CN101339155A - 酶电极和酶传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够以高灵敏度高速检测标的物质的具有良好稳定性且长寿命的酶电极和使用该酶电极的酶传感器。酶电极(1)，具有：电极(2)；具有多个从电极(2)和/或固定于电极(2)上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管(3)的碳纳米管层(L)；通过夹于碳纳米管(3)彼此之间而固定于碳纳米管层(L)的酶(4)而构成。

Description

酶电极和酶传感器
技术领域
本发明涉及酶电极和使用酶电极的酶传感器。
背景技术
现有技术中，从环境问题及/或医疗领域的应用的角度上考虑，盛行用于检测指定微量物质的生化传感器的研究以及开发。
具体的，酶传感器例如用于采用将酶固定于表面上的电极对标的物质进行电化学检测。由于酶与标的物质发生特异反应，所以酶传感器具有能够从混合物中以较高灵敏度地选择性检测出标的物质的特征。作为酶传感器，迄今为止，例如用于糖尿病检查的葡萄糖传感器、用于痛风检查的尿酸传感器、用于肾功能检查的尿素传感器等在医疗领域已经达到实用化的水平。
近年来，从安全·安心的实现快捷化的社会的观点考虑，追求一种高速·高灵敏度检测例如甲醛或甲苯等住宅环境污染物质、TNT火药等爆炸物类、可卡因或海洛因等麻药类等的技术。这些物质由于以极低浓度存在于气相、液相中，所以对于检测要求具有次ppb级别的检测灵敏度，期望传感器进一步高速·高灵敏度化。
酶属于高分子蛋白质，由于基于其立体结构而呈现出活性，所以存在因各种外因而容易失去活性的缺点。因此，长久以来，为了消除这种不稳定性，开发有将酶保持于合适的载体上并通过载体和酶的相互作用而使酶稳定化的方法(酶固定化法)(例如参照非专利文献1)。
在酶传感器中，通过使用采用上述酶固定化法而将酶物理或化学上固定于电极表面上的酶电极，从而电化学上测量输出电流值。通过增加酶电极的酶固定量，能够得到高灵敏度的酶传感器。然而，酶电极中的酶固定量很大程度上取决于电极的有效表面积。
而且，现有技术中，因为碳纳米管表现出半导体特性，所以尝试使用碳纳米管来作为电子设备。由于碳纳米管化学性质稳定且电导率非常高，所以适合用做电子元件。另外，由于碳纳米管直径为1nm～20nm左右，所以，也很适合用作为微电路元件或电极。
另外，作为碳纳米管的电化学特性，可以举出，例如催化剂活性也比其他的电极材料要好。因此，如果采用碳纳米管作为电极，则与采用其他电极材料场合相比，相同电位下的氧化电流或还原电流变大，因此，导致检测灵敏度提高(例如参照非专利文献2)。
另外，作为碳纳米管的特征，可以举出，例如具有高的纵横比。碳纳米管的直径为几nm，而其长度为几μm左右，由于具有1000倍以上的纵横比，所以能够使比表面积增加。因此，如果用碳纳米管作为酶固定载体，则与对平面的酶固定相比，能够期望以更大的吸附量进行更高浓度的酶固定。另外，如果用碳纳米管作为电极，则由于碳纳米管在整个表面上进行反应，所以灵敏度和响应速度均得到提高(例如参见非专利文献3)。
因此，提案有利用碳纳米管的酶传感器。
具体的，提案有一种如下所述的酶传感器。即，例如在矿物油中混合碳纳米管和酶，然后，将其涂布于电极上形成酶电极，利用该酶电极而形成的酶传感器(例如参照非专利文献4)。
另外，还提案有一种如下所述的酶传感器。即，使碳纳米管在基板上的微细金属催化剂阵列上于垂直方向上生长，将酶固定于该碳纳米管末端的酶传感器(例如参照专利文献1)。
但是，在非专利文献4记载的酶传感器中，由于碳纳米管涂布于电极上，所以，在碳纳米管和电极之间形成肖特基势垒，测量到有很大的电阻值。因此，其不能激活碳纳米管的特性，不能得到足够的检测灵敏度和响应速度。
另外，在专利文献1记载的酶传感器中，由于仅在碳纳米管的末端，即，碳纳米管层表面上固定酶，所以，不能激活碳纳米管的特性，不能实现酶的高密度固定。进一步，在专利文献1记载的酶传感器中，由于没有维持酶的立体结构的物质，所以随着外部环境的变化酶的立体结构会发生变化，酶将失去活性，存在稳定性欠缺以及寿命短的问题。
[非专利文献1]酶工学概论(コロナ社)p.16-p.100(1995)
[非专利文献2]Nature，354，56(1991)
[非专利文献3]Science，287，622(2000)
[非专利文献4]Electroanalysis，14，1609(2002)
[专利文献1]特开2005-1105号公报
发明内容
本发明的课题在于提供一种能够以高灵敏度高速度检测标的物质的具有优异的稳定性且长寿命的酶电极，以及使用该酶电极的酶传感器。
为了解决上述课题，技术方案1的发明涉及一种酶电极，其特征在于，具有：电极；具有多个从上述电极和/或固定于上述电极上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管的碳纳米管层；以及通过夹持于上述碳纳米管彼此之间而固定于上述碳纳米管层的酶。
技术方案2的发明涉及如技术方案1所述的酶电极，其特征在于，具有用于防止固定于上述碳纳米管层的酶的流出的流出防止部。
技术方案3的发明涉及如技术方案2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为覆盖上述碳纳米管层的规定的层。
技术方案4的发明涉及如技术方案2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为导入上述碳纳米管层中的规定的交联剂。
技术方案5的发明涉及如技术方案2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为导入上述碳纳米管的末端的与上述酶的氨基反应形成酰胺键的羧基。
