CN107037101B - 酶电极 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶电极，所述酶电极包含：电极，以及与所述电极接触并包含交联剂、导电性高分子和酶的检测层，所述酶将电子转移至所述电极并接收来自所述电极的电子且不包含电子传递亚单位。

Description

酶电极

技术领域

本发明涉及一种用于测量电荷传递极限电流的酶电极。

背景技术

已知酶电极包括作为基材的电极和检测层，其中用交联剂或粘合剂将酶和导电性颗粒固定在电极表面上。一些酶电极通过检测层中的酶与电极之间发生的电子交换来测量电荷传递极限电流，从而测量目标物质的浓度。

测量电荷传递极限电流的酶电极的实例包括其中检测层含有酶、导电性颗粒和交联剂的酶电极(例如，专利文献1)。还已知另一种酶电极，其中检测装置包括酶、导电性颗粒和导电性高分子(例如，专利文献2)。

引用清单

专利文献

[专利文献1]日本特开平2014-006154号公报

[专利文献2]日本特开平2014-006155号公报

发明内容

技术问题

测量电荷传递极限电流的酶电极可以合适地测量小量样品中目标物质的浓度。然而，在专利文献1和专利文献2中公开的酶电极在制造成本和贮存稳定性方面仍然需要改进。

本发明的一个目的是提供能够降低制造成本并改善贮存稳定性的酶电极。

技术方案

本发明的一个方面是酶电极，其包含：电极，以及与该电极接触并包含交联剂、导电性高分子和酶的检测层，所述酶将电子转移至电极并接收来自电极的电子且不包含电子传递亚单位。

在该酶电极中，酶可以是氧化还原酶。所述酶还可以是不包含电子传递亚单位的细胞色素脱氢酶。

本发明的其他方面包括制造酶电极的方法，其包括在电极上形成与该电极接触并包含交联剂、导电性高分子和酶的检测层，所述酶将电子转移至电极并接收来自电极的电子且不包含电子传递亚单位。

本发明的效果

根据本发明，能够提供可以降低制造成本并改善贮存稳定性的酶电极。

附图说明

图1是示意性描绘了实施方式的酶电极构造的图；

图2是描绘了本发明测量装置的实施方式的示意图；

图3是描述了使用本发明测量装置进行的测量程序的实施方式的流程图；和

图4是描绘了基于使用实施例1和比较例1的酶电极获得的响应电流值创建的校准曲线之间比较的曲线图。

具体实施方式

以下，将参考附图描述根据本发明实施方式的酶电极。以下描述的实施方式的构成为示意性的，而本发明并不局限于此。

酶电极的构造

图1是示意性描绘实施方式的酶电极结构的图。在图1中，酶电极A上设置有电极1以及形成在电极1表面(图1的上表面)上的检测层2。

电极

电极1由金属材料(如金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)或钯)或碳材料(如碳)制成。例如，如图1中所示，电极1形成在绝缘基板3上。绝缘基板3由热塑性树脂(如聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚乙烯(PE))、各种树脂(塑料)(如聚酰亚胺树脂和环氧树脂)或绝缘材料(如玻璃、陶瓷和纸)制成。各种已知材料可应用为形成电极1的材料和绝缘基板3的材料。电极1和绝缘基板3的尺寸和厚度视情况而定。下文中，绝缘基板3和电极1的组合也称为“基材”。

检测层

检测层2与电极1接触，并含有酶4、导电性高分子5、糖6和交联剂7但不含有电子介体。使用本实施方式的酶电极的测量对象是基于从待测量物质向电极传递的电子的电荷传递极限电流。这是当由于酶和待测量物质之间的反应使得电子从酶传递到电极时产生的电流，并且是与时间无关的稳态电流，优选为双电层充电导致的瞬态电流后的稳态电流。

