JP6783109B2

JP6783109B2 - バイオセンサ

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Publication number: JP6783109B2
Application number: JP2016197098A
Authority: JP
Inventors: 恵佐永田; 順子奥田
Original assignee: Arkray Inc; Ultizyme International Ltd
Current assignee: Arkray Inc; Ultizyme International Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2020-11-11
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Also published as: JP2017075942A; CN106940339A

Description

本発明は、電荷移動律速電流を測定するためのバイオセンサに関する。

基材としての電極と、該電極の表面に酵素及び導電性粒子を架橋剤やバインダを用いて固定化した検知層とを含む酵素電極がある。酵素電極は、酵素反応により生じた電子を受け渡す構造を有する。検知層に酵素、導電性粒子及び架橋剤を含む酵素電極がある（例えば、特許文献１）。また、検知層に酵素、導電性粒子及び導電性高分子を含む酵素電極がある（例えば、特許文献２）。

特開２０１４−００６１５４号公報特開２０１４−００６１５５号公報

特許文献１及び特許文献２の酵素電極には、参照極として銀塩化銀（Ag／AgCl）電極が用いられている。銀塩化銀電極は酸化すると、電極特性が劣化するという問題がある。本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、電極特性の劣化を抑止することができるバイオセンサを提供することを目的とする。

本発明の一側面は、作用極と、対極と、参照極と、前記作用極と接触し、架橋剤，導電性高分子及び前記作用極との間で電子授受を行う酵素を含む検知層と、を備え、前記参照極が分極性電極であるバイオセンサである。

本発明に係るバイオセンサにおける前記作用極及び前記対極が分極性電極であり、前記作用極、前記対極及び前記参照極が、同一の材料で形成されている。本発明に係るバイオセンサにおける前記参照極がカーボン、金、白金又はパラジウムである。

本発明によれば、電極特性の劣化を抑止することができるバイオセンサを提供することが可能となる。

図１は、実施形態に係るバイオセンサの模式図である。図２は、実施形態に係る酵素電極の模式図である。図３は、実施形態に係る測定装置の構成の一例を示す図である。図４は、制御コンピュータによる測定対象物質の濃度測定処理の一例を示すフローチャートである。図５は、試験１の測定結果を示す図である。図６は、比較例１の測定結果を示す図である。図７は、試験１の測定結果及び比較例１の測定結果を示す図である。図８は、試験２の測定結果を示す図である。図９は、比較例２の測定結果を示す図である。図１０は、試験２の測定結果及び比較例２の測定結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。以下に挙げる実施形態はそれぞれ例示であり、本発明は以下の実施形態の構成に限定されない。

（バイオセンサ）
図１は、実施形態に係るバイオセンサ１の模式図であって、バイオセンサ１を部分的に拡大して示している。図１に示すように、バイオセンサ１は、基板２、作用極（作用電極）３、対極（対電極）４、参照極（参照電極）５及び検知層６を備える。作用極３、対極４、及び参照極５は、基板２の上面に形成されている。検知層６は、作用極３上に形成されている。また、バイオセンサ１は、図示しないスペーサ及びカバーを備える。基板２上にスペーサが設けられ、スペーサ上にカバーが設けられることにより、バイオセンサ１の内部にキャピラリが形成される。作用極３にはリード線７が電気的に接続され、対極４にはリード線８が電気的に接続され、参照極５にはリード線９が電気的に接続されている。リード線７、８及び９は、後述する測定装置の端子と電気的に接続される。

基板２、スペーサ及びカバーは、例えば、熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、ガラス、セラミック、紙等の絶縁性材料で形成される。熱可塑性樹脂は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリエチレン（ＰＥ）等を含む。基板２、スペーサ及びカバーの材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。基板２、スペーサ及びカバーの大きさ及び厚さ等のサイズは、適宜設定可能である。