技术方案6的发明涉及如技术方案1所述的酶电极，其特征在于，在上述碳纳米管层中导入电子传送体和/或辅酶，该电子传送体用于促进上述酶和上述电极或上述碳纳米管之间的电子传送，该辅酶用于催化上述酶的活性的表达。
技术方案7的发明涉及如技术方案1所述的酶电极，其特征在于，具有设于上述电极周围的疏水性绝缘部。
技术方案8的发明涉及一种酶电极，其特征在于，具有：电极；具有多个从上述电极和/或固定于上述电极上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管的碳纳米管层；通过夹持于上述碳纳米管彼此之间而固定于上述碳纳米管层的酶；用于防止固定于上述碳纳米管层的酶的流出的流出防止部；导入上述碳纳米管层中的电子传送体和/或辅酶，该电子传送体用于促进上述酶和上述电极或上述碳纳米管之间的电子传送，该辅酶用于催化上述酶的活性的表达；以及设于上述电极周围的疏水性绝缘部。
技术方案9的发明涉及一种酶传感器，其特征在于，采用技术方案1或8所述的酶电极通过电化学测量法检测标的物质。
技术方案10的发明涉及如技术方案9所述的酶传感器，其特征在于，具有基板以及设于上述基板的上表面的分析部，上述酶电极配置于上述基板的上表面的上述分析部的内部。
技术方案11的发明涉及如技术方案10所述的酶传感器，其特征在于，具有疏水性绝缘膜，该疏水性绝缘膜设于上述基板的上表面的上述分析部的周围。
技术方案12的发明涉及如技术方案10所述的酶传感器，其特征在于，上述分析部的上表面形成开口部，且具有覆盖上述开口部的用于抑制液体透过且使气体分子透过的规定的膜。
技术方案13的发明涉及一种酶传感器，采用技术方案1或8所述的酶电极通过电化学测量法检测标的物质，其特征在于，具有：基板；设于上述基板的上表面且上表面具有开口部的分析部；设于位于上述基板上表面的上述分析部周围的疏水性绝缘膜；覆盖上述开口部的用于抑制液体透过且使气体分子透过的规定的膜，且上述酶电极配置于位于上述基板的上表面的上述分析部的内部。
根据本发明的酶电极和使用该酶电极的酶传感器，该酶电极，具有：电极；具有多个从上述电极和/或固定于上述电极上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管的碳纳米管层；以及通过夹持于上述碳纳米管彼此之间而固定于上述碳纳米管层的酶。
换言之，通过将酶夹持于上述碳纳米管彼此之间而能够将酶牢固地固定于上述碳纳米管层内，所以，能够提供一种能够防止酶的立体结构的变化的具有优良的稳定性且长寿命的酶电极，以及使用该酶电极的酶传感器。
另外，由于碳纳米管层比表面积非常大，所以不但能够以很大的吸附量高浓度固定酶，而且，由于碳纳米管从电极和/或固定于电极上的金属催化剂直接延伸出来而具有于碳纳米管和电极之间不会形成肖特基势垒的特征，而能够提供一种可高灵敏度检测出标的物质的酶电极和使用该酶电极的酶传感器。
进一步，碳纳米管还起到作为电极的作用，据此，由于酶夹持于碳纳米管电极(碳纳米管)彼此之间，酶和碳纳米管电极(碳纳米管)之间的电子的传送可高效进行，所以能够提供一种可高速检测出标的物质的酶电极和使用该酶电极的酶传感器。
附图说明
图1是表示本发明的酶电极的主要部分的示意图。
图2是表示本发明的酶传感器的平面图(a)、侧面截面图(b)的图。
图3是用于说明本发明的酶传感器的制作方法的图。
图4是具有阳极氧化膜的情形的本发明的酶电极的侧面截面图。
图5是用于说明根据采用本发明的酶电极的酶传感器利用电化学测量法测定试样中标的物质浓度的原理的图。
图6是表示用于评价实施例1的酶传感器的测定装置的示意图。
图7是表示采用实施例1的酶传感器进行测定而得到的结果(对甲醛浓度的响应电流)的图。
图8是表示采用实施例1的酶传感器进行测定而得到的结果(响应电流随着甲醛的导入的变化)的图。
图9是表示采用实施例1的酶传感器进行测定而得到的结果(对时间的相对响应)的图。
图10是具有气体透过膜的情形的本发明的酶传感器的侧面截面图。
附图标记的说明
1酶电极              2电极
2a疏水性绝缘部       3碳纳米管
4酶                  11固定层(流出防止部，规定的层)
100、100A酶传感器    100a气体透过膜(规定的膜)
200基板              200a分析部
200b疏水性绝缘膜     L碳纳米管层
具体实施方式
下面参照附图对本发明中涉及的酶电极和采用该酶电极的酶传感器的具体实施方式进行详细地说明。然而，发明的范围并非限于该图示例之中。
本发明的酶电极1，例如，如图1所示，构成为具有：电极2、具有从电极2和/或固定于电极2之上的金属催化剂直接延伸出来的多个碳纳米管3的碳纳米管层L、通过夹持于碳纳米管3彼此之间而固定于碳纳米管层L的酶4等。
酶4例如为氧化还原酶。
然而，酶4不限于氧化还原酶，只要是酶(酶蛋白质)即可，例如还可以是水解酶、转移酶、异性化酶等。
另外，酶4既可以是原本的酶分子，也可以是含活性部位的酶断片。该酶分子或含该活性部位的酶断片，例如可以是由动植物或微生物中萃取而来，也可以是按照所希望的那样将其切断而成，也可以是通过基因工学或化学合成而成。
具体的，作为氧化还原酶，例如可以是，葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆甾醇氧化酶、乙醇氧化酶、甲醛氧化酶、山梨醇氧化酶、果糖氧化酶、肌氨酸氧化酶(ザルコシンオキシダ一ゼ)、果糖胺氧化酶、丙酮酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶(サルコシンオキシダ一ゼ)、胆碱氧化酶、胺氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、甲醛脱氢酶、山梨醇脱氢酶、果糖脱氢酶、羟丁酸脱氢酶、丙三醇脱氢酶、谷氨酸酯脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、尿酸酶等。除此之外，可以采用胆甾醇酯酶、肌酸酶、肌酸脱水酶、DNA聚合酶、进一步，可以采用这些酶的突变体等。
