的葡萄糖脱氢酶水溶液1.0μL分注于检测部的试剂层上并在30℃、相对湿度10％的条件下干燥10分钟而形成的。最后，将具有缝隙15的隔板11配置在绝缘层上，进而，在上述隔板上配置具有形成通气孔14的贯通孔的罩12，制成生物传感器。

关于麦芽糖的影响，在将麦芽糖添加到葡萄糖50mg/dl中的情况下，对于野生型而言，依赖于麦芽糖浓度电流值大幅度增加，这表示和麦芽糖强烈反应。另一方面，对使用了变异CyGDH(QY)的传感器而言，发现与麦芽糖浓度相应的电流值的增加受到抑制，麦芽糖的影响变小。对使用了变异CyGDH(QYY)的传感器而言，发现与麦芽糖浓度相应的电流值的增加进一步受到抑制，麦芽糖的影响变小。图4示出了将这些数据换算成表观血糖上升值的结果。

对使用野生型酶的传感器而言，低血糖(50mg/dl葡萄糖)因混入麦芽糖而表观显示在正常范围以上的(288.2mg/dl葡萄糖)(变化率为549％)。另外，即使是使用了变异CyGDH(QY)的传感器，也因混入麦芽糖而表观显示为93.9mg/dl葡萄糖(变化率为114％)。另一方面，对使用了变异CyGDH(QYY)的传感器而言，即使在混入麦芽糖最多为300mg/dl的情况下，表观血糖值最大也只上升到60.0mg/dl，可以说影响受到了大幅度抑制(变化率为37％)。作为结论，表示从对葡萄糖的反应性(线性)和麦芽糖影响的观点考虑，QYY变异体最佳。

由如上结果可知，对使用了变异CyGDH(QYY)的葡萄糖传感器而言，与使用了变异CyGDH(QY)的葡萄糖传感器相比，能大幅度降低和麦芽糖的反应性。如果用使用了该变异CyGDH(QYY)的葡萄糖传感器，则在通过医院等给药的血中麦芽糖浓度上限值即200mg/dl中，可以说没有正误差，即使在上限值以上的300mg/dl中，也不会将低血糖(50mg/dl以下)判定为正常值或高血糖，可以进行安全治疗。

实施例10 向GDH同系物引入变异

和实施例1同样操作，准备表达新洋葱伯克霍尔德菌J2315株的假定的氧化还原酶、Burkholderia thailandensis TXDOH株的假定蛋白BthaT-07876、皮氏罗尔斯顿氏菌12D株的FAD依赖型氧化还原酶、茄科雷尔氏菌IPO1609株的跨膜脱氢酶及Burkholderia phytofirmans PsJN株的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶的各α亚单位及γ亚单位的质粒。

这些表达质粒为连续包含γ亚单位结构基因和α亚单位结构基因的DNA片段插入作为载体pET30c(+)(Novagen株式会社)的克隆位点的NdeI/HindIII中而形成的质粒。本质粒中的γα基因通过T7启动子来控制。本质粒保持有卡那霉素抗性基因。

对于上述质粒中含有的α亚单位基因，以使洋葱伯克霍尔德菌KS1株的野生型GDHα亚单位中的相应于326位、365位及472位的残基分别取代成谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸的方式，使用市场上出售的位点特异性变异引入试剂盒(Stratagenc株式会社、QuikChangell Site-DirectedMutagenesis Kit)引入变异。

将用于上述氨基酸残基取代的正向引物的序列示于以下。反向引物的序列形成正向引物的完全互补链。

此外，在表示变异的表述中，数字表示氨基酸序列中的位置，数字前的字母表示氨基酸取代前的氨基酸残基，数字后的字母表示氨基酸取代后的氨基酸残基。例如，R53F表示53位的由精氨酸向苯基丙氨酸的取代。

对于PCR反应而言，用以下的反应组成，在95℃、30秒后，重复15次95℃、30秒；55℃、1分钟；68℃、8分钟的循环，在68℃进行30分钟的反应后，在4℃下保持。

[反应液组成]

PCR反应后，在反应液中添加0.5μl的DpnI，在37℃下孵育1小时，使模板质粒分解。

使用获得的反应液转化大肠杆菌DH5α(supE44，ΔlacU169(Φ801acZΔM15)，hsdR17，recAi，endA1，gyrA96，thi-1，relA1)的感受态细胞。由数个在包含氨苄青霉素(50μg/ml)及卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂培养基(细菌用胰蛋白胨1％、酶提取液0.5％、NaCl 1％、琼脂1.5％)上生长的菌落制备质粒DNA，进行序列分析，确认了在各α亚单位基因中引入了目标变异。

[表10]

实施例11 变异酶的底物特异性的分析

使用实施例10获得的变异酶表达质粒，制造变异酶，研究底物特异性

(1)培养

用变异酶表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(F-，dcm，ompT，hsdS(rB-mB-)，gal，λ(DE3))的感受态细胞。将获得的转化体使用各3ml的LB培养基(含有卡那霉素25μg/ml)、用L形管在37℃下振荡培养一晚。将这些培养液接种在含有100ml的LB培养基(含有0.5％的甘油、0.05％的葡萄糖、0.2％的乳糖、100mM的PO₄ ^3-、25mM的SO₄ ^2-、50mM的NH₄ ⁺、100mM的Na⁺、50mM的K⁺、1mM的MgSO₄及卡那霉素25μg/ml)的500ml的斜口烧瓶中，在20℃下振荡培养24小时。

(2)粗制酶样品的制备

从上述培养的培养液中收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮在相对每0.1g湿菌体而言1ml的10mM的磷酸钾缓冲剂(PPB)(pH 7.0)中，进行超声波粉碎。将该悬浮液进行离心分离(10000r.p.m、10分钟、4℃)除去残渣，然后将上清液进行超离心分离(50,000r.p.m.60分钟、4℃)，将获得的上清液(水溶性级分)作为粗制酶样品。

(3)GDH活性的测定

在上述粗制酶试样10μl中添加170μl活性测定用试剂(在94μl的600mM吩嗪硫酸甲酯(PMS)、9.4μl的6mM的2，6-二氯靛酚(DCIP)中添加10mM的PPB，制成总量8ml的溶液)。在其中添加20μl的各浓度的底物(葡萄糖或麦芽糖)或蒸馏水并搅拌，使用分光光度计测定来自DCIP的吸收波长600nm的吸光度。各试剂的最终浓度为：DCIP：0.06mM、PMS：0.6mM。

结果示于表11。可以确认，无论哪种变异酶，与变异引入前的野生型酶相比，均呈现为与麦芽糖的反应性降低、对葡萄糖的底物特异性提高。

[表11]

以上结果表明，即使在洋葱伯克霍尔德菌以外的GDH同源物中，QYY变异也有效。

产业上的可应用性

本发明的变异GDH对葡萄糖的底物特异性提高，因此可以适用于使用葡萄糖传感器等的葡萄糖测定。

Claims (15)

1.变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于：

所述氨基酸序列的相应于326位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代；

对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。

2.如权利要求1所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90％的同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。

7.如权利要求1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于326位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。

8.如权利要求1～7中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于326位及365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。

9.如权利要求1～8中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。

10.变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含权利要求1～9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。

11.如权利要求10所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色素C。

12.编码权利要求1～9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。

13.微生物，其保持权利要求12所述的DNA，产生权利要求1～9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者权利要求10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。

14.葡萄糖检测试剂盒，其包含权利要求1～9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求13所述的微生物。

15.葡萄糖传感器，其包含权利要求1～9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求13所述的微生物。

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