作用極３、対極４及び参照極５は、例えば、金（Au），白金（Pt），パラジウム、ルテニウム等の金属材料、或いはカーボン等の炭素材料を用いて形成される。これらの電極材料は、分極性の特性を持つ。したがって、作用極３、対極４及び参照極５は、分極性電極である。分極性電極は、ある電位範囲において外部機器等によって、分極する（電位が変化する）ことが容易な電極である。これに対して、非分極性電極は、外部機器等によって、分極させようとすると、大きな電流が流れるため、分極が起きにくい電極である。銀塩化銀電極は、非分極性電極の一例である。参照極は、非分極性電極を使用することが知られていたが、本願発明では、誠意研究の結果、参照極に分極性電極を用いることが可能であることを見出した。実施形態に係るバイオセンサ１は、分極性電極を参照極５として用いており、銀塩化銀電極を参照極５として用いていない。金，白金，パラジウム，ルテニウム等の金属材料、或いはカーボン等の炭素材料を用いて形成された電極（分極性電極）は、銀塩化銀電極と比較して、酸化に対する耐性が高い。したがって、金，白金，パラジウム，ルテニウム等の金属材料、或いはカーボン等の炭素材料を用いて形成された電極（分極性電極）は、銀塩化銀電極と比較して、電極特性の劣化が抑制される。

作用極３、対極４及び参照極５の材料は、同一であってもよいし、それぞれ異なってもよい。例えば、作用極３、対極４及び参照極５を、金，白金，パラジウム，ルテニウム及びカーボンのうちの何れか一つを用いて形成してもよい。また、例えば、金を用いて作用極３及び対極４を形成し、カーボンを用いて参照極５を形成してもよいし、或いは、カーボンを用いて作用極３及び対極４を形成し、金を用いて参照極５を形成してもよい。更に、他の遷移金属を用いて作用極３、対極４及び参照極５を形成してもよい。

（酵素電極の構成）
図２は、実施形態に係る酵素電極の模式図である。図２において、酵素電極１１は、作用極３と、作用極３の表面（図１では上面）に形成された検知層６とを備える。

（検知層）
検知層６は、作用極３と接触し、酵素１２と、導電性高分子１３と、糖１４と、架橋剤１５と、を含んでおり、電子メディエータを含んでいない。

実施形態に係る酵素電極１１を用いて測定されるのは、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。これは、酵素１２と測定対象物質との反応によって、酵素１２から電極へ電子が移動する際に生じる電流であり、時間に依存しない定常電流であり、好ましくは電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流である。

電荷移動律速電流を測定するためには、作用極３を“直接電子移動型の酵素電極”とすることが好ましい。ここで、“直接電子移動型の酵素電極”とは、試薬層で酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接（導電性高分子１３を介する場合も含む）、電極に伝達されることにより、酵素と電極間の電子授受が行われるタイプの酵素電極である。なお、電子伝達メディエータを用いる場合でも、電子伝達メディエータが固定化されており拡散しないような場合は電荷移動律速電流を測定することができる。

図２に示すように、検知層６内において、酵素１２の分子は、架橋剤１５によって架橋され、さらに、導電性高分子１３によって複雑に絡み合った構造を有している。酵素反応により生じた電子は、直接的に、または、導電性を有する導電性高分子１３を伝って作用極３に移動することができる。すなわち、実施形態に係る酵素電極１１は、検知層６における直接電子移動によって作用極３と酵素１２との間で電子授受が行われる。

なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は１０−２０Åと云われており、電極と酵素から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、メディエータの移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。よって、検知層６内では、酵素１２の活性部位（酵素反応により電子を生じる部位）と、導電性高分子１３の導電性部位とが電子移動に好適な距離関係、すなわち、好適な電子移動が起こる程度に導電性部位が活性部位と近い状態となっている。

（酵素）
酵素１２は、例えば、酸化還元酵素が挙げられる。例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７βデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、酵素１２は、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

また、酸化還元酵素は、触媒サブユニット及び触媒ドメインとして、ピロロキノリンキ
ノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ（PQQGDH）が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つチトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）、グルコースオキシダーゼ（GOD）が挙
げられる。また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニット若しくは、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達サブユニットとしては、例えば、電子授受の機能を持つヘムを有するサブユニット挙げられる。このヘムを有するサブユニットを含む酸化還元酵素としては、チトクロムを含むものが挙げられ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼや、PQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。

また、電子伝達ドメインを含む酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh)が挙げられる。さらに、電子伝達ドメインは、電子授受の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、 "QHGDH" (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH)）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（Glucose-3-Dehydrogenase）（G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、上述したチトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質、及びチトクロムを含むドメインの例示であるPQQGDHのチトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。また
、酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子受容体の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。