作为水解酶，例如可以采用蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、脲酶、酯酶、核酸酶组、磷酸酶组等。
作为转移酶，例如可以采用各种酰基转移酶、激酶组、转氨酶组等。
作为异性化酶，例如可以采用消旋酶组、磷酸甘油酸转磷酸酶、葡萄糖6-磷酸异构酶等。
固定于碳纳米管层L的酶4既可以是1种酶也可以是2种以上的酶。
具体的，固定于碳纳米管层L的酶4，例如可以是1种酶，也可以是分子量和/或尺寸(直径)大致相同的2种以上的酶，还可以是分子量和/或尺寸不同的2种以上的酶。另外，在固定于碳纳米管层L之上的酶4为2种以上的场合中，酶4例如可以是作用于同种标的物质(基质)的2种以上的酶，也可以是作用于不同种标的物质的2种以上的酶，还可以是作用于同种和/或不同种标的物质的2种以上的酶。
另外，在固定于碳纳米管层L的酶4为2种以上的场合，其2种以上的酶可以是夹于碳纳米管层L上的各碳纳米管3之间，也可以是夹于同一碳纳米管3之间。
其中，特别是，固定于碳纳米管层L的酶4为2种以上，且该2种以上的酶作用于不同种标的物质时，酶传感器100可同时检测出该不同种标的物质(2种以上的标的物质)。
本发明的酶传感器100，例如为采用酶电极1利用电化学测量法检测标的物质的传感器。
具体的，酶传感器100，例如如图2所示，构成为具有：基板200；设于基板200的上表面的于其上表面具有开口部的分析部200a；设于位于基板200的上表面的分析部200a的周围的疏水性绝缘膜200b；配置于位于基板200的上表面的分析部200a的内部的作用电极(酶电极1)、对电极300及参照电极400；通过配线与作用电极(酶电极1)、对电极300及参照电极400连接的衬垫部件500，500，500等。
<酶传感器的制造方法>
下面参照图3对酶传感器100的制造方法进行说明。
首先，如图3(a)所示，在基板200上，做出作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的3极结构的图案。
具体的，例如采用公知的光刻法和剥离法或蚀刻法，在基板200上，做出作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的3极结构的图案。
更具体的，例如采用旋涂法在基板200上涂布适量的光抗蚀剂。然后，采用紫外曝光装置进行数秒的曝光，转印作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的三极结构的光掩模图案。接着，进行后烘烤处理，之后，在显影液中进行显影，形成光抗蚀剂的图案。然后，利用溅射法，例如成膜膜厚为几百nm左右的金属薄膜，之后，利用剥离法，将光抗蚀剂剥离而形成三极电极。
其中，基板200，例如，只要为绝缘性基板即可，不做特别限定，但是，考虑到碳纳米管3的合成，优选采用例如耐热玻璃、硅、石英、蓝宝石等具有耐热性的平滑的基板。
另外，作为利用溅射法成膜的金属薄膜，例如可以是金、白金、铜等贵金属。
另外，作为在基板200上，作出作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的3极结构的图案的方法，并不限于上述方法。例如，金属薄膜的成膜方法，不限于溅射法，还可以采用蒸镀法。
接下来，如图3(b)所示，在作用电极(电极2)上，形成具有多个碳纳米管3的碳纳米管层L。
其中，碳纳米管3在电极2上和/或形成于电极2上的金属催化剂上直接合成。由此，酶电极1具有下述特点，即，在电极2和碳纳米管3之间不存在肖特基势垒，接触电阻小。
另外，碳纳米管3的间隔设定为可以将酶4夹持于碳纳米管3之间的大小。即，碳纳米管3的间隔根据酶4的尺寸(直径)进行控制。具体的，碳纳米管3，例如以位于1nm到100nm的范围内的规定的间隔(对应固定化酶4的尺寸(直径)的间隔)控制密度。其中，在酶4形成多聚体时，固定化的酶4的尺寸(直径)可以控制为多聚体的尺寸(直径)。其中，多聚体指的是2个以上的酶(蛋白质)直接或通过水等低分子结合形成的化合物。该结合包含共价键、离子键、氢键、配位键。另外，这些键的种类没有特别限制。
碳纳米管层L，可以为单层，也可以是多层，也可以两者混合。
具体的，例如，采用光刻法或纳米压印光刻法等在作用电极(电极2)上形成规定的微小图案，采用含浸法等在该图案上负载金属催化剂图案。然后，以该金属催化剂图案为起点，采用化学蒸镀法(CVD法)等使碳纳米管3生长。
其中，作为金属催化剂，优选采用铁、钴、镍等活性金属。
作为在作用电极(电极2)上形成具有多个碳纳米管3的碳纳米管层L的方法，不限于上述的方法。例如，作为从金属催化剂开始的碳纳米管3的生长方法，考虑工艺温度等，优选尽量采用热化学蒸镀法(热CVD法)，但并非特别限定于此。
另外，尽管使碳纳米管3从固定于作用电极(电极2)上的金属催化剂直接延伸出来，但并非限于此，例如可以从电极2直接延伸出来，也可以是从金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管3和直接从电极2延伸出来的碳纳米管3混合。
作为使碳纳米管3直接从电极2延伸出来的方法，例如可以考虑采用具有作为金属催化剂功能的金属形成作用电极(电极2)的方法。