为了测量电荷传递极限电流，工作电极优选是“直接电子传递型酶电极”。如本文所使用的“直接电子传递型酶电极”是指如下的酶电极类型，在该酶电极类型中酶和电极之间以如下方式进行电子交换(也就是，酶将电子转移至电极并接收来自电极的电子)，其使得在试剂层中酶反应产生的电子直接地或经导电性高分子介导地传递至电极，而不涉及氧化还原物质如电子传递介体的参与。

需要注意的是，即使使用电子传递介体时，在电子传递介体固定而不扩散的情况下也能测量电荷传递极限电流。

如图1所示，检测层2中的酶4的分子通过交联剂7交联，并且进一步由于导电性高分子5而具有复杂的交织结构。酶反应产生的电子可以直接或沿具有导电性的导电性高分子5传递至电极1。具体而言，在本实施方式的酶电极A中，通过检测层2中的直接电子传递而在酶4和电极1之间交换电子。

需要注意的是，在生理反应体系中，发生直接电子传递的限制距离被认为是1～2nm，甚至在由电极和酶构成的电化学反应体系的电子交换中，电极上的电子交换也变得难以检测，除非可在上述距离相隔较远的情况下进行介体传递(例如，通过扩散传递)。结果，在检测层2中，酶4的活性位点(因酶反应而产生电子的位点)和导电性高分子5的导电位点位于适于电子传递的距离之内，具体而言，该导电位点和活性位点相距得足够近从而使电子在其间适当地传递。

酶

酶4的实例包括氧化还原酶。氧化还原酶的实例包括葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、肌氨酸氧化酶、L-乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙三醇脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、细胞色素氧化还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等。其中，优选为糖的氧化还原酶。糖的氧化还原酶的实例包括葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶。

氧化还原酶可以进一步含有吡咯喹啉醌(PQQ)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少一个作为催化亚单位和催化域。含有PQQ的氧化还原酶的实例包括：PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)。含有FAD的氧化还原酶的实例包括细胞色素葡萄糖脱氢酶(CY-GDH)和葡萄糖氧化酶(GOD)，其具有含FAD的α-亚单位。

氧化还原酶可以进一步含有电子传递亚单位或电子传递域。电子传递亚单位的实例包括以下的亚单位，其包含具有电子交换功能的血红素。包含这种含血红素亚单位的氧化还原酶的实例包括含有细胞色素的那些氧化还原酶，例如可以使用葡萄糖脱氢酶和PQQGDH与细胞色素的融合蛋白。

含有电子传递域的酶的实例包括胆固醇氧化酶和醌血红素乙醇脱氢酶(QHEDH(PQQ乙醇DH))。对于电子传递域，进一步优选为使用含有细胞色素的域，其包含具有电子交换功能的血红素。其实例包括“QHGDH”(融合酶；具有QHGDH的血红素域的GDH)、山梨糖醇脱氢酶(山梨醇DH)、D-果糖脱氢酶(果糖DH)、根癌农杆菌来源葡萄糖-3-脱氢酶(来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasience)的G3DH)和纤维二糖脱氢酶。注意，在例如国际公开WO2005/030807中公开了上述PQQGDH和细胞色素的融合蛋白，其为含细胞色素亚单元的实例，还公开了PQQGDH的细胞色素域，其为含细胞色素域的实例。

另外，对于氧化还原酶，可以使用至少由催化亚单元和含细胞色素的亚单元构成的低聚酶，其中所述细胞色素包含具有电子受体功能的血色素。

然而，将不包含电子传递亚单位或电子传递域的氧化还原酶用作在本实施方式中的酶。一个实例是细胞色素葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)。Cy-GDH具有电子传递亚单元β，催化亚单元α和催化亚单元γ。在本实施方式中，将不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH(包含催化亚单元α和γ)用作酶。

相比于具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚基γ的Cy-GDH，不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH能以更低的价格购买。据此原因，当将不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH用作在检测层2中包含的酶时，能够降低酶电极的制造成本。

相比于具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚基γ的Cy-GDH，不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH进一步具有更高的稳定性。这意味着，相比于使用具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚基γ的Cy-GDH的酶电极(生物传感器)，使用不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH的酶电极(生物传感器)能贮存更长时间。结果，能够得到具有更长产品寿命的用于电荷传递极限测量的酶电极类型。

