JP2017075941A

JP2017075941A - 酵素電極

Info

Publication number: JP2017075941A
Application number: JP2016196930A
Authority: JP
Inventors: 幸治勝木; Koji Katsuki; 悠兼田; Yu Kaneda; 順子奥田; Junko Okuda
Original assignee: Arkray Inc; Ultizyme International Ltd
Current assignee: Arkray Inc; Ultizyme International Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2017-04-20
Anticipated expiration: 2036-10-05
Also published as: CN107037101A; JP6783108B2; CN107037101B

Abstract

【課題】製造コストの抑制且つ保存安定性向上を図る。【解決手段】電極と、電極と接触し、架橋剤，導電性高分子，及び電極との間で電子授受を行う酵素であって電子伝達サブユニットを含まない酵素を含む検知層とを含む酵素電極である。【選択図】図４

Description

本発明は、電荷移動律速電流を測定するための酵素電極に関する。

基材としての電極と、該電極の表面に酵素及び導電性粒子を架橋剤やバインダを用いて固定化した検知層とを含む酵素電極がある。酵素電極の中には、検知層中の酵素と電極との間で行われる電子の授受による電荷移動律速電流を測定して目的の物質の濃度を測定するものがある。

電荷移動律速電流を測定する酵素電極としては、例えば、検知層に酵素、導電性粒子及び架橋剤を含む酵素電極がある（例えば、特許文献１）。また、検知装置に酵素，導電性粒子，及び導電性高分子を含む酵素電極がある（例えば、特許文献２）。

特開２０１４−００６１５４号公報特開２０１４−００６１５５号公報

電荷移動律速電流を測定する酵素電極は、微量の試料中の目的物質の濃度を好適に測定し得る。しかし、特許文献１や特許文献２に開示された酵素電極については、製造コストや保存安定性の面において改良の余地がある。

本発明は、製造コストを抑えることができ、且つ保存安定性の向上を図ることのできる酵素電極を提供することを目的とする。

本発明の一側面は、電極と、前記電極と接触し、架橋剤，導電性高分子，及び前記電極との間で電子授受を行う酵素であって電子伝達サブユニットを含まない酵素を含む検知層とを含む酵素電極である。

本発明に係る酵素電極における酵素は、例えば、酸化還元酵素である。また、酵素は、例えば、電子伝達サブユニットを含まないチトクロムデヒドロゲナーゼである。

本発明の他の側面は、電極上に、前記電極と接触し、架橋剤，導電性高分子，及び前記電極との間で電子授受を行う酵素であって電子伝達サブユニットを含まない酵素を含む検知層を形成することを含む酵素電極の製造方法である。

本発明によれば、製造コストを抑えることができ、且つ保存安定性の向上を図ることのできる酵素電極を提供することが可能となる。

図１は、一実施形態に係る酵素電極の構造を模式的に示す図である。図２は、本発明の測定装置の一態様を示す模式図である。図３は、本発明の測定装置を用いた測定プログラムの一態様を示すフローチャートである。図４は、実施例１及び比較例１の酵素電極を用いて得られた応答電流値に基づいて作成された検量線の比較を示すグラフである。

以下、図面を参照して本発明の実施形態に係る酵素電極について説明する。以下に説明する実施形態の構成は例示であり、本発明は実施形態の構成に限定されない。

＜酵素電極の構成＞
図１は、実施形態に係る酵素電極を模式的に示した図である。図１において、酵素電極Ａは、電極１と、電極１の表面（図１では上面）に形成された検知層２とを備える。

（電極）
電極１は、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウムのような金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。電極１は、例えば、図１に示すような絶縁性基板３上に形成される。絶縁性基板３は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極１をなす電極材料及び絶縁性基板３の材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。電極１及び絶縁性基板３の大きさ、厚さは適宜設定可能である。以下、絶縁性基板３と電極１との組合せを「基材」と呼ぶこともある。

（検知層）
検知層２は、電極１と接触し、酵素４と、導電性高分子５と、糖６と、架橋剤７と、を含んでおり、電子メディエータを含んでいない。実施形態に係る酵素電極を用いて測定されるのは、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。これは、酵素と測定対象物質との反応によって、当該酵素から電極へ電子が移動することで生じる電流であり、時間に依存しない定常電流であり、好ましくは電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流である。

電荷移動律速電流を測定するためには、作用電極を“直接電子移動型の酵素電極”とすることが好ましい。ここで、“直接電子移動型の酵素電極”とは、試薬層で酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接に或いは導電性高分子を介して、電極に伝達されることで、酵素と電極との間の電子授受が行われるタイプの酵素電極である。