具体的，例如，采用铁、钴、镍等铁族金属、至少含有1种以上的这些铁族金属的合金、或者优选采用热处理对这些铁族金属或该合金进行强氧化而使之氧化的金属氧化物作为基板200，然后，采用溅射法等，用硅或玻璃等绝缘膜涂布基板200上的除作用电极(电极2)、对电极300及参照电极400以外的区域，从而制作形成三极电极的基板200。然后，以具有金属催化剂功能的金属(铁族金属、其合金、使铁族金属或其合金氧化的金属氧化物)所形成的作用电极(电极2)为起点，采用化学蒸镀法(CVD法)等使碳纳米管3生长，使碳纳米管3从电极2直接延伸出来。
另外，尽管在作用电极(电极2)上仅形成碳纳米管3，但并非限于此，例如，如图4所示，也可以通过铝或硅等阳极氧化，在作用电极(电极2)上形成具有细孔的阳极氧化膜21，于该细孔内部的作用电极(电极2)上，形成碳纳米管3。
具体的，例如，也可以是，利用铝或硅等阳极氧化，在作用电极(电极2)上制作具有细孔的阳极氧化膜21，在该细孔中埋入金属催化剂，以该金属催化剂作为起点生长碳纳米管3，由此，在位于细孔的内部的作用电极(电极2)上，形成碳纳米管3。
另外，例如，也可以是，在由白金等金属薄膜构成的作用电极(电极2)上，形成由金属催化剂层构成的金属催化剂层，在该金属催化剂层上形成铝或硅等的膜，然后，通过阳极氧化该膜形成从该膜表面到金属催化剂层的表面贯通的细孔，制成在作用电极(电极2)上具有细孔的阳极氧化膜21。以通过该细孔露出的金属催化剂层作为起点生长碳纳米管，由此，在位于细孔的内部的作用电极(电极2)上，形成碳纳米管3。
另外，例如，也可以是，在作用电极(电极2)上，形成具有从阳极氧化膜21的表面到金属催化剂层的表面贯通的细孔的阳极氧化膜21，在该阳极氧化膜21的上表面形成由金属催化剂构成的金属催化剂层，然后，例如，加热基板200，使金属催化剂扩散，使金属催化剂从阳极氧化膜21的表面消失，仅在位于细孔内部的作用电极(电极2)的表面上形成凝聚成岛状的金属催化剂粒子，以该金属催化剂粒子为起点，生长碳纳米管3，由此，在位于细孔的内部的作用电极(电极2)上，形成碳纳米管3。
如图4所示，在位于阳极氧化膜21的细孔的内部的作用电极(电极2)上形成的碳纳米管3，从阳极氧化膜21的细孔的底部向上方生长。然后，碳纳米管3可以考虑根据其生长时间采用2种不同的形状。即，如果在不充分的生长阶段停止碳纳米管3的生长，例如如图4(a)所示，则可以在阳极氧化膜21的细孔的内部得到与阳极氧化膜21的细孔平行形成的取向性好的碳纳米管3。另一方面，通过进行充分的生长，如图4(b)所示，则可以得到，在阳极氧化膜21的细孔的内部形成平行于阳极氧化膜21的细孔而在阳极氧化膜21的细孔的外部随机形成的碳纳米管3。
另外，根据阳极氧化膜21的厚度，也可以控制配置于阳极氧化膜21的细孔内部的碳纳米管3的长度。
其中，酶4可以夹于碳纳米管3之间，也可以是夹于碳纳米管3之间的方式和缠绕在碳纳米管3上的方式相混合的模式。
另外，位于阳极氧化膜21的细孔的外部中的碳纳米管3，可以为互相缠绕的情形，也可以例如如图4(b)所示的互相没有缠绕的情形，还可以是互相缠绕和互相没有缠绕相混合的模式。
接下来，如图3(c)所示，采用溅射法等，在作用电极(电极2)的周围和分析部200a的周围形成如SiO等疏水性薄膜。下面，将形成于作用电极(电极2)周围的疏水性薄膜称为疏水性绝缘部2a，将形成于分析部200a的周围的疏水性薄膜称为疏水性绝缘膜200b。
进一步，通过在上述形成的作用电极(电极2)、对电极300及参照电极400的三极结构的图案中的参照电极400的图案上涂布银/氯化银墨并进行烘烤，从而制作银/氯化银电极即参考电极400。
接着，在碳纳米管层L上将酶4固定化。
具体的，如图3(d)所示，在形成于作用电极(电极2)上，或者在形成于在作用电极(电极2)之上形成的阳极氧化膜21的细孔的内部的碳纳米管层L上，采用吸液管或分配器等滴下酶溶液S。由此，酶4物理地固定于碳纳米管层L上。
此时，通过形成于作用电极(电极2)的周围的疏水性绝缘部2a的影响，通过吸液管或分配器等滴下的酶溶液S仅与作用电极(电极2)接触而保持为球形并且蒸发。然后，酶4在作用电极(电极2)上的碳纳米管层L上高浓度浓缩。由此，可仅在作用电极(电极2)上的碳纳米管层L上实现高密度的酶4的固定化。
固定酶4的碳纳米管层L优选在固定化后进行干燥处理。
接下来，如图3(e)所示，优选地，形成具有作为用于防止固定于碳纳米管层L的酶4流出的流出防止部功能的规定的层(以下称为固定层11)，覆盖碳纳米管层L。
其中，固定层11只要是防止固定于碳纳米管层L的酶4的流出且透过标的物质的层即可，不做特别限定。具体的，固定层11可以是亲水性的，也可以是疏水性的，可以是无机物，也可以是有机物，可以是多孔体，也可以是纤维质物质，可以采用高分子凝胶，也可以采用光交联性树脂，也可以采用其他的公知的固定层。
另外，还可以是，将和蛋白质酶4具有的胺基反应形成酰胺键的羧基(流出防止部)导入碳纳米管3的末端，将酶4以化学结合的方式固定于碳纳米管层L上，防止固定于碳纳米管层L的酶4流出。
另外，也可以是，采用公知的酶固定法防止固定于碳纳米管层L上的酶4的流出。
具体的，例如可以将规定的交联剂(流出防止部)导入碳纳米管层L。即，可以在碳纳米管中导入导电性高分子，通过导电性高分子的交联将酶4固定化，也可以采用戊二醛等的交联而将酶4固定化，也可以采用光交联性树脂等的交联将酶4固定化。
例如，采用聚苯胺等导电性高分子，将碳纳米管3和酶4一起交联，则多个碳纳米管3通过多个交联部位而呈网眼结构状态，在能够以物理方式更牢固固定碳纳米管3的电极结构的同时，由于可增加比表面积，所以还能导致进一步的灵敏度的提高和响应速度的提高。
其中，为了防止固定于碳纳米管层L上的酶4的流出，可以用固定层11覆盖碳纳米管层L，也可以在碳纳米管3的末端导入羧基，还可以将规定的交联剂导入碳纳米管层L中。另外，也可以是，覆盖碳纳米管层L的固定层11、导入碳纳米管3末端的羧基和导入碳纳米管层L规定的交联剂这三种方式中的任何2种或3种方式并用，以防止固定于碳纳米管层L的酶4的流出。