导电性高分子(导电性聚合物)

导电性聚合物的实例包括聚吡咯、聚苯胺、聚苯乙烯磺酸酯、聚噻吩、聚异硫茚、聚乙烯二氧噻吩(聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)聚(苯乙烯磺酸酯))，其组合等。商业产品的实例包括，聚吡咯为“SSPY”(3-甲基-4-吡咯羧酸酯)(由KAKENSANGYOU CORPORATION制造)等。其实例还包括，聚苯胺为“AquaPASS 01-x”(由TA Chemical Co.,LTD.制造)等。其实例还包括，聚苯乙烯磺酸酯为“Poly-NaSS”(由TOSOH ORGANIC CHEMICAL CO.，LTD.制造)等。其实例包括，聚噻吩为“ESPACER 100”(由TA Chemical Co.,LTD.制造)等。其实例包括，多异硫茚为“ESPACER 300”(由TA Chemical Co.,LTD.制造)等。其实例包括，如聚乙烯二氧噻吩(聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)聚(苯乙烯磺酸酯))为“PEDOT-PSS”(由Polyscience,Inc.制造)等。

此外，可以使用具有各种特性(例如，水溶性)的导电型聚合物。导电性聚合物的官能团优选为具有羟基或磺基。

糖

如图1所示，除酶、交联剂和导电性高分子之外，检测层2还可以含有糖6。糖6是不用作酶4底物的糖，并且糖6的成分糖数目例如是1～6个，优选为2～6个。这些可以是D-型或L-型，或它们的混合物，并且视情况可以单独使用或两种以上组合使用。然而，在如葡萄糖等糖用作测量对象时，将不同于作为测量对象的糖并且也不用作酶4底物的糖用作糖6。

二糖的实例包括木二糖、琼脂二糖、角叉藻二塘、麦芽糖、异麦芽糖、槐糖、纤维二糖、海藻糖、新海藻糖、异海藻糖、菊糖、巢菜糖、异樱草糖、山姆卜二糖、樱草糖、茄双塘、蜜二糖、乳糖、番茄二糖、表纤维二糖、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、乳果糖、表生二糖(epigentibiose)、刺槐二糖、硅醇二糖(silanobiose)、芸香糖等。三糖的实例包括葡糖基海藻糖、纤维三糖、马铃薯三糖、龙胆三糖、异麦芽三糖、异葡糖基麦芽糖、麦芽三糖、甘露三塘、松三糖、潘糖、车前糖、棉子糖、茄形糖(soratriose)、伞形糖(umbelliferose)等。

四糖的实例包括麦芽糖基海藻糖、麦芽四糖、水苏糖等。五糖的实例包括麦芽三糖基海藻糖、麦芽五糖、毛蕊花糖等。六糖的实例包括麦芽六糖等。

交联剂

交联剂7的类型实例，具体而言，作为含醛基化合物包括戊二醛、甲醛、丙二醛、对苯二甲醛、异丁醛、戊醛、异戊醛、肉桂醛、烟碱醛、甘油醛、乙醇醛、丁二醛、己二醛、间苯二甲醛、对苯二甲醛等。作为含碳二亚胺基的化合物，其实例包括六亚甲基二异氰酸酯、氢化亚二甲苯基二异氰酸酯、亚二甲苯基二异氰酸酯、2,2,4-三甲基六亚甲基二异氰酸酯、1,12-二异氰酸酯十二烷、降冰片烷二异氰酸酯、2,4-双-(8-异氰酸酯辛基)-1,3-二辛基环丁烷、4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯、四甲基亚二甲苯基二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯等。含碳二亚胺基的化合物还以商品名CARBODILITE V-02、CARBODILITE V-02-L2、CARBODILITE V-04、CARBODILITE V-06、CARBODILITE E-02、CARBODILITE V-01、CARBODILITE V-03、CARBODILITE V-05、CARBODILITE V-07、CARBODILITE V-09(均为商品名，由Nisshinbo Chemical Inc.制造)等可商售购得。

