JP2014006155A - 酵素電極 - Google Patents

Abstract

【課題】熱耐性の向上した酵素電極の提供。
【解決手段】酵素電極は、電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層と、を含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、酵素電極に関する。

電極と、電極上に形成された酵素を含む検知層とを備えた酵素電極がある。酵素電極は、酵素反応により生じた電子を電極から取り出す構造を有する。

特開平０１−０７５９５６号公報 特開昭６３−０５０７４８号公報

一般的に、酵素電極の検知層に含まれた酵素が不活状態となると、酵素電極としての機能が損なわれる。酵素の不括化要因の一つには、熱による劣化がある。例えば、保管や輸送時における環境下で、酵素電極に不括化の要因となる熱が加わる可能性がある。また、酵素電極の使用中においても、熱が加わる可能性がある。酵素電極が好適な熱耐性を示すことは、酵素電極の寿命を延ばす意味において好ましい。

本発明の一側面は、熱耐性の向上した酵素電極を提供することを目的とする。

本発明の一側面は、上述した目的を達成するために、以下の構成を採用する。すなわち、本発明の一側面は、電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層と、
を含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする。上記導電性ポリマーは、例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェンの中から少なくとも１つが選択される、また、上記導電性ポリマーの官能基は、水酸基またはスルホ基を含む。また、前記酵素は、酸化還元酵素である。

また、本発明の一側面における、上記電極と上記検知層との少なくとも一方は、導電性粒子を含むのが好ましい。

また、本発明の一側面に係る酵素電極は、熱耐性が向上したことを特徴とする。

本発明の他の側面の一つは、電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層とを含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われる酵素電極を備えたバイオセンサである。

また、本発明の他の側面の一つは、上記バイオセンサを含む電子機器である。

また、本発明の他の側面の一つは、電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層とを含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われを含む酵素電極と、前記酵素電極での酵素反応によって生じた電流を負荷に供給する供給部とを含む装置である。また本発明の他の側面の一つは、上記装置を含む電子機器である。

また、本発明の他の側面の一つは、電極上に、酵素と、水溶性の導電性ポリマーを含む、直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受を行う検知層を形成する、ことを含む酵素電極の製造方法である。

また、本発明の他の側面の一つは、酵素と、導電性ポリマーと、を含み、熱耐性を向上させたことを特徴とする試薬である。

本発明の一側面によれば、熱耐性の向上した酵素電極を提供することができる。

図１は、実施形態に係る酵素電極の構造を模式的に示す図である。 図２は、検知層内を模式的に示す図である。 図３は、熱処理の時間を固定した場合における、熱処理時の温度と応答電流との関係を示すグラフである。 図４は、熱処理の温度を固定し、熱処理の時間を変動させた場合における時間と応答電流との関係を示すグラフである。 図５は、導電性ポリマーの濃度と熱耐性との関係を示すグラフである。 図６は、導電性ポリマーの濃度と熱耐性との関係を示すグラフである。

以下、本発明の一実施形態としての酵素電極について図面を参照して説明する。以下に挙げる実施形態はそれぞれ例示であり、本発明は以下の実施形態の構成に限定されない。

（酵素電極の構成）
図１は、実施形態に係る酵素電極の側面を模式的に示した図である。図１において、酵素電極１０は、電極１と、電極１の表面（図１では上面）に形成された検知層２とを備える。

（電極）
電極１は、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウムのような金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。電極１は、例えば、図１に示すような絶縁性基板３上に形成される。絶縁性基板３は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極１をなす電極材料，及び絶縁性基板３の材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。電極１及び絶縁性基板３の大きさ、厚さは適宜設定可能である。以下、絶縁性基板３と電極１との組合せを「基材」と呼ぶこともある。

（検知層）
図２は、図１に示した検知層２内の状態を模式的に示す。図２に示すように、検知層２は、電極１と接触し、酵素５と、導電性ポリマー６を含んでおり、電子メディエータを含んでいない。

図２に示すように、検知層２内において、酵素５の分子は、導電性ポリマー６と複雑に絡み合った構造を有している。酵素反応により生じた電子は、直接的に、または、導電性を有する導電性ポリマー６を伝って電極１に移動することができる。すなわち、実施形態に係る酵素電極１０は、検知層２における直接電子移動によって酵素５と電極１との間で電子授受が行われる。