流出防止部不限于采用固定层11、采用羧基以及采用规定交联剂，只要是能够防止固定于碳纳米管层L的酶4的流出即可。
然而，由于酶4为分子量为1万～20万左右的蛋白质，所以有时酶分子内的活性中心难以实现和电极2或碳纳米管3一样快的电子迁移。所以，优选地，在碳纳米管层L中，导入用于促进酶4和电极2或碳纳米管3之间的电子的传送的电子传送体。另外，即便在反应速度取决于所溶存的氧的浓度而仅能测定低浓度的试样的场合，为了扩大检测范围而在碳纳米管层L中导入电子传送体也是很有效的。
具体的，作为电子传送体，例如可以采用铁氰化钙、二茂铁、二茂铁介电体、苯醌、醌介电体、锇络合物等。
另外，在碳纳米管层L上，优选例如导入用于催化酶4的活性的辅酶。
例如，在酶4和标的物质的反应为经由不稳定的中间体的反应等在酶4的氨基酸侧链的催化作用下不容易推进的反应的场合中，多使用具有适当的结构的与酶反应的表达有关的低分子量的有机化合物辅酶。具体的，作为酶4，在采用辅酶依赖型酶的场合中，通过导入碳纳米管层L的辅酶，从而能够有效进行酶反应。
可以根据酶4(辅酶依赖型酶)的种类，适当选择辅酶。具体的，作为辅酶，例如可以采用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、辅酶I、辅酶II、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、硫辛酸、辅酶Q等的1种或2种以上的组合。其中，优选采用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)等NAD系辅酶。
在碳纳米管层L中导入电子传送体及辅酶的场合中，例如，可以采用戊二醛或光交联性树脂等交联剂，将电子传送体及辅酶固定于碳纳米管层L上，也可以是，使电子传送体或辅酶溶解于酶溶液S中，将电子传送体及辅酶和酶4一起固定于碳纳米管层L上，还可以是，将电子传送体及辅酶作为导电性高分子，采用物理或化学方式结合而固定于碳纳米管3中。另外，还可以是，配置成使电子传送体或辅酶溶解分散于电解液中，将之于酶电极1使用时滴入分析部200a内。
进一步，作为利用酶传感器100的电化学测量法，可以采用测量氧化电流或还原电流的计时安培分析法、电量测定法、循环伏安法等公知测量法。作为测定方式，可以是一次性处理(デスポ一ザブル)方式、成批方式、流动注射方式等的任何一种。
优选地，在测定时，安装利用酶电极1的酶传感器100的测定器本体，例如具有以有线或无线方式将数据传送至个人电脑的功能，能够实时(realtime)确认测定值。另外，优选地，构成为可安装多种酶传感器100，具有能够对多种酶传感器100的检测结果同时进行测量，对数据进行相互比较以及进行研究的功能。
接下来，参照图5对使用本发明酶电极1的酶传感器100通过电化学测量法来测定试样中的标的物质的浓度的原理进行说明。
在图5中，例如，氧化型酶(酶4)夹于碳纳米管3之间而固定于碳纳米管层L上。固定化的氧化型酶在选择性催化剂作用下氧化试样中的标的物质基质，形成还原型酶。接下来，如果使作用电极(电极2)为正，在作用电极和参照电极400之间施加电压，则还原型酶直接地或通过电子传送体间接地将电子(e-)迁移到作用电极(电极2)或形成于作用电极(电极2)上的碳纳米管电极(碳纳米管3)之上，恢复成氧化型酶。此时，在作用电极(电极2)和参照电极400之间，流过将还原型酶或还原型电子传送体再氧化的电流。该电流值由于和酶反应速度的大小即含于试样中的基质浓度成比例，所以能够由该电流值计算出含于试样中的标的物质的浓度。
具体的，在例如将葡萄糖作为标的物质而测定其浓度时，作为酶4可以采用葡萄糖氧化酶，作为电子传送体可以采用铁氰化钙。如下式(1)所示，葡萄糖(C6H12O6)通过酶4而转换成葡萄糖酸(C6H12O7)，同时，给予电子传送体铁氰离子([Fe(III)(CN)6]3-)以电子(e-)，使其还原成亚铁氰离子([Fe(II)(CN)6]4-)。通过酶4还原的亚铁氰离子如下式(2)所示，进一步通过电极2或碳纳米管3氧化成铁氰离子。另一方面，在对电极300中，如下式(3)所示，氢离子(H+)接受电子而和氧(O2)一起生成水。通过测定此时的电流值，可以间接地测定葡萄糖浓度。
C6H12O6+2[Fe(CN)6]3-+H2O→C6H12O7+2[Fe(CN)6]4-+2H+  (1)
2[Fe(CN)6]4-→2[Fe(CN)6]3-+2e-                      (2)
2H++1/2O2+2e-→H2O                                  (3)
另外，在测量时，通过将作用电极(电极2)对参照电极400的电压设定为特定电压，能够避免妨碍测量的物质的影响，能够以高灵敏度且选择性地测定标的物质。该设定电压根据标的物质不同而不同。
另外，对于采用本发明酶电极1的酶传感器100而言，需要根据标的物质的不同而变换酶4的种类。具体的，作为酶4，例如，在标的物质为葡萄糖的场合中可以为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶、在标的物质为乙醇时可以为乙醇氧化酶或乙醇脱氢酶、在标的物质为甲醛时可以为甲醛氧化酶或甲醛脱氢酶、在标的物质为总胆甾醇时可以为胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶的混合物等。
下面根据具体的实施例对本发明进行说明。
实施例1
在实施例1中，通过制作基底基板并将酶4固定于基底基板上，形成酶电极1，制成酶传感器100。然后对酶传感器100进行评价。