作为含马来酰亚胺基的化合物、其实例包括间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、间-马来酰亚胺基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基乙基)环己烷-1-羧酸酯、N-琥珀酰亚胺基-2-马来酰亚胺基乙酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基丁酸、N-琥珀酰亚胺基-6-马来酰亚胺基己酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸、N-磺基琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基甲基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基苯基-4-丁酸、N-磺基琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基苯基-4-丁酸、N,N'-氧二亚甲基-二马来酰亚胺、N,N'-邻苯二马来酰亚胺、N,N'-间苯二马来酰亚胺、N,N'-对苯二马来酰亚胺、N,N'-六亚甲基二马来酰亚胺、N-琥珀酰亚胺基马来酰亚胺羧酸酯等。其实例还包括商购品，如SANFEL BM-G(由SANSHIN CHEMICAL INDUSTRYCO.,LTD.制造)等。

作为含噁唑啉基的化合物，其实例包括噁唑啉化合物，如2,2'-双-(2-噁唑啉)、2,2'-亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-亚乙基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-三亚甲基-双(2-噁唑啉)、2,2'-四亚甲基-双(2-噁唑啉)、2,2'-六亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-八亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-亚乙基-双-(4,4'-二甲基-2-噁唑啉)、2,2'-对亚苯基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-间亚苯基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-间亚苯基-双-(4,4'-二甲基-2-噁唑啉)、双-(2-噁唑啉基环己烷)硫醚、双-(2-噁唑啉基降冰片烷)硫醚等。

作为加成聚合性噁唑啉化合物，其实例包括2-乙烯基-2-噁唑啉、2-乙烯基-4-甲基-2-噁唑啉、2-乙烯基-5-甲基-2-噁唑啉、2-异丙烯基-2-噁唑啉、2-异丙烯基-4-甲基-2-噁唑啉、2-异丙烯基-5-乙基-2-噁唑啉等，并且也可以使用其一种以上的聚合或共聚的化合物。

含噁唑啉基的化合物也可以以EPOCROS WS-500、EPOCROS WS-700、EPOCROS K-1010E、EPOCROS K-1020E、EPOCROS K-1030E、EPOCROS K-2010E、EPOCROS K-2020E、EPOCROSK-2030E、EPOCROS RPS-1005、EPOCROS RAS-1005(全部由NIPPON SHOKUBAI CO.,LTD.制造)，NK连接子FX(由Shin-Nakamura Chemical Co.,Ltd.)等的商品名商购得。

作为含环氧基的化合物，其实例可具体地包括山梨糖醇聚缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油基醚等，并且还可以组合使用这些化合物的两种以上。含环氧基的化合物也可以以DENACOL EX-611、DENACOL EX-612、DENACOL EX-614、DENACOL EX-614B、DENACOL EX-512、DENACOL EX-521、DENACOL EX-421、DENACOL EX-313、DENACOL EX-314、DENACOL EX-321、DENACOL EX-810、DENACOL EX-811、DENACOL EX-850、DENACOL EX-851、DENACOL EX-821、DENACOL EX-830、DENACOL EX-832、DENACOL EX-841、DENACOL EX-861、DENACOL EX-911、DENACOL EX-941、DENACOL EX-920、DENACOL EX-145和DENACOL EX-171(全部为商品名，由NagaseChemteX Corporation生产)、SR-PG、SR-2EG、SR-8EG、SR-8EGS、SR-GLG、SR-DGE、SR-4GL、SR-4GLS和SR-SEP(全部为商品名，由Sakamoto Yakuhin Kogyo Co.,Ltd.生产)、Epolite200E、Epolite 400E、Epolite400P(全部由KYOEISHA CHEMICAL Co.,LTD.生产)等的商品名商购得。

交联剂的类型并不限定于上述化合物和商品，还可以是含有醛基、马来酰亚胺基、碳二亚胺基、噁唑啉基和环氧基中至少一个官能团的任何化合物。交联剂的形式没有限制，可以是单体形式或聚合物形式。