なお、電子伝達メディエータを用いる場合でも、電子伝達メディエータが固定化されており拡散しないような場合は電荷移動律速電流を測定することができる。

図１に示すように、検知層２内において、酵素４の分子は、架橋剤７によって架橋され、さらに、導電性高分子５によって複雑に絡み合った構造を有している。酵素反応により生じた電子は、直接的に、または、導電性を有する導電性高分子５を伝って電極１に移動することができる。すなわち、実施形態に係る酵素電極Ａは、検知層２における直接電子移動によって酵素４と電極１との間で電子授受が行われる。

なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は１−２ｎｍと云われており、電極と酵素から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、メディエータの移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。よって、検知層２内では、酵素４の活性部位（酵素反応により電子を生じる部位）と、導電性高分子５の導電性部位とが電子移動に好適な距離
関係、すなわち、好適な電子移動が起こる程度に導電性部位が活性部位と近い状態となっている。

（酵素）
酵素４は、例えば、酸化還元酵素が挙げられる。例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

また、酸化還元酵素は、触媒サブユニット及び触媒ドメインとして、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ（PQQGDH）が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つチトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）、グルコースオキシダーゼ（GOD）が挙
げられる。

また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニット若しくは、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達サブユニットとしては、例えば、電子授受の機能を持つヘムを有するサブユニットが挙げられる。このヘムを有するサブユニットを含む酸化還元酵素としては、チトクロムを含むものが挙げられ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼや、PQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。

また、電子伝達ドメインを含む酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh)が挙げられる。さらに、電子伝達ドメインは、電子授受の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、 "QHGDH" (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH)）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（Glucose-3-Dehydrogenase）（G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、上述したチトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質、及びチトクロムを含むドメインの例示であるPQQGDHのチトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。

また、酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子受容体の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。

但し、本実施形態では、酵素として、電子伝達サブユニット又は電子伝達ドメインを有
しない酸化還元酵素が用いられる。一例としては、チトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）が挙げられる。Ｃｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβと、触媒サブユニットαと、触媒サブユニットγとを有する。本実施形態では、酵素として、電子伝達サブユニットβを有しない（触媒サブユニットα及びγを有する）Ｃｙ−ＧＤＨを用いる。

電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨよりも安価に入手することができる。よって、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨが検知層２に含まれる酵素として適用されることで、酵素電極の製造コストを抑えることができる。

また、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨよりも物質としての安定性が高い。このことは、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨが適用された酵素電極（バイオセンサ）は、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨが適用された酵素電極（バイオセンサ）よりも長期保存が利くことを意味する。従って、製品寿命の長い、電荷移動律速測定型の酵素電極を得ることができる。

（導電性高分子）
導電性高分子５としては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。これらの市販品として、例えば、ポリピロールとして、例えば、「ＳＳＰＹ」（３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチル）（化研産業株式会社製）等がある。また、ポリアニリンとして、例えば「ＡｑｕａＰＡＳＳ０１−ｘ」（ティーエ
ーケミカル社製）等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」（東ソー有機化学株式会社製）等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー１００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー３００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））として、例えば、「ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ」（ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．，）等
がある。

また、様々な属性（例えば、水溶性）を有する導電性高分子を適用することができる。導電性高分子５の官能基は、水酸基又はスルホ基を有することが好ましい。

（糖）
検知層２は、酵素と架橋剤と導電性高分子に加えて、図１に示すように糖６を含むことができる。糖６は酵素４の基質とならない糖であり、糖６の構成糖の数は、例えば、１〜６であり、好ましくは２〜６である。これらはＤ体、Ｌ体のいずれであってもよく、またその混合物であっても良く、１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。ただし、グルコースなどの糖を測定対象とするときは、糖６として、測定対象の糖とは異なる糖であって、酵素４の基質とならない糖を用いる。

二糖類としては、キシロビオース、アガロビオース、カラビオース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、セロビオース、トレハロース、ネオトレハロース、イソトレハロース、イヌロビオース、ビシアノース、イソプリメベロース、サンブビオース、プリメベロース、ソラビオース、メリビオース、ラクトース、リコビオース、エピセロビオース、スクロース、ツラノース、マルツロース、ラクツロース、エピゲンチビオース、ロビノビオース、シラノビオース、ルチノース等が挙げられる。三糖類としては、グルコシルト
レハロース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレンジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロースなどが挙げられる。