(1)基底基板的制作
首先，制作基底基板。
(1-1)电极的制作
在基板200上，作出作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的三极结构的图案。
具体的，例如，采用电炉(hot plate)对石英玻璃制基板200在95℃下进行90秒的前烘烤。之后，采用旋涂法涂布50μL的负性抗蚀剂，用紫外曝光装置转印作用电极(电极2)、对电极300及参照电极400的三极结构的光掩模图案。然后，在120℃下进行60秒的后烘烤，之后，在显影液中进行70秒的显影，之后用蒸馏水清洗。接着，采用溅射法，成膜膜厚为800nm的金属薄膜(白金薄膜)，之后，用剥离法将基板200在丙酮中浸泡并用超声波清洗30分钟，将抗蚀剂剥离而形成白金电极。白金层的成膜条件为，真空度为10-5Pa、基板温度为60℃、氩气的流量为40sccm。
(1-2)阳极氧化膜的制作
然后，在作用电极(电极2)上，制作具有细孔的多孔体阳极氧化膜21。
具体的，例如采用溅射法，在作用电极(电极2)上成膜膜厚为100nm的Ti层作为下层，于之上成膜膜厚为500nm的Al层。接下来，在17℃的溴酸水溶液(0.3M)中浸渍，对作用电极(电极2)施加DC40V的电压，以进行阳极氧化处理。在阳极氧化处理期间，为了检测阳极氧化是否到达Ti膜，对阳极氧化电流进行检测。通过阳极氧化处理，Al被氧化而形成绝缘层氧化铝，同时形成贯通纳米孔(细孔)。然后，在阳极氧化处理之后，用蒸馏水和异丙醇清洗。使用TEM(Transmission Electron Microscope)观察形成于作用电极(电极2)上的阳极氧化膜21的表面，可观察到以约300nm的间隔形成直径约60nm的细孔。
(1-3)制作碳纳米管
接下来，在作用电极(电极2)上制作碳纳米管3。
具体的，例如，将基板200在硝酸钴水溶液(0.2M)中浸渍10分钟。在拿出基板200之后，在400℃下于空气中将基板200加热3小时，在位于阳极氧化膜21的细孔内部的作用电极(电极2)的表面上，负载钴粒子，形成金属催化剂图案。之后，采用热化学气相生长炉进行热化学蒸镀反应(热CVD法)，在作用电极(电极2)上将钴作为催化剂而直接形成碳纳米管3。供给气体为流量为360sccm的氩气以及流量为120sccm的作为碳源的丙烯，反应温度为700℃，反应时间为8分钟，压力为0.1Mpa。通过反应在作用电极(电极2)上直接形成的碳纳米管直径为约10nm，以约8nm的间隔进行图案化而形成。
(1-4)基底基板的精加工
接下来，进行基底基板的精加工。
具体的，采用溅射法，在作用电极(电极2)的周围和分析部200a的周围，形成膜厚为500nm的SiO薄膜，从而在作用电极(电极2)的周围制成疏水性绝缘部2a的同时，在分析部200a的周围制成疏水性绝缘膜200b。然后，在参照电极400的图案上涂布银/氯化银墨(BAS社制)，在120度下烧结，制成银/氯化银电极即参照电极400。
如上所述，制成基底基板。
(2)酶传感器400的制作
接下来，通过将酶4固定于位于基底基板上的碳纳米管层L上形成酶电极1，制成酶传感器400。
作为酶4，采用辅酶(NAD+)依赖性酶即甲醛脱氢酶。
具体的，例如，首先，将10μmol的萘醌溶解于1000μL的磷酸缓冲液(pH7.5)中，制成溶液A。另外，在100μL的磷酸缓冲液(pH7.5)中混合0.25μmol的NAD+和0.5U的甲醛脱氢酶，在4℃下搅拌溶解30分钟制成溶液B。进一步，将50mL的光交联性树脂(东洋合成制)溶解于50mL的磷酸缓冲液中，调成pH＝7.5，制成溶液C。
然后，用微量吸液管吸取20μL溶液A，滴在作用电极(碳纳米管层L)上，在室温(25℃)下自然干燥3小时。然后，用微量吸液管吸取20μL的溶液B，滴在作用电极(碳纳米管层L)上，在室温(25℃)下自然干燥3小时。滴下的溶液通过作用电极(电极2)周围的疏水性绝缘部2a而仅接触作用电极(碳纳米管层L)，其保持球形并且蒸发。进一步，用微量吸液管吸取10μL溶液C，滴在作用电极(碳纳米管层L)上，通过波长360nm的紫外线照射而光交联，在室温(25℃)下静置2小时。这样，形成酶电极1，得到酶传感器100。
另外，还可以是，用微量吸液管吸取1μL的2％(v/v)戊二醛溶液，涂布于作用电极(碳纳米管层L)上，以替代用微量吸液管提取10μL溶液C，滴在作用电极(碳纳米管层L)上。
(3)酶传感器100的评价
下面进行对照实验以对酶传感器100进行评价。
首先，为了进行对照实验，通过在矿物油中混合碳纳米管和酶(甲醛脱氢酶)并涂布于白金电极(作用电极)上，以制成将酶固定化的现有技术的酶传感器[1]，以及通过仅将酶(甲醛脱氢酶)涂布于白金电极(作用电极)上，制成将酶固定化的现有技术的酶传感器[2]。
具体地讲，现有技术的酶传感器[1]，例如，是将10mg的碳纳米管、1μmol的萘醌、0.25μmol的NAD+，0.5U的甲醛脱氢酶混合于添加了50μL的矿物油的100μL的磷酸缓冲液(pH7.5)中，在4℃下搅拌、溶解30分钟。用微量吸液管吸取20μL的该溶液，滴下在上述“(1-1)电极的制作”中制作的作用电极(电极2)上并浓缩固定于作用电极上。进一步，用微量吸液管吸取10μL的溶液C，滴下于作用电极上，通过波长为360nm的紫外线照射而光交联。这样，得到现有技术的酶传感器[1]。
另外，现有技术的酶传感器[2]，例如，是将1μmol的萘醌、0.25μmol的NAD+，0.5U的甲醛脱氢酶混合于100μL的磷酸缓冲液(pH7.5)中，在4℃下搅拌、溶解30分钟。用微量吸液管吸取20μL的该溶液，滴下在上述“(1-1)电极的制作”中制作的作用电极(电极2)上并浓缩固定于作用电极上。进一步，用微量吸液管吸取10μL的溶液C，滴下于作用电极上，通过波长为360nm的紫外线照射而光交联。这样，得到现有技术的酶传感器[2]。
