JP2012090563A - 変異グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、前記アミノ酸配列の326位、365位および472位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。
【選択図】なし
Description
野生型CyGDHは、グルコースに対してマルトースの反応性が高く、グルコース濃度50mg/dL時において、マルトース濃度が100mg/dL時の血糖値計測結果は、170%高値を示す。
(1)配列番号3と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列の326位、365位および472位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。
(2)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、(1)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(3)326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(4)326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号7に示すアミノ酸配列を有する、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(5)326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号8に示すアミノ酸配列を有する、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(6)326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(7)326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号10に示すアミノ酸配列を有する、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(8)前記アミノ酸配列において326位および365位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが472位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、(1)〜(7)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(9)二糖類がマルトースであることを特徴とする(1)〜(8)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(10)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
(11)電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする(10)に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
(12)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
(13)(12)に記載のDNAを保持し、(1)〜(9)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、あるいは(10)または(11)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
(14)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、(10)または(11)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは(13)に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
(15)(1)〜(9)のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、(10)または(11)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは(13)に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
本発明の変異GDHは、野生型GDHのαサブユニットに特定の変異を導入することにより、製造することができる。野生型GDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するGDHが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのGDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアKS1株、JCM2800株又はJCM2801株が産生するGDHが挙げられる。KS1株は、平成12年9月25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に、受託番号第FERM BP−7306として寄託されている。
なお、配列番号7〜11に示したアミノ酸配列については、いずれもアメリカの国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information, NCBI)のデータベースに登録されている。それぞれの登録番号は、配列番号7がYP_002234347、配列番号8がZP_02370914、配列番号9がYP_002980762、配列番号10がYP_002260434、配列番号11がYP_001890482である。
また、ブルクホルデリア・セノセパシアJ2315株は、LMG 16656、ATCC BAA-245、CCM 4899、CCUG 48434、NCTC 13227として寄託されている。ブルクホルデリア・フィトフィルマンスPsJN株は、LMG 22487、CCUG 49060として寄託されている。
尚、CyGDHのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のGDH活性を損なわずに電子伝達サブユニット、すなわち、チトクロームCとして機能することをいう。
基質特異性=(グルコース以外の糖類に対する比活性/グルコースに対する比活性)×100)
基質特異性の向上=(A−B)×100/A
A:野生型酵素の基質特異性
B:変異型酵素の基質特異性
また、変異型GDHは、マルトースに対する反応性(比活性)が、グルコースに対する反応性(比活性)の1%以下、好ましくは0.5%以下である。
(1)配列番号3に示すアミノ酸配列の326位に相当するセリン残基のグルタミンへの置換。
(2)配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するセリン残基のチロシンへの置換。
(3)配列番号3に示すアミノ酸配列の472位に相当するアラニン残基のチロシンへの置換。
以下の表1において、配列番号3,7〜11のアミノ酸配列アライメントを示す。
(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「+」は同時に2つのアミノ酸置換を有することを示す。)
326Gln+365Tyr+472Tyr
αサブユニットをコードするDNAへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなDNA断片を用いてもよい。
αサブユニット又は野生型CyGDH複合体の反応性と比較することよって、決定することができる。
ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミドとして、GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、CyGDHを発現するプラスミドとして、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、WO02/036779(EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703Aに対応)に記載のプラスミドpTrc99A/γ+αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアKS1株(FERM BP−7306)染色体DNAから単離された、GDH γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むDNA断片が、ベクターpTrc99Aのクローニング部位であるNcoI/HindIIIに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のGDHγα遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99A/γ+αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
前記プラスミドpTrc99A/γ+αを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、GDHのαサブユニットC末端に6個のヒスチジン残基が付加されたDNA断片を含むプラスミド全体を増幅した。
5’−ACCACCACTGATAAGGAGGTCTGACCGTGCGGAAATCTAC−3’(配列番号17)
〔リバースプライマー〕
5’−AGCCTGTGCGACTTCTTCCTTCAGCGATCGGTGGTGGTGG−3’(配列番号18)
CyGDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようにして調製した。