四糖類としては、マルトシルトレハロース、マルトテトラオース、スタキオースなどが挙げられる。五糖類としては、マルトトリオシルトレハロース、マルトペンタオース、ベルバスコースなどが挙げられる。六糖類としてはマルトヘキサオースなどが挙げられる。

（架橋剤）
架橋剤７の種類として、具体的には、アルデヒド基含有化合物として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、シンナムアルデヒド、ニコチアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジプアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。カルボジイミド基含有化合物として、ヘキサメチレンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、１，１２−ジイソシアネートドデカン、ノルボルナンジイソシアネート、２，４−ビス−（８−イソシアネートオクチル）−１，３−ジオクチルシクロブタン、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどが挙げられる。またカルボジイミド基含有化合物はカルボジライトＶ−０２、カルボジライトＶ−０２−Ｌ２、カルボジライトＶ−０４、カルボジライトＶ−０６、カルボジライトＥ−０２、カルボジライトＶ−０１、カルボジライトＶ−
０３、カルボジライトＶ−０５、カルボジライトＶ−０７、カルボジライトＶ−０９（何れも商品名、日清紡績株式会社製）などとして市販されている。

マレイミド基含有化合物として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジル−２−マレイミド酢酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ-スク
シニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミドメチル安息香酸、Ｎ−スクシニジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ-スクシニ
ジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ,Ｎ’−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｏ−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｍ−フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−p−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ヘキサメチレン−ジマレイミド、Ｎ−スクシニジルマレイミド
カルボン酸などが挙げられる。また、サンフェルＢＭ−Ｇ（三新化学工業株式会社製）などの市販品も挙げられる。

オキサゾリン基含有化合物として、２，２’−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−メチレン− ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（２−オキサ
ゾリン）、２，２’−トリメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−テトラメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ヘキサメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−オクタメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、２，２’−ｐ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、ビス−
（２−オキサゾリニルシクロヘキサン）スルフィド、ビス−（２−オキサゾリニルノルボルナン）スルフィドなどのオキサゾリン化合物が挙げられる。

また、付加重合性オキサゾリン化合物として２−ビニル−２−オキサゾリン、２−ビニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−５−エチル−２−オキサゾリンなどが挙げられ、これらの１種もしくは２種以上の化合物を重合または共重合したものを使用可能である。

また、オキサゾリン基含有化合物は、エポクロスＷＳ−５００、エポクロスＷＳ−７００、エポクロスＫ−１０１０Ｅ、エポクロスＫ−１０２０Ｅ、エポクロスＫ−１０３０Ｅ、エポクロスＫ−２０１０Ｅ、エポクロスＫ−２０２０Ｅ、エポクロスＫ−２０３０Ｅ、エポクロスＲＰＳ−１００５、エポクロスＲＡＳ−１００５ (いずれも株式会社日本触媒社製)、ＮＫリンカーＦＸ(新中村化学工業株式会社製)などとして市販されている。

エポキシ基含有化合物として、具体的には、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、などが挙げられ、これらの化合物を２種以上併用して用いることもできる。またエポキシ基含有化合物は、デナコールＥＸ−６１１、デナコールＥＸ−６１２、デナコールＥＸ−６１４、デナコールＥＸ−６１４Ｂ、デナコールＥＸ−５１２、デナコールＥＸ−５２１、デナコールＥＸ−４２１、デナコールＥＸ−３１３、デナコールＥＸ−３１４、デナコールＥＸ−３２１、デナコールＥＸ−８１０、デナコールＥＸ−８１１、デナコールＥＸ−８５０、デナコールＥＸ−８５１、デナコールＥＸ−８２１、デナコールＥＸ−８３０、デナコールＥＸ−８３２、デナコールＥＸ−８４１、デナコールＥＸ−８６１、デナコールＥＸ−９１１、デナコールＥＸ−９４１、デナコールＥＸ−９２０、デナコールＥＸ−１４５、デナコールＥＸ−１７１（いずれも商品名、ナガセケムテックス株式会社製）、ＳＲ−ＰＧ、ＳＲ−２ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧＳ、ＳＲ−ＧＬＧ、ＳＲ−ＤＧＥ、ＳＲ−４ＧＬ、ＳＲ−４ＧＬＳ、ＳＲ−ＳＥＰ（いずれも商品名、阪本薬品工業株式会社製）、エポライト２００Ｅ、エポライト４００Ｅ、エポライト４００Ｐ（いずれも共栄社化学株式会社製）、などとして市販されている。

架橋剤の種類は、上記化合物、市販品に限定されず、アルデヒド基、マレイミド基、カルボジイミド基、オキサゾリン基、エポキシ基の少なくとも１つの官能基を含む化合物であってもよい。また架橋剤の形態も限定されず、モノマー、ポリマーの何れの形態であっても良い。