接下来，参照图6对评价本发明的酶传感器100、现有技术的酶传感器[1]、和现有技术的酶传感器[2]进行评价的测定装置D进行说明。
测定装置D，例如，具有标准空气生成器D1、气体生成器D2、水蒸气起泡器D3、微腔D4、恒电位计D5、A/D转换器D6、电脑D7等而构成。
微腔D4通过疏水性多孔膜分成液相用微单元D41和气相用微单元D42。
液相用微单元D41的尺寸与设于分析部200a的上表面的开口部的尺寸相符合，酶传感器100(酶传感器100、现有技术的酶传感器[1]以及现有技术的酶传感器[2])设置成，分析部200a的上方通过O环而配置于液相用微单元D41的下侧。
在气相用微单元D42中，由气体生成器D2导入规定浓度的甲醛气体。
由此，酶4(甲醛脱氢酶)的基质(标的物质)甲醛从气相用微单元D42经由疏水性多孔膜和液相用微单元D41供给至分析部200a的内部。
作用电极(电极2)、对电极300及参照电极400通过来自各自对应的衬垫部件500的导线，与恒电位计D5(BAS制：BAS-100B)连接。
在测定装置D中，将30μL的磷酸缓冲液(0.1mM、pH7.5)作为电解液滴下液相用微单元D41中，相对参照电极400对作用电极施加+100mV的电位。然后，在室温(25℃)下通过气体生成器D2而浓度连续变化的甲醛气体导入气相用微单元D42中，采用基于电流分析法的电流测量进行测定。其结果在图7～图9中示出。
在图7中，横轴表示甲醛浓度，纵轴表示响应电流，实线及四方块(■)表示本发明的酶传感器100、虚线及菱形块(◆)表示现有技术的酶传感器[1]、点划线和三角块(▲)表示现有技术的酶传感器[2]。
根据图7可见，本发明的酶传感器100在甲醛浓度为0.5ppm的场合，与现有技术的酶传感器[1]相比具有15倍的检测灵敏度，与现有技术的酶传感器[2]相比具有117倍的检测灵敏度。即，可以看出，本发明的酶传感器100与现有技术的酶传感器[1]和现有技术的酶传感器[2]相比，检测灵敏度大副度提高。另外，还可看出，在高浓度区的线形响应区也显著得到提高。因此可见，本发明的酶传感器100能够高灵敏度检测标的物质。
在图8中，横轴表示时间，纵轴表示响应电流，实线表示本发明的酶传感器100，虚线表示现有技术的酶传感器[1]，点划线表示现有技术的酶传感器[2]，表示在50秒时刻导入1ppm的甲醛时的所输出的响应电流的变化。
据图8可见，现有技术的酶传感器[1]自导入甲醛到100秒后示出响应，现有技术的酶传感器[2]自导入甲醛到150秒后示出响应，与之相对的，本发明的酶传感器100自导入甲醛到30秒后示出响应。即，可见，本发明的酶传感器100，与现有技术的酶传感器[1]和现有技术的酶传感器[2]相比，响应时间大幅度缩短。另外，还可看出，本发明的酶传感器100，与现有技术的酶传感器[1]和现有技术的酶传感器[2]相比，输出响应电流的倾度要大。因此，可看出，本发明的酶传感器100可以高速检测标的物质。
在图9中，横轴表示时间，纵轴表示相对响应(即，将开始的响应电流取为100％时的响应电流)，实线及四方块(■)表示本发明的酶传感器100，虚线及菱形块(◆)表示现有技术的酶传感器[1]，点划线和三角块(▲)表示现有技术的酶传感器[2]。
根据图9，本发明的酶传感器100，与现有技术的酶传感器[1]和现有技术的酶传感器[2]相比，响应电流的经时变化非常小，20日之后其相对响应仍然为90％。因此可见，本发明酶传感器100具有优良的稳定性且长寿命。
根据以上说明的本发明的酶电极1和采用该酶电极1的酶传感器100，酶电极1具有：电极2；具有从电极2和/或固定于电极2上的金属催化剂直接延伸出来的多个碳纳米管3的碳纳米管层L；通过夹于碳纳米管3之间而固定于碳纳米管层L的酶4。
即，由于通过将酶4夹于碳纳米管3彼此之间而能够将酶4牢固固定于碳纳米管层L内，所以能够提供一种可防止酶4的立体结构的变化，具有优良的稳定性且长寿命的酶电极1，以及采用该酶电极1的酶传感器100(例如参照图9的结果)。
另外，由于碳纳米管层L比表面积非常大，所以能够以大的吸附量高浓度固定酶4，而且，由于碳纳米管3直接从电极2和/或固定于电极2之上的金属催化剂延伸出来，所以在碳纳米管3和电极2之间没有形成肖特基势垒，基于这样的特征，所以能够提供一种能以高灵敏度检测标的物质的酶电极1和采用该酶电极1的酶传感器100(例如参照图7的结果)。
另外，由图7的结果可看出，本发明的酶传感器100，即使在低浓度区域抑或在高浓度区域，也能够以非常高的灵敏度检测标的物质，即，其为具有宽范围的检测区域的传感器。
进一步，碳纳米管3也起到作为电极2的作用，由此，由于酶4夹于碳纳米管电极(碳纳米管3)彼此之间，故而可高效进行酶4和碳纳米管电极(碳纳米管3)之间的电子传送，所以，能够提供一种能高速检测标的物质的酶电极1和采用该酶电极1的酶传感器100(例如参照图8的结果)。
另外，例如，采用醌作为电子传送体、金电极作为电极2，则酶电极1和使用酶电极1的酶传感器100具有更好的效果。
具体的，醌系的电子传送体在金电极处并未完全还原，不具有电子传送体的作用。然而，如果在形成于金电极(电极2)上的碳纳米管层L上导入醌作为电子传送体的话，醌快速还原成氢醌。即，醌起到了一个优异电子传送体的作用。
因此，如果采用本发明的酶电极1和使用该酶电极1的酶传感器100，则即使电极2为金电极，则醌系的电子传送体也能实现充分的功能。
本发明不仅限于上述的实施形态，在不脱离其主旨的范围内可进行适当的变更。
例如，在实施例1中，在电极2上设置阳极氧化膜21，在位于该阳极氧化膜21的细孔内部的电极2上形成碳纳米管3，但是并非必须在电极2上设置阳极氧化膜21。
下面就此时的具体的基底基板的制作方法进行例示。