（導電性高分子）
導電性高分子１３としては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。これらの市販品として、例えば、ポリピロールとして、例えば、「ＳＳＰＹ」（３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチル）（化研産業株式会社製）等がある。また、ポリアニリンとして、例えば「ＡｑｕａＰＡＳＳ０１−ｘ」（ティー
エーケミカル社製）等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」（東ソー有機化学株式会社製）等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー１００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー３００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））として、例えば、「ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ」（ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）等
がある。また、様々な属性（例えば、水溶性）を有する導電性高分子を適用することができる。導電性高分子１３の官能基は、水酸基又はスルホ基を有することが好ましい。

（糖）
糖１４は酵素１２の基質とならない糖であり、糖１４の構成糖の数は、例えば、１〜６であり、好ましくは２〜６である。これらはＤ体、Ｌ体のいずれであってもよく、またその混合物であっても良く、１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。ただし、グルコースなどの糖を測定対象とするときは、糖１４として、測定対象の糖とは異なる糖であって、酵素１２の基質とならない糖を用いる。二糖類としては、キシロビオース、アガロビオース、カラビオース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、セロビオース、トレハロース、ネオトレハロース、イソトレハロース、イヌロビオース、ビシアノース、イソプリメベロース、サンブビオース、プリメベロース、ソラビオース、メリビオース、ラクトース、リコビオース、エピセロビオース、スクロース、ツラノー
ス、マルツロース、ラクツロース、エピゲンチビオース、ロビノビオース、シラノビオース、ルチノース等が挙げられる。三糖類としては、グルコシルトレハロース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレンジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロースなどが挙げられる。四糖類としては、マルトシルトレハロース、マルトテトラオース、スタキオースなどが挙げられる。五糖類としては、マルトトリオシルトレハロース、マルトペンタオース、ベルバスコースなどが挙げられる。六糖類としてはマルトヘキサオースなどが挙げられる。

（架橋剤）
架橋剤１５の種類として、具体的には、アルデヒド基含有化合物として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、シンナムアルデヒド、ニコチアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジプアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。カルボジイミド基含有化合物として、ヘキサメチレンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、１，１２−ジイソシアネートドデカン、ノルボルナンジイソシアネート、２，４−ビス−（８−イソシアネートオクチル）−１，３−ジオクチルシクロブタン、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどが挙げられる。またカルボジイミド基含有化合物はカルボジライトＶ−０２、カルボジライトＶ−０２−Ｌ２、カルボジライトＶ−０４、カルボジライトＶ−０６、カルボジライトＥ−０２、カルボジライトＶ−０１、カルボジライトＶ−０３、カルボジライトＶ−０５、カルボジライトＶ−０７、カルボジライトＶ−０９（何れも商品名、日清紡績株式会社製）などとして市販されている。マレイミド基含有化合物として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジル−２−マレイミド酢酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ-スクシニジル−４−マレイミド
メチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミドメチル安息香酸、Ｎ−スクシニジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ-スクシニジル−４−マレイミドフェ
ニル−４−酪酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ,Ｎ
’−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｏ−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ
’−ｍ−フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−p−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’
−ヘキサメチレン−ジマレイミド、Ｎ−スクシニジルマレイミドカルボン酸などが挙げられる。また、サンフェルＢＭ−Ｇ（三新化学工業株式会社製）などの市販品も挙げられる。オキサゾリン基含有化合物として、２，２’−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−メチレン− ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（２−オキサ
ゾリン）、２，２’−トリメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−テトラメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ヘキサメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−オクタメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、２，２’−ｐ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、ビス−（２−オキサゾリニルシクロヘキサン）スルフィド、ビス−（２−オキサゾリニルノルボルナン）スルフィドなどのオキサゾリン化合物。また、付加重合性オキサゾリン化合物として２−ビニル−２−オキサゾリン、２−ビニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−
ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−５−エチル−２−オキサゾリンなどが挙げられ、これらの１種もしくは２種以上の化合物を重合または共重合したものを使用可能である。またオキサゾリン基含有化合物は、エポクロスＷＳ−５００、エポクロスＷＳ−７００、エポクロスＫ−１０１０Ｅ、エポクロスＫ−１０２０Ｅ、エポクロスＫ−１０３０Ｅ、エポクロスＫ−２０１０Ｅ、エポクロスＫ−２０２０Ｅ、エポクロスＫ−２０３０Ｅ、エポクロスＲＰＳ−１００５、エポクロスＲＡＳ−１００５
(いずれも株式会社日本触媒社製)、ＮＫリンカーＦＸ(新中村化学工業株式会社製)など
として市販されている。エポキシ基含有化合物として、具体的には、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、などが挙げられ、これらの化合物を２種以上併用して用いることもできる。またエポキシ基含有化合物は、デナコールＥＸ−６１１、デナコールＥＸ−６１２、デナコールＥＸ−６１４、デナコールＥＸ−６１４Ｂ、デナコールＥＸ−５１２、デナコールＥＸ−５２１、デナコールＥＸ−４２１、デナコールＥＸ−３１３、デナコールＥＸ−３１４、デナコールＥＸ−３２１、デナコールＥＸ−８１０、デナコールＥＸ−８１１、デナコールＥＸ−８５０、デナコールＥＸ−８５１、デナコールＥＸ−８２１、デナコールＥＸ−８３０、デナコールＥＸ−８３２、デナコールＥＸ−８４１、デナコールＥＸ−８６１、デナコールＥＸ−９１１、デナコールＥＸ−９４１、デナコールＥＸ−９２０、デナコールＥＸ−１４５、デナコールＥＸ−１７１（いずれも商品名、ナガセケムテックス株式会社製）、ＳＲ−ＰＧ、ＳＲ−２ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧＳ、ＳＲ−ＧＬＧ、ＳＲ−ＤＧＥ、ＳＲ−４ＧＬ、ＳＲ−４ＧＬＳ、ＳＲ−ＳＥＰ（いずれも商品名、阪本薬品工業株式会社製）、エポライト２００Ｅ、エポライト４００Ｅ、エポライト４００Ｐ（いずれも共栄社化学株式会社製）、などとして市販されている。架橋剤の種類は、上記化合物、市販品に限定されず、アルデヒド基、マレイミド基、カルボジイミド基、オキサゾリン基、エポキシ基の少なくとも１つの官能基を含む化合物であってもよい。また架橋剤の形態も限定されず、モノマー、ポリマーの何れの形態であっても良い。