このように、酵素電極１０は、直接電子移動型の酵素電極である。“直接電子移動型の酵素電極”とは、検知層で酵素反応により生じた電子が電子メディエータを介して電極に伝達されるのではなく、検知層で酵素の反応により生じた電子が直接電子移動によって電極に伝達されるタイプの酵素電極である。

また、“直接電子移動型の酵素電極”は、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が適用された場合における、酵素反応により生じた過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）から生じた電子が電極に伝達されるような、酵素反応により生じた物質から生じた電子が電極に伝達されるタイプの酵素電極からも区別される。

なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は１０−２０Åと云われており、電極と生体分子（酵素）から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、酵素やメディエータの移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。

酵素電極１０によれば、検知層２において、酵素５の分子と導電性ポリマー６とが絡み合うことで、外部からの熱エネルギーが酵素５に及ぼす作用（酵素分子の構造変化）を和らげるように作用するものと考えられる。

また、検知層２内では。酵素５の活性部位（酵素反応により電子を生じる部位）と、導電性ポリマー６の導電性部位とが電子移動に好適な距離関係、すなわち、好適な電子移動が起こる程度に導電性部位が活性部位と近い状態となっている。また、導電性ポリマー６を介して、酵素５から電極１への複数の好適な複数の電子伝達経路が形成された状態となっていると考えられる。このため、外部からの熱エネルギーにより、酵素５に対する作用が起こったとしても、複数の好適な電子伝達経路が確保されていることにより、酵素５から電極１への電子移動が大きく、或いは急激に妨げられることが緩和されるものと考えられる。よって、実施形態に係る酵素電極１０は、好適な熱耐性を有することができる。

（酵素）
酵素５は、例えば、酸化還元酵素である。例えば、酸化還元酵素が挙げられる。例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

（導電性ポリマー）
導電性ポリマー６として、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。これらの市販品として、例えば、ポリピロールとして、例えば、「ＳＳＰＹ」（３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチル）（化研産業株式会社製）等がある。また、ポリアニリンとして、例えば「ＡｑｕａＰＡＳＳ ０１−ｘ」（ティーエーケミカル社製）等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」（東ソー有機化学株式会社製）等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー１００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー３００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））として、例えば、「ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ
Ｉｎｃ．，）等がある。
また、様々な属性（例えば、水溶性）を有する導電性ポリマーを適用することができる。
導電性ポリマー６の官能基は、水酸基又はスルホ基を有することが好ましい。

（導電性粒子）
導電性粒子６は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、フラーレンから選択される微粒子（炭素微粒子）の１種以上を含有することができる。導電性粒子６は、上記のような金属及び炭素の一方を選択することができる。

なお、検知層２の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等が挙げられる。

（酵素電極の作製方法）
上記した酵素電極１０は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板３の片面に、電極１として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板３の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
次に、電極１上に検知層２が形成される。すなわち、酵素５，導電性ポリマー６を含有する溶液（試薬）が調整される。溶液（試薬）は、電極１の表面に滴下される。溶液（試薬）が電極１上で乾燥により固化することで、電極１上に検知層２が形成された酵素電極１０を得ることができる。

以下、酵素電極の実施例について説明する。

（試験１）
（試薬溶液の調製）
最初に、以下のような実施例１、比較例に係る２種類の試薬溶液を調製した。
（実施例１）
カーボンブラック（三菱カーボンブラック製） ０．９％
３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチルと３−メチル−４−ピロールカルボン酸ブチルとの共重合体（商品名ＳＳＰＹ） (以下“ＳＳＰＹ”と表記)） ０．４５％
酵素（ＧＤＨ） ０．６５％
安定化剤（トレハロース） ０．４％
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０） １４ｍＭ
また、ドーパントとして、２,３,６,７−テトラシアノ−１,４,５,８−テトラアザナフタレン（商品名ＴＣＮＡ）（化研産業株式会社製）を使用した。
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。