（導電性粒子）
検知層２は、さらに導電性粒子を含むことができる。導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、フラーレンのような、炭素粒子又は炭素微粒子を含むことができる。導電性カーボンブラックは、例えば、ケッチェンブラック（デグザ製）、ブラックパール（キャボット）などである。

なお、検知層２の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等
が挙げられる。

（酵素電極の作製方法）
上記した酵素電極Ａは、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板３の片面に、電極１として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板３の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。

次に、電極１上に検知層２が形成される。すなわち、酵素４、導電性高分子５、糖６、架橋剤７を含有する溶液（試薬）が調製される。ここで、糖の濃度は０．１〜２重量％が好ましく、０．２〜２重量％がより好ましい。溶液（試薬）は、電極１の表面に滴下される。溶液（試薬）が電極１上で乾燥により固化することで、電極１上に検知層２が形成された酵素電極Ａを得ることができる。

実施形態に係る酵素電極を用いることにより、試料中に含まれる被検物質の濃度を電荷移動律速電流に基づいて測定することができる。ここで、測定対象物質としては本発明の酵素電極を用いた測定方法によって測定可能な物質であれば特に制限されないが、生体由来の物質であって疾患や健康状態の指標となりうる物質であることが好ましく、例えば、グルコースやコレステロールなどが挙げられる。試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されないが、生体試料が好ましく、血液、尿などが挙げられる。

（バイオセンサ）
実施形態に係る酵素電極はグルコースセンサなどのバイオセンサに使用できる。バイオセンサは、酵素電極とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀／塩化銀電極を用いることができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、
物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極を参照極とした３電極系を用いてもよい。

（測定装置）
次に、実施形態に係る酵素電極を用いて物質の濃度を測定する測定装置について説明する。ここでは、酵素電極を用いたバイオセンサの一例であるグルコースセンサを使用したグルコース測定装置について例示する。但し、測定装置は、グルコース測定装置に限定されず、酵素電極（バイオセンサ）の測定対象物質によって測定装置の用途は変わる。

図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ１８，ポテンショスタット１９，電力供給装置１１が、筐体内に収容された基板２０上に設けられている。制御コンピュータ１８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（Central Processing Unit：中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access
Memory）,及びＲＯＭ（Read Only Memory））のような記録媒体と、通信ユニットとを含んでいる。

プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、制御コンピュータ１８は、出力部１０、制御部１２、演算部１３及び検出部１４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ１８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、プログラムやデー
タを記憶する補助記憶装置を含んでいても良い。

制御部１２は、電圧印加のタイミング，印加電圧値などを制御する。電力供給装置１１は、バッテリ１６を有しており、制御コンピュータ１８やポテンショスタット１９に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置１１は、筐体の外部に置くこともできる。

ポテンショスタット１９は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部１２によって制御される。ポテンショスタット１９は、端子ＣＲ，Ｗを用いて、グルコースセンサ１７の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部１４に送る。

演算部１３は検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、記憶する。出力部１０は、表示ユニット１５との間でデータ通信を行い、演算部１３による測定対象物質の濃度の演算結果を表示ユニット１５に送信する。表示ユニット１５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたグルコース濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。

図３は、制御コンピュータ１８によるグルコース濃度測定処理の例を示すフローチャートである。制御コンピュータ１８のＣＰＵ（制御部１２）は、グルコース濃度測定の開始指示を受け付ける。すると、制御部１２は、ポテンショスタット１９を制御して、作用極への所定の電圧を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。

次に、ポテンショスタット１９は、電圧印加によって得られる応答電流、すなわち、試料内の測定対象物質（ここではグルコース）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流、好ましくは、電気二重層の充電による過渡電流発生後、例えば、電圧印加から１〜２０秒後の定常電流を測定し、検出部１４へ送る（ステップＳ０２）。

演算部１３は、電流値に基づいて演算処理を行い、グルコース濃度を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ１８の演算部１３は、例えば、電極上に配置されたグルコースデヒドロゲナーゼに対応する、グルコース濃度の計算式またはグルコース濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてグルコース濃度を算出する。

出力部１０は、グルコース濃度の算出結果を、表示ユニット１５との間に形成された通信リンクを通じて表示ユニット１５へ送信する（ステップＳ０４）。その後、制御部１２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０５）、エラーがなければ測定を終了し、グルコース濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。また、算出結果を記憶媒体に保存し、後から算出結果を呼び出して、表示ユニット１５に表示し確認することも可能である。なお、図３の例では、算出結果の表示ユニット１５への送信（ステップＳ０４）後に、制御部１２による測定エラー検知（ステップＳ０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。