（導電性粒子）
検知層６はさらに導電性粒子を含むことが好ましい。導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、フラーレンから選択される微粒子（炭素微粒子）の１種以上を含有することができる。

なお、検知層６の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等が挙げられる。

（酵素電極の作製方法）
上記した酵素電極１１は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、基板２の片面に、作用極３、対極４及び参照極５として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の基板２の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、スクリーン印刷により成膜したカーボン等の炭素材料で形成された電極層を形成する
こともできる。

作用極３、対極４及び参照極５を同一の材料で形成する場合、作用極３、対極４及び参照極５の形成を同一工程で行うことが可能となる。例えば、カーボンを用いて作用極３及び対極４を形成し、銀塩化銀を用いて参照極５を形成する場合、作用極３及び対極４を形成するための印刷工程と、参照極５を形成するための印刷工程とが別工程となる。一方、例えば、カーボンを用いて作用極３、対極４及び参照極５を形成する場合、作用極３、対極４及び参照極５を形成するための印刷工程が同一工程となり、銀塩化銀電極を形成するための印刷工程を省くことが可能となる。したがって、作用極３、対極４及び参照極５の形成を同一工程で行うことにより、バイオセンサ１の製造コストを下げることが可能となる。

次に、作用極３上に検知層６が形成される。すなわち、酵素１２、導電性高分子１３、糖１４及び架橋剤１５を含有する溶液（試薬）が調製される。ここで、糖１４の濃度は０．１〜２重量％が好ましく、０．２〜２重量％がより好ましい。溶液（試薬）は、作用極３の表面に滴下される。溶液（試薬）が作用極３上で乾燥により固化することで、作用極３上に検知層６が形成された酵素電極１１を得ることができる。

実施形態に係る酵素電極１１を用いることにより、試料中に含まれる被検物質の濃度を電荷移動律速電流に基づいて測定することができる。ここで、測定対象物質としては酵素電極１１を用いた測定方法によって測定可能な物質であれば特に制限されないが、生体由来の物質であって疾患や健康状態の指標となりうる物質であることが好ましく、例えば、グルコースやコレステロールなどが挙げられる。試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されないが、生体試料が好ましく、血液、尿などが挙げられる。