（比較例）
カーボンブラック（三菱カーボンブラック製） ０．９％
酵素（ＧＤＨ） ０．６５％
安定化剤（トレハロース） ０．４％
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０） １４ｍＭ
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。このように、比較例の試薬溶液は、実施例１の試薬溶液からＳＳＰＹが除かれたものである。

（酵素電極（試料）の作製）
次に、片面に金蒸着によって電極（電極層）が形成された複数の絶縁性基板（基材）を用意し、各絶縁性基板に実施例１、比較例に係る試薬溶液を夫々分注し、低湿度乾燥炉で３０分間放置し、乾燥させた。このようにして、試薬が電極上で固化することにより検知層が形成された実施例１に係る酵素電極（試料）と、比較例に係る酵素電極（試料）とを得た。

このとき、実施例１、比較例の夫々について、３０℃，８０℃，１００℃，１２０℃の各炉内温度（乾燥温度）で乾燥させた４種類（合計８種類）の試料を得た。

（グルコース濃度の測定）
次に、熱処理後の水溶液に溶解したグルコース１００mg/dlに対する応答電流値の測定を行った。グルコース測定は、上記水溶液に試料を浸漬し、２４℃に加温したリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中で行い、対極に白金線、参照極に銀/塩化銀電極を用い、作用極への印加電圧を＋０．６Ｖ（vs.Ag/AgCl）で測定を行った。

（測定結果の評価）
図３は、試験１の結果、すなわち上記した８種類の試料に対する応答電流値（μＡ）と乾燥温度（℃）との関係を示すグラフである。図３において、実施例１に係る試料の結果は白の棒グラフで示し、比較例に係る試料の結果は黒の棒グラフで示す。なお、測定は、種類毎に、２つの試料を用いて行い、図４に示す結果は、二つの測定結果の平均を示す。
図３に示す試験結果によれば、ＳＳＰＹが添加された試料（実施例１）は、乾燥温度が上昇するに伴い、応答感度が上昇する傾向が認められた。これに対し、ＳＳＰＹが無添加の試料（比較例）は、乾燥温度の上昇に伴い、応答感度が低下する傾向が認められた。このように、ＳＳＰＹが添加された試料は、熱耐性の向上だけでなく、応答感度向上も図られていることが分かる。

（試験２）
上記した試験１と同様の手法で、実施例１及び比較例に係る８種類の試薬溶液を調製するとともに、試験１で用いた基材と同様の基材における電極上に、各試薬溶液を分注した。その後、低湿度乾燥炉（乾燥温度１００℃）で、試薬溶液を乾燥させて、酵素電極（試料）を得た。但し、試験２では、炉内での乾燥時間（熱処理時間）を、１０分，３０分，６０分，１２０分と変化させて、実施例１、比較例の夫々について４種類（合計８種類）の酵素電極（試料）を得た。その後、試験１と同様の手法（測定手法及び測定条件）で、グルコースに対する応答電流値の測定を行った。

図４は、試験２の結果、すなわち上記した８種類の試料に対する応答電流値（μＡ）と乾燥時間（ｍｉｎ）との関係を示すグラフである。図４において、実施例１に係る試料の結果は白の棒グラフで示し、比較例に係る試料の結果は黒の棒グラフで示す。なお、測定は、種類毎に、２つの試料を用いて行い、図４に示す結果は、二つの測定結果の平均を示す。

図４に示す試験結果によれば、ＳＳＰＹが添加された試料（実施例１）は、乾燥時間の変化（長期化）に拘らず、好適な応答感度を維持する傾向が認められた。これに対し、ＳＳＰＹが無添加の試料（比較例）は、乾燥時間の長期化に伴い、応答感度が低下する傾向が認められた。このように、ＳＳＰＹが添加された試料は、長時間に亘って好適な熱耐性を具備し得ることが分かる。

（試験３）
次に、ＳＳＰＹの濃度を変えた４種類の試薬溶液を調製した。ＳＳＰＹの濃度（重量％）は、０％（比較例），０．２５％，０．４５％（実施例１），１％とした。なお、ＳＳＰＹを除く試薬溶液中の成分は、実施例１と同じ内容で調製した。
このようにして得た４種類の試薬溶液について、試験１と同様の手法で、電極上に試薬溶液を分注し、３０℃，８０℃，１００℃，１２０℃（乾燥温度は何れも３０分）の各乾燥温度で乾燥させた１２種類の酵素電極（試料）を得た。そして、試験１と同様の手法で、グルコースに対する応答電流値の測定を行った。