以下、酵素電極の実施例について説明する。

（試験１）
（試薬溶液の調製）
以下のような実施例１、比較例１に係る２種類の試薬溶液を調製した。
（実施例１）
（処方）
・ケッチェンブラック（三菱カーボンブラック製）０．６％
・導電性高分子：スルホン化ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ
、三菱レイヨン株式会社製）：０．２％
・オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700（日本触媒）：３．０％
・酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ：γα）：２．５ｍｇ／ｍＬ
・トレハロース：０．２５％（酵素の保護剤）
・リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）：５ｍＭ
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。

（比較例１）
（処方）
・ケッチェンブラック（三菱カーボンブラック製）：０．６％
・導電性高分子：スルホン化ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ
、三菱レイヨン株式会社製）：０．２％
・オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700（日本触媒）：３．０％
・酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ：γαβ）：２．３ｍｇ／ｍＬ
・トレハロース：０．２５％（酵素の保護剤）
・リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）：５ｍＭ
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。このように、比較例１の試薬溶液は、酵素としてサブユニットα，β及びγを有するＣｙ−ＧＤＨが用いられている点で、サブユニットα及びγを有するＣｙ−ＧＤＨを用いる実施例１の試薬溶液と異なる。

（酵素電極（試料）の作製）
次に、片面に金蒸着によって電極（電極層）が形成された複数の絶縁性基板（基材）を用意し、各絶縁性基板に実施例１、比較例１に係る試薬溶液を夫々分注し、低湿度乾燥炉で３０分間放置し、乾燥させた。このようにして、試薬が電極上で固化することにより検知層が形成された実施例１に係る酵素電極（試料）と、比較例１に係る酵素電極（試料）とを得た。

（グルコース濃度の測定）
次に、各酵素電極を用いて、グルコース濃度０，１００mg/dL，３００mg/dL，６００mg/dL，８００mg/dLにそれぞれ調整したヒト全血に対する応答電流値の測定を行った。グルコース測定は、電極上に形成された参照極・対極（共にカーボン）、参照極（銀/塩化銀
）を用い、作用極への印加電圧を＋２００mV（vs.銀/塩化銀）で測定を行った。

（測定結果の評価）
図４は、実施例１及び比較例１の酵素電極を用いて得られた応答電流値に基づいて作成された検量線の比較を示すグラフである。図４に示すように、γα（実施例１）は、γαβ（比較例１）に比べて応答電流値が小さいが、検量線の直線範囲は、充分にグルコースセンサとしての実用に耐えるものであることが分かる。このように、試験１によれば、製造コストを抑えることができ、且つ検知層２の品質の安定性が向上した酵素電極を提供することが可能となる。

実施例１に係る酵素電極は、電荷移動律速電流を測定するものであるので、従来のメディエータを用いる酵素電極のように、物質の拡散状況によって測定値にばらつきがでることを回避し得る。このように、実施形態に係る酵素電極によれば、メディエータを用いる酵素電極よりも定量的な測定が可能であり（測定精度が高く）、保存安定性が向上した酵
素電極を安価に提供し得る。

Ａ・・・酵素電極
１・・・電極
２・・・検知層
３・・・絶縁性基板
４・・・酵素
５・・・導電性高分子
６・・・糖
７・・・架橋剤（主鎖）
７’・・・架橋剤（側鎖）
Ｂ・・・測定装置
１０・・・出力部
１１・・・電力供給装置
１２・・・制御部
１３・・・演算部
１４・・・検出部
１５・・・表示ユニット
１６・・・バッテリ
１７・・・グルコースセンサ
１８・・・制御コンピュータ
１９・・・ポテンショスタット
２０・・・基板
ＣＲ、Ｗ・・・端子

Claims

電極と、
前記電極と接触し、架橋剤，導電性高分子，及び前記電極との間で電子授受を行う酵素であって電子伝達サブユニットを含まない酵素を含む検知層と
を含む酵素電極。
前記酵素が酸化還元酵素である
請求項１に記載の酵素電極。
前記酵素が、電子伝達サブユニットを含まないチトクロムデヒドロゲナーゼである
請求項１又は２に記載の酵素電極。
電極上に、前記電極と接触し、架橋剤，導電性高分子，及び前記電極との間で電子授受を行う酵素であって電子伝達サブユニットを含まない酵素を含む検知層を形成する
ことを含む酵素電極の製造方法。