（装置）
次に、実施形態に係る測定装置について説明する。図３は、実施形態に係る測定装置２０の構成の一例を示す図である。図３には、測定装置２０内に収容された主な電子部品の構成が示されている。測定装置２０は、制御コンピュータ２１、ポテンショスタット２２、電力供給装置２３及び表示装置２４を備える。制御コンピュータ２１、ポテンショスタット２２及び電力供給装置２３は、筐体２５内に収容された基板上に設けられている。

制御コンピュータ２１は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（Central Processing Unit）
のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory））のような記憶装置と、通信ユニットとを有している。プロセッサが、ＲＯＭに記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして、プログラムを実行することによって、出力部３０、制御部３１、演算部３２及び検出部３３を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ２１は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいても良い。

制御部３１は、電圧印加のタイミング、印加電圧値などを制御する。電力供給装置２３は、バッテリ２６を有しており、制御コンピュータ２１やポテンショスタット２２に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置２３は、筐体２５の外部に置くこともできる。ポテンショスタット２２は、作用極３の電位を参照極５に対して一定にする装置であり、制御部３１によって制御され、端子ＣＲ，Ｗを用いて、バイオセンサ１の作用極３と対極４との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用極３の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部３３に送る。

演算部３２は、検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、測定対象物質の濃度の演算結果を記憶装置に記憶する。出力部３０は、表示装置２４との間でデータ通
信を行い、測定対象物質の濃度の演算結果を表示装置２４に送信する。表示装置２４は、例えば、測定対象物質の濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。

図４は、制御コンピュータ２１による測定対象物質の濃度測定処理の一例を示すフローチャートである。制御部３１は、測定対象物質の濃度測定の開始指示を受け付けると、ポテンショスタット２２を制御して、作用極３に所定の電圧を印加し、作用極３からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ１０１）。なお、測定装置２０に対するバイオセンサ１の装着の検知を、濃度測定の開始指示としてもよい。

次に、ポテンショスタット２２は、電圧印加によって得られる応答電流を測定し、応答電流値を検出部３３へ送る（ステップＳ１０２）。これにより、検出部３３は、応答電流を検出する。応答電流は、試料内の測定対象物質（ここではグルコース）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。好ましくは、応答電流は、電気二重層の充電による過渡電流発生後、例えば、電圧印加から１〜２０秒後の定常電流である。

演算部３２は、応答電流値に基づいて演算処理を行い、グルコース濃度を算出する（ステップＳ１０３）。例えば、演算部３２は、作用極３上に配置されたグルコースデヒドロゲナーゼに対応する、グルコース濃度の計算式又はグルコース濃度の検量線データを予め保持している。演算部３２は、グルコース濃度の計算式又はグルコース濃度の検量線データを用いてグルコース濃度を算出する。

出力部３０は、グルコース濃度の算出結果を、表示装置２４との間に形成された通信リンクを通じて表示装置２４へ送信する（ステップＳ１０４）。その後、制御部３１は、測定エラーの有無を検知する（ステップＳ１０５）。制御部３１がエラーを検知しなかった場合（ステップＳ１０５：ＮＯ）、制御部３１は測定を終了し、グルコース濃度を表示装置２４に表示する。その後、図４のフローによる処理が終了する。一方、制御部３１がエラーを検出した場合（ステップＳ１０５：ＹＥＳ）、制御部３１はエラーを表示装置２４に表示する（ステップＳ１０６）。その後、図４のフローによる処理が終了する。

また、制御部３１は算出結果を記憶装置に保存し、任意のタイミングで記憶装置から算出結果を読み出して、表示装置２４に表示してもよい。ユーザは、算出結果を任意のタイミングで確認することが可能である。なお、ここでは、算出結果の表示装置２４への送信（ステップＳ１０４）後に、制御部３１による測定エラー検知（ステップＳ１０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。上記では、測定対象物質がグルコースである場合の濃度測定処理を示したが、実施形態はこの濃度測定処理に限定されない。測定対象物質は、グルコースに限らず、他の物質であってもよい。