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン 10g、酵母抽出液 1g、NaCl 5g、KH2PO4 2g、グルコース 5g;1L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、50℃で6時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で10分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、2倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、CyGDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするDNA断片を増幅した。
5’−CATGCCATGGCACACAACGACAACAC−3’(配列番号19)〔リバースプライマー〕
5’−GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC−3’(配列番号20)
(1)326位、365位、および472位への変異導入
実施例1で得られたpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの326位のセリン残基、365位のセリン残基、および472位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット(Stratagene社、QuikChangeII Site−Directed Mutagenesis Kit)を用いて、実施例1に記載のプラスミドpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の326位のセリンのコドン(TCG)、365位のセリンのコドン(TCG)、および472位のアラニンのコドン(GCG)を他のアミノ酸のコドンに置換した。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、R53Fは、53位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
鋳型DNA(5ng/μl) 2μl
(3変異導入pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ)
10×反応緩衝液 5μl
フォワードプライマー(100ng/μl) 1.25μl
リバースプライマー(100ng/μl) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸留水 38.5μl
DNAポリメラーゼ 1μl
合計 50μl
得られた反応液で、エシェリヒア・コリDH5α(supE44, ΔlacU169(φ80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi−1, relA1)のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)を含むLB寒天培地(バクトリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%)上に生育してきたコロニー数個からプラスミドDNAを調製し、配列解析を行って、GDH αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
実施例2で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。
変異導入したエシェリヒア・コリDH5α株を、各々2mlのLB培地(アンピシリン50μg/ml及びカナマイシン30μg/ml含有)で、L字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、150mlのLB培地(アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン30μg/ml含有)を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、37℃で振とう培養した。培養開始から3時間後にIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに2時間培養した。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.2% Triton X100を含む10mMリン酸カリウムバッファー(PPB)(pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー(カラム名:オクチルセファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー(Q−セファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.5M塩化ナトリウム、20mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。このサンプルを、0.5M塩化ナトリウム、20mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で平衡化したHistrap FFカラム(アマシャム・バイオサイエンス製)に添加し、0.5M塩化ナトリウム、60mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で洗浄した後、0.5M塩化ナトリウム、150mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で溶出させ、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
前記粗酵素サンプル8μlに、活性測定用試薬(12μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、120μlの6 mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、0.2(w/v)% Triton X−100 10mM PPBを加え、全量480μlとした溶液)を8μl添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で1分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質(グルコース又はマルトース)、または蒸留水を8μl加えて攪拌し、分光光度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600 nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS、0.6mM。基質の終濃度は10mMまたは5mMである。
結果を、表4に示す。尚、野生型GDHの反応比は、10mMまたは5mMの基質濃度において、それぞれ23.32%および18.88%であった。
すなわち、326位、365位、および472位の3箇所の変異の組み合わせのうちいくつかの組み合わせにおいて、変異GDH(QY)と同等またはそれ以上の相乗効果が確認された。
実施例3で基質特異性の改善が認められた8つの変異GDHについて精製を実施した。方法は実施例3に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性(U/mg)、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性)、グルコースに対するKm値およびVmaxを表5に示す。
その結果、QYAのマルトースとの反応比が、10mMおよび5mMにおいて、それぞれ1%台であるのに対し、ERYおよびKYTでは、反応比が1%以下まで低下し、QYYでは、マルトースとの反応比が0.3%台まで低下していた。
実施例3で基質特異性の改善が認められた変異CyGDH(QYY)について精製を実施した。方法は実施例3に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性(U/mg)を表6に示す。
その結果、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットの複合体の形態においては、QYY(326Gln+365Tyr+472Tyr)は、QYA(326Gln+365Tyr)と比較して、マルトースとの反応性が約1/2〜1/3に低下していた。
実施例2と同様にして、pTrc99A/γ+αに含まれるGDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの326位のセリン残基および365位のセリン残基をそれぞれグルタミンおよびチロシンに置換されるように、そして472位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、実施例3と同様にして、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。結果を以下の表7に示す。
実施例6で基質特異性の改善が認められた10種類の変異GDH(QYD、QYG、QYK、QYL、QYP、QYQ、QYR、QYT、QYV、およびQYY)について精製を実施した。方法は実施例3に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性(U/mg)、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性)、グルコースに対するKm値およびVmaxを表8に示す。
その結果、いずれの変異GDHについてもマルトースとの反応比は低いものの、QYYを除いて酵素活性が低下しており、グルコース濃度の測定には適していないことが示唆される。すなわち、QYXで示される10種類の変異GDHのうちで、QYYが最もグルコース濃度の測定に適していることが示唆される。
最も比活性が優れていたQYYに関して、実施例5で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖(50mg/dlグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の(174.8mg/dlグルコース)に見かけ上表示されてしまう(変化率は300%)。また、改変CyGDH(QY)を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって64.8mg/dlグルコースに見かけ上表示されてしまう(変化率は54%)。一方、改変CyGDH(QYY)を用いたセンサでは、マルトースが最大300mg/dl混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも46.1mg/dlまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える(変化率は14%)。結論としてはQYY変異体が、グルコースに対する反応性(直線性)とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