导电性颗粒

检测层2可进一步含有导电性颗粒。对于导电性颗粒，可以使用金属颗粒，例如金、铂、银或钯，或由碳材料制成的高阶结构体。高阶结构体可以包含，例如，导电性炭黑、碳纳米管(CNT)和如富勒烯等碳颗粒或碳微粒。导电性炭黑的实例包括科琴黑(由Degussa AG制造)、黑珍珠(Cabot Corporation)等。

注意，检测层2的表面也可以用如乙酸纤维素等外层膜覆盖。用于外层膜的原材料的实例特别地包括聚氨酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯、聚醚醚酮等。

制造酶电极的方法

上述酶电极A例如如下制造。具体而言，将用作电极1的金属层形成在绝缘基板3的一个表面上。例如，通过物理气相沉积(PVD，例如溅射)或化学气相沉积(CVD)来沉积金属材料以形成膜，从而在具有预定厚度(例如约100μm)的膜形状的绝缘基板3的一个表面上形成具有所需厚度(例如，约30nm)的金属层。还可以形成由碳材料制成的电极层替代金属层。

接着，在电极1上形成检测层2。具体而言，制备了包含酶4、导电性高分子5、糖6和交联剂7的溶液(试剂)。此处，糖浓度优选为0.1～2重量％，更优选为0.2～2重量％。将溶液(试剂)滴加到电极1的表面上。当通过在电极1上干燥而固化该溶液(试剂)时，得到酶电极A，其中检测层2形成在电极1上。

使用本实施方式的酶电极能够基于电荷传递极限电流进行样品中待测量物质的浓度测量。本文中所指的待测量物质没有限制，只要该物质可以通过使用本发明的酶电极的测量方法进行测量即可，但优选为生物来源物质，并且能够是疾病或健康状况的指征，其实例包括葡萄糖、胆固醇等。样品并没有限制只要其含有待测量的物质即可，不过优选为生物样品，其实例包括血液、尿液等。

生物传感器

本实施方式的酶电极可以用作生物传感器，诸如葡萄糖传感器。所述生物传感器包括酶电极和作为对电极的电极。对电极可以是通常用作生物传感器对电极的任何电极，并且例如可以使用通过使用丝网印刷形成膜得到的碳电极、通过使用物理气相沉积(PVD，例如溅射)或化学气相沉积(CVD)形成膜得到的金属电极、以及通过使用丝网印刷形成膜得到的银/氯化银电极。还可以使用三电极系统，其中参比电极是银/氯化银电极、通过使用丝网印刷形成膜得到的碳电极、或通过使用物理气相沉积(PVD，例如溅射)或化学气相沉积(CVD)形成膜得到的金属电极。

测量装置

接下来描述使用本实施方式的酶电极测量物质浓度的测量装置。此处描述了使用葡萄糖传感器的葡萄糖测量装置，其为使用酶电极的生物传感器的实例。然而，所述测量装置并不局限于葡萄糖测量装置，并且所述测量装置的使用目的随着酶电极(生物传感器)待测量的物质而变化。

图2描述了容纳在测量装置B中的主要电子部件的构造实例。容纳在壳体内的基板20上设置了控制计算机18、恒电位仪19和电源装置11。控制计算机18包括作为硬件的处理器诸如CPU(中央处理器)、记录介质诸如存储器(RAM(随机存取存储器)和ROM(只读存储器))和通讯单元。

当处理器将存储在记录介质(例如，ROM)中的程序加载到RAM并执行该程序时，控制计算机18用作包括输出单元10、控制单元12、运算单元13和检测单元14的装置。控制计算机18还可以包括辅助存储器，诸如半导体存储器(EEPROM或闪存)或硬盘，用于存储程序和数据。

控制单元12控制施加电压的时序，要施加的电压的值等。电源装置11包括电池16，并为控制计算机18和恒电位仪19提供电力以便运行。还可以将电源装置11放置在壳体外。