以下、グルコース濃度の測定試験について説明する。下記の試験１及び比較例１では、３電極系（作用極、対極及び参照極）を用いて、グルコース濃度を０ｍｇ／ｄＬ，１００ｍｇ／ｄＬ，３００ｍｇ／ｄＬ，６００ｍｇ／ｄＬ，８００ｍｇ／ｄＬに調整した各試料に対する応答電流値の測定を行った。下記の試験２及び比較例２では、上記の３電極系を用いて、グルコース濃度を０ｍｇ／ｄＬ，１００ｍｇ／ｄＬ，６００ｍｇ／ｄＬに調整した各試料に対する応答電流値の測定を行った。また、下記の試験１、比較例１、試験２及び比較例２では、上記の３電極系を用いて、２６℃（±１℃）の温度にて、２００ｍＶの電位差を電極系に印加するクロノアンペロメトリー法により、応答電流値の測定を行った。

〈試験１〉
試験１における各電極の材料を以下に示す。
・作用極（ＷＥ）：カーボン（面積０．５ｍｍ^２）
・対極（ＣＥ）：カーボン（面積４．８ｍｍ^２）
・参照極（ＲＥ）：カーボン（面積０．５ｍｍ^２）
〈比較例１〉
比較例１における各電極の材料を以下に示す。
・作用極（ＷＥ）：カーボン（面積０．５ｍｍ^２）
・対極（ＣＥ）：カーボン（面積４．８ｍｍ^２）
・参照極（ＲＥ）：銀塩化銀（面積０．５ｍｍ^２）

〈測定結果〉
図５は、試験１の測定結果を示す図である。図６は、比較例１の測定結果を示す図である。図５及び図６では、応答電流値の経時変化（タイムコース）がグラフ化されている。図７は、試験１の測定結果及び比較例１の測定結果を示す図である。図７では、試験１の測定結果及び比較例１の測定結果について、電圧の印加が開始されてから８秒後（電流ピークの５秒後）の応答電流値が、グルコース濃度ごとにプロットされている。図５〜図７に示すように、参照極の材料をカーボンとする場合、参照極の材料を銀塩化銀とする場合と同様の応答電流値が測定されている。

〈試験２〉
試験２における各電極の材料を以下に示す。
・作用極（ＷＥ）：カーボン（面積０．５ｍｍ^２）
・対極（ＣＥ）：カーボン（面積４．８ｍｍ^２）
・参照極（ＲＥ）：金（面積０．５ｍｍ^２）
〈比較例２〉
比較例２における各電極の材料を以下に示す。
・作用極（ＷＥ）：カーボン（面積０．５ｍｍ^２）
・対極（ＣＥ）：カーボン（面積４．８ｍｍ^２）
・参照極（ＲＥ）：銀塩化銀（面積０．５ｍｍ^２）

〈測定結果〉
図８は、試験２の測定結果を示す図である。図９は、比較例２の測定結果を示す図である。図８及び図９では、応答電流値の経時変化（タイムコース）がグラフ化されている。図１０は、試験２の測定結果及び比較例２の測定結果を示す図である。図１０では、試験２の測定結果及び比較例２の測定結果について、電圧の印加が開始されてから５秒後の応答電流値が、グルコース濃度ごとにプロットされている。図８〜図１０に示すように、参照極の材料を金とする場合、参照極の材料を銀塩化銀とする場合と同様の応答電流値が測定されている。

上記の試験１では、参照極の材料をカーボンとし、上記の試験２では、参照極の材料を金とする場合の例を示した。実施形態に係る参照極の材料は、カーボン及び金に限定されず、白金及びパラジウム、ルテニウム等の金属材料、或いは他の炭素材料であってもよい。

１・・・バイオセンサ
２・・・基板
３・・・作用極
４・・・対極
５・・・参照極
６・・・検知層
７、８、９・・・リード線
１１・・・酵素電極
１２・・・酵素
１３・・・導電性高分子
１４・・・糖
１５・・・架橋剤
２０・・・測定装置
２１・・・制御コンピュータ
２２・・・ポテンショスタット
２３・・・電力供給装置
２４・・・表示装置
２５・・・筐体
２６・・・バッテリ
３０・・・出力部
３１・・・制御部
３２・・・演算部
３３・・・検出部

Claims

作用極と、
対極と、
参照極と、
前記作用極と接触し、架橋剤，導電性高分子及び前記作用極との間で電子授受を行う酵素を含む検知層と、
を備え、
前記参照極が、分極性電極であり、ルテニウムであるバイオセンサ。
前記作用極及び前記対極が分極性電極であり、
前記作用極、前記対極及び前記参照極が、同一の材料で形成されている
請求項１に記載のバイオセンサ。