最も比活性が優れていたQYYに関して、実施例5で得られた精製変異酵素を用いて電極式グルコースセンサを作製した。
電極式グルコースセンサの作製方法を、図5を参照して以下に示す。絶縁基板1として、PET製基板(長さ28mm、幅7mm、厚み250μm)を準備し、その一方の表面に、カーボンインクのスクリーン印刷により、リード部2および3をそれぞれ有する作用極4および対極5からなるカーボン電極系を形成した。つぎに、絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷して絶縁層6とし、前記絶縁層を形成しない部分を検出部およびリード部とした。次に、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトSWN」(コープケミカル社製)0.6gを精製水100mLに懸濁し、約8〜24時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液10mLに、10%(w/v)CHAPS(同仁化学研究所製)水溶液0.1mL、1.0M ACES緩衝液(pH7.4:同仁化学研究所製)5.0mLおよび精製水4.0mLをこの順序で添加し、さらにメディエータとして[Ru(NH3)6]Cl3(アルドリッチ社製)1.0gを混合した。この混合液1.0μLを、検出部に分注した。そして、これを、30℃、相対湿度10%の条件下で10分間乾燥させて、試薬層7を形成した。さらに、前記試薬層7上に酵素試薬層8を形成した。これは、2700U/mLの本願発明のグルコース脱水素酵素水溶液1.0μLを、検出部の試薬層の上に分注して、30℃、相対湿度10%の条件下で10分間乾燥させて形成した。最後に、スリット15を有するスペーサー11を絶縁層上に配置し、さらに、前記スペーサー上に空気孔14となる貫通孔を有するカバー12を配置してバイオセンサを作製した。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖(50mg/dlグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の(288.2mg/dlグルコース)に見かけ上表示されてしまう(変化率は549%)。また、改変CyGDH(QY)を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって93.9mg/dlグルコースに見かけ上表示されてしまう(変化率は114%)。一方、改変CyGDH(QYY)を用いたセンサでは、マルトースが最大300mg/dl混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも60.0mg/dlまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える(変化率は37%)。結論としてはQYY変異体が、グルコースに対する反応性(直線性)とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
実施例1と同様にして、ブルクホルデリア・セノセパシアJ2315株のputative oxidoreductase、ブルクホルデリア・タイランデンシスTXDOH株のhypothetical protein BthaT#07876、ラルストニア・ピッケティ12D株のFAD dependent oxidoreductase、ラルストニア・ソラナセアラムIPO1609株のtransmembrane dehydrogenaseおよびブルクホルデリア・フィトフィルマンスPsJN株のglucose-methanol-choline oxidoreductaseの各αサブユニットおよびγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、R53Fは、53位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
鋳型DNA(5ng/μl) 2μl
(3変異導入pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ)
10×反応緩衝液 5μl
フォワードプライマー(100ng/μl) 1.25μl
リバースプライマー(100ng/μl) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸留水 38.5μl
DNAポリメラーゼ 1μl
合計 50μl
得られた反応液で、エシェリヒア・コリDH5α(supE44, ΔlacU169(φ80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi−1, relA1)のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)を含むLB寒天培地(バクトリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%)上に生育してきたコロニー数個からプラスミドDNAを調製し、配列解析を行って、各αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
実施例10で得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。
変異酵素発現プラスミドでエシェリヒア・コリBL21(DE3)(F−, dcm, ompT, hsdS(rB− mB−), gal, λ(DE3))のコンピンテントセルを形質転換した。得られた形質転換体を各々3mlのLB培地(カナマイシン25μg/ml含有)で、L字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、100mlのLB培地(0.5%グリセロール、0.05%グルコース、0.2%ラクトース、100mM PO4、 25mM SO4、50mM NH4、100mM Na、50mM K、1mM MgSO4およびカナマイシン25μg/ml含有)を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、20℃で24時間振とう培養した。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.1gあたり1mlの10mMリン酸カリウムバッファー(PPB)(pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液を遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。
前記粗酵素サンプル10μlに、活性測定用試薬(94μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、9.4μlの6mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、10mM PPBを加え、全量8mlとした溶液)を170μl添加した。これに各濃度の基質(グルコース又はマルトース)、または蒸留水を20μl加えて攪拌し、分光光度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS:0.6mMである。
結果を表11に示す。いずれの変異酵素も、変異導入前の野生型酵素に比べてマルトースへの反応性が低下しており、グルコースに対する基質特異性が向上していることが確認された。
Claims (15)
- 配列番号3と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列の326位、365位および472位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。 - 配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号7に示すアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号8に示すアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位、365位および472位に相当する位置以外は配列番号10に示すアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記アミノ酸配列において326位および365位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが472位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 二糖類がマルトースであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
- 電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする請求項10に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
- 請求項12に記載のDNAを保持し、請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、あるいは請求項10または11に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項10または11に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは請求項13に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項10または11に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは請求項13に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
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