（試験４）
また、試験３で調製した４種類の試薬溶液について、試験２と同様の手法で、電極上に試薬を分注し、１０分，３０分，６０分，１２０分（乾燥温度は何れも１００℃）の各乾燥時間で乾燥させた１２種類の酵素電極（試料）を得た。そして、試験２と同様の手法で、グルコースに対する応答電流値の測定を行った。

（試験３及び試験４の結果）
図５は、試験３の結果、すなわち、各試料に係る応答電流値（μＡ）と乾燥温度（℃）との関係を示すグラフである。図５において、各温度に対し、４つの棒グラフが示されている。４つの棒グラフは、左から順に、濃度０％，０．２５％，０．４５％，１％の応答電流値（応答感度）を示す。

図６は、試験４の結果、すなわち、各試料に係る応答電流値（μＡ）と乾燥温度（℃）との関係を示すグラフである。図５において、各乾燥温度に対し、４つの棒グラフが示されている。４つの棒グラフは、左から順に、濃度０％，０．２５％，０．４５％，１％の応答電流値（応答感度）を示す。

なお、試験３及び試験４の夫々において、１種類の試料に対する測定は、同種類の二つの試料を用いて２回行った。図５及び図６に示す結果は、２回の測定結果の平均値を示す。
図５および図６に示す結果より、酵素電極が好適な熱耐性を得るための導電性ポリマーの上限濃度は、５％以下であり、好ましくは１％以下である。また、好適な熱耐性を得るための下限濃度としては、０．０１％以上であり、好ましくは０．２％以上、さらに好ましくは０．４５％以上である。

（実施形態の作用効果）
上述した酵素電極１０によれば、電極１上に酵素５及び導電性ポリマー６を含む検知層２を形成することで、好適な熱耐性を得ることができる。これによって、熱による酵素ないし試薬の機能低下、或いは機能損失を抑えることができる。このように、酵素電極１０がその運搬、保管、使用時の夫々において、好適な熱耐性を発揮することで、酵素電極１０の寿命を延ばすことができる。

なお、酵素電極１０は、例えば、上記したようなグルコース測定に適用されるバイオセンサや電子機器（例えば、測定装置）に適用することができる。或いは、酵素反応により生じた応答電流（電極へ伝達された電子による電流）を、電極と負荷とを結ぶ供給部を介し、負荷に電力として供給する電源装置の一部としての適用も考えられる。電子機器は、実施形態に係る酵素電極が適用されたバイオセンサを含んだ電子機器、実施形態に係る酵素電極が適用された上記装置（電源装置）を含んだ電子機器を含むことができる。

１・・・電極
２・・・検知層
３・・・絶縁性基板
５・・・酵素
６・・・導電性ポリマー
１０・・・酵素電極

Claims (12)

1. 電極と、
   前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層と、
   を含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極。
2. 前記導電性ポリマーは、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェンの中から少なくとも１つが選択される、請求項１に記載の酵素電極。
3. 前記酵素は、酸化還元酵素である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の酵素電極。
4. 前記導電性ポリマーの官能基は、水酸基又はスルホ基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素電極。
5. 前記電極と前記検知層との少なくとも一方は、導電性粒子を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素電極。
6. 前記酵素電極において、熱耐性が向上したことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素電極
7. 電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層とを含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われる酵素電極を備えたバイオセンサ。
8. 請求項７に記載のバイオセンサを含む電子機器。
9. 電極と、前記電極と接触し、酵素と、導電性ポリマーを含む検知層とを含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われを含む酵素電極と、前記酵素電極での酵素反応によって生じた電流を負荷に供給する供給部と、を含む装置。
10. 請求項９に記載の装置を含む電子機器。
11. 電極上に、酵素と、導電性ポリマーを含む、直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受を行う検知層を形成する、ことを含む酵素電極の製造方法。
12. 酵素と、導電性ポリマーとを含み、熱耐性を向上させたことを特徴とする試薬。