恒电位仪19是使工作电极相对于参比电极保持恒定电压，并受到控制单元12的控制。恒电位仪19使用终端CR、W向葡萄糖传感器17的对电极和工作电极之间施加预定量的电压，测量能够在终端W处获得的工作电极的响应电流，并将响应电流的测量结果发送到检测单元14。

运算单元13基于检测电流值计算并存储待测量物质的浓度。输出单元10执行与显示单元15的数据通讯，并发送待测量物质的浓度计算结果(由运算单元13提供)至显示单元15。显示单元15例如能够将接收自测量装置B的葡萄糖浓度的计算结果以预定格式显示在显示屏幕上。

图3是描述由控制计算机18进行葡萄糖浓度测量的处理顺序实例的流程图。控制计算机18的CPU(控制单元12)接收指令开始葡萄糖浓度的测量。控制单元12控制恒电位仪19以向工作电极施加预定量的电压，并开始测量来自工作电极的响应电流(步骤S01)。注意，可以将检测到葡萄糖传感器17安装至测量装置B用作开始浓度测量的指令。

然后，恒电位仪19测量由施加电压产生的响应电流，具体而言是，基于源自样品中待测量物质(本文中为葡萄糖)的电子至电极的传递的电荷传递极限电流，并将测量电流发送至检测单元14(步骤S02)。作为电荷传递极限电流，测量双电层充电导致产生瞬态电流之后的稳态电流，例如施加电压之后1～20秒的稳态电流。

运算单元13基于该电流值进行运算处理并计算葡萄糖浓度(步骤S03)。例如，用于计算葡萄糖浓度的公式或者葡萄糖浓度校准曲线数据(其对应于设置在工作电极上的检测层中含有的酶(例如，葡萄糖脱氢酶)可预先安装在控制计算机18的运算单元13中。运算单元13使用这些计算公式或校准曲线计算葡萄糖浓度。

运算单元13例如可以基于公式(1)由测量电流值计算待测量物质(葡萄糖)的浓度。另一种可能是使用已知浓度的样品预先创建校准曲线，并基于校准曲线由测量电流值计算浓度。也可以通过将公式(1)乘以经试验等建立的校准系数来计算样本的浓度。在此情况下，校准系数也包括在公式(2)的常量X中。响应电流的测量可以连续进行或间歇进行。

输出单元10通过与显示单元15一同设置的通讯链路将葡萄糖浓度的计算结果发送至显示单元15(步骤S04)。此后，控制单元12确定是否检测到存在任何测量错误(步骤S05)，如果没有错误则完成测量并将葡萄糖浓度在显示单元上显示。如果出现任何错误，将显示错误提示，随后完成图3中描述的流程。计算结果可以存储在存储介质中，并从存储介质中读取计算结果以显示并确认。需要注意的是在图3的实例中在计算结果发送至显示单元15(步骤S04)之后通过进行控制单元12检测测量错误(步骤S05)，但也可以交换顺序进行这些步骤。

实施例

以下将描述酶电极的实施例。

测试1

试剂溶液的制备

制备了以下描述的实施例1和比较例1的两种试剂溶液。

实施例1

配方

·科琴炭黑(三菱炭黑)0.6％

·导电性高分子：磺化聚苯胺水溶液(商品名：aquaPASS-01X，由MitsubishiRayon Co.，Ltd.制造)：0.2％

·含噁唑啉基聚合物EPOCROS WS-700(NIPPON SHOKUBAI CO.,LTD.)：3.0％

·酶(Cy-GDH：γα)：2.5mg/mL

·海藻糖：0.25％(酶的保护剂)

·磷酸盐缓冲液(pH 5.8)：5mM

注意，“％”表示在试剂溶液中所含试剂的重量百分比浓度。

比较例1

配方

·科琴炭黑(三菱炭黑)0.6％

·导电性高分子：磺化聚苯胺水溶液(商品名：aquaPASS-01X，由MitsubishiRayon Co.，Ltd.制造)：0.2％

·含噁唑啉基聚合物EPOCROS WS-700(NIPPON SHOKUBAI CO.,LTD.)：3.0％

·酶(Cy-GDH：γαβ)：2.3mg/mL

·海藻糖：0.25％(酶的保护剂)

·磷酸盐缓冲液(pH 5.8)：5mM

注意，“％”表示在试剂溶液中所含试剂的重量百分比浓度。因此，比较例1的试剂溶液与使用具有亚单元α和γ的Cy-GDH的实施例1的试剂溶液的区别在于，其使用了具有亚单元α、β和γ的Cy-GDH作为酶。

酶电极(样品)的制造

接着，制备多个绝缘基板，在其一个表面上具有通过金气相沉积形成的电极(电极层)(基材)，并将实施例1或比较例1的试剂溶液分摊于每个绝缘基板上，在低湿度干燥炉中静置30分钟并干燥。由此，得到实施例1的酶电极(样品)和比较例1的酶电极(样品)，当试剂在电极上固化时在其上形成检测层。

葡萄糖浓度的测量

接着，使用各个酶电极测量人全血的响应电流，在所述人全血中葡萄糖浓度分别调整为0、100mg/dL、300mg/dL、600mg/dL和800mg/dL。使用形成在所述电极上的参比电极/对电极(均由碳制成)和参比电极(银/氯化银)，在对工作电极(vs.Ag/AgCl)施加+200mV的电压下测量葡萄糖。

测量结果的评估

图4是描绘基于使用实施例1和比较例1的酶电极获得的响应电流值创建的校准曲线之间比较的曲线图。如图4中所示，发现在校准的线性范围内，尽管响应电流值低于γαβ(比较例1)，不过γα(实施例1)显示出能充分地用作葡萄糖传感器。因此，根据试验1，能提供具有降低的制造成本和改进的检测层2的品质稳定性的酶电极。

实施例1的酶电极测量电荷传递极限电流，由此能够避免使用介体的常规酶电极发生的由物质扩散条件导致的测量值不一致。如上所述，本发明实施方式的酶电极能够提供较低价格的具有改进的贮存稳定性的酶电极，这使得其相比于使用介体的酶电极能够进行更多的定量测量(测量精度高)。

Claims (7)

1.一种直接电子传递型酶电极，其包含：

电极，和

检测层，所述检测层与所述电极接触并包含交联剂、导电性高分子和氧化还原酶，所述氧化还原酶将电子转移至所述电极并接收来自所述电极的电子且不包含电子传递亚单位，

其中，所述氧化还原酶是不包含电子传递亚单位的细胞色素葡萄糖脱氢酶，并且

其中，所述检测层不含有电子介体。

2.如权利要求1所述的直接电子传递型酶电极，其中，所述导电性高分子为聚吡咯、聚苯胺、聚苯乙烯磺酸酯、聚噻吩、聚异硫茚、聚乙烯二氧噻吩或其组合。

3.如权利要求1所述的直接电子传递型酶电极，其中，所述交联剂选自由含醛基化合物、含碳二亚胺基的化合物、含马来酰亚胺基的化合物、含噁唑啉基的化合物、以及含环氧基的化合物组成的组。

4.如权利要求1所述的直接电子传递型酶电极，其中，所述检测层还含有二糖。

5.如权利要求1所述的直接电子传递型酶电极，其中，所述检测层还含有导电性颗粒。

6.一种制造直接电子传递型酶电极的方法，其包括：

在电极上形成与所述电极接触并包含交联剂、导电性高分子和氧化还原酶的检测层，所述氧化还原酶将电子转移至所述电极并接收来自所述电极的电子且不包含电子传递亚单位，

其中，所述氧化还原酶是不包含电子传递亚单位的细胞色素葡萄糖脱氢酶，并且

其中，所述检测层不含有电子介体。

7.如权利要求6所述的制造直接电子传递型酶电极的方法，其中，所述直接电子传递型酶电极为权利要求1～5中任一项所述的直接电子传递型酶电极。

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