(A)电极的制作
首先，在基板200上，制作作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的三极结构的图案。
具体的，例如，采用电炉对石英玻璃制基板200在95℃下进行90秒的前烘烤。之后，采用旋涂法涂布50μL的负性抗蚀剂，用紫外曝光装置转印作用电极(电极2)、对电极300及参照电极400的三极结构的光掩模图案。然后，在120℃下进行60秒的后烘烤，之后，在显影液中进行70秒的显影，之后用蒸馏水清洗。接着，采用溅射法，成膜膜厚为800nm的金属薄膜(白金薄膜)，之后，用剥离法将基板200在丙酮中浸泡并用超声波清洗30分钟，将抗蚀剂剥离而形成白金电极。白金层的成膜条件为，真空度为10-5Pa、基板温度为60℃、氩气的流量为40sccm。
(B)碳纳米管的制作
接下来在作用电极(电极2)上制作碳纳米管3。
具体的，采用旋涂法在作用电极(电极2)上涂布50μL的负性抗蚀剂，用紫外曝光装置转印在作用电极(电极2)上形成金属催化剂图案形状的光掩模图案(例如图案尺寸为孔径2μm、孔间隔4μm)。然后，在120℃下进行60秒的后烘烤，之后，在显影液中进行70秒的显影，之后用蒸馏水清洗。
接着，采用真空蒸镀装置，成膜膜厚为100nm的镍薄膜，之后，用剥离法将基板200在丙酮中浸泡并用超声波清洗30分钟，将抗蚀剂剥离而在作用电极(电极2)上形成镍薄膜的金属催化剂图案。成膜条件为，真空度为10-5Pa、基板温度为60℃、氩气的流量为40sccm。
之后，采用热化学气相生长炉进行热化学蒸镀反应(热CVD法)，将镍作为催化剂在作用电极(电极2)上直接形成碳纳米管3。
(C)基底基板的精加工
接下来进行基底基板的精加工。
具体的，采用溅射法，在作用电极(电极2)的周围和分析部200a的周围，形成膜厚为500nm的SiO薄膜，从而在作用电极(电极2)的周围制成疏水性绝缘部2a的同时，在分析部200a的周围制成疏水性绝缘膜200b。然后，在参照电极400的图案上涂布银/氯化银墨(BAS社制)，在120度下烧结，制成银/氯化银电极参照电极400。
如上，便制作完成在电极2上仅形成碳纳米管层L的基底基板。通过将酶4固定于该基底基板上的碳纳米管层L，制成酶传感器400。
另外，对于本发明的酶传感器，还可以如图10所示的酶传感器100A那样，具有覆盖分析部200a的开口部并作为用于抑制液体透过且使气体分子透过的规定的膜的气体透过膜100a。
通过具有气体透过膜100a，从而抑制滞留于分析部200a中的电解液的透过(从分析部200a内部向分析部200a外部透过)，并且仅使气体分子透过酶电极1侧(从分析部200a外部向分析部200a内部透过)，能够在酶电极1中检测出该气体分子。
作为作用电极(电极2)、对电极300和参照电极400的一个例子，例如，如图1等所示，使用由光刻法制作的微小电极，但是，这些电极其大小、形状、结构并没有作出特别限定。
具体的，例如，这些电极可以是市售的电解单元、测定单元等中使用的大的电极，也可以是盘电极、转动环盘电极、纤维电极等，还可以是例如采用光刻等公知微细加工技术制作的微小电极(圆盘电极、圆筒电极、带状电极、排列带状电极、排列圆盘电极、环电极、球状电极、梳形电极、对电极等)。

Claims (13)

1.一种酶电极，其特征在于，具有：电极；具有多个从上述电极和/或固定于上述电极上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管的碳纳米管层；以及，通过夹持于上述碳纳米管彼此之间而固定于上述碳纳米管层的酶。
2.如权利要求1所述的酶电极，其特征在于，具有用于防止固定于上述碳纳米管层的酶的流出的流出防止部。
3.如权利要求2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为覆盖上述碳纳米管层的规定的层。
4.如权利要求2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为导入上述碳纳米管层中的规定的交联剂。
5.如权利要求2所述的酶电极，其特征在于，上述流出防止部为导入上述碳纳米管的末端的与上述酶的氨基反应而形成酰胺键的羧基。
6.如权利要求1所述的酶电极，其特征在于，在上述碳纳米管层中导入电子传送体和/或辅酶，该电子传送体用于促进上述酶和上述电极或上述碳纳米管之间的电子传送，该辅酶用于催化上述酶的活性的表达。
7.如权利要求1所述的酶电极，其特征在于，具有设于上述电极周围的疏水性绝缘部。
8.一种酶电极，其特征在于，具有：电极；具有多个从上述电极和/或固定于上述电极上的金属催化剂直接延伸出来的碳纳米管的碳纳米管层；通过夹持于上述碳纳米管彼此之间而固定于上述碳纳米管层的酶；用于防止固定于上述碳纳米管层的酶的流出的流出防止部；导入上述碳纳米管层中的电子传送体和/或辅酶，该电子传送体用于促进上述酶和上述电极或上述碳纳米管之间的电子传送，该辅酶用于催化上述酶的活性的表达；以及，设于上述电极周围的疏水性绝缘部。
9.一种酶传感器，其特征在于，采用权利要求1或8所述的酶电极通过电化学测量法检测标的物质。
10.如权利要求9所述的酶传感器，其特征在于，具有基板以及设于上述基板的上表面的分析部，且上述酶电极配置在位于上述基板的上表面的上述分析部的内部。
11.如权利要求10所述的酶传感器，其特征在于，具有疏水性绝缘膜，该疏水性绝缘膜设在位于上述基板的上表面的上述分析部的周围。
12.如权利要求10所述的酶传感器，其特征在于，上述分析部的上表面形成开口部，且具有覆盖上述开口部的用于抑制液体透过且使气体分子透过的规定的膜。
13.一种酶传感器，采用权利要求1或8所述的酶电极通过电化学测量法检测标的物质，其特征在于，具有：基板；设于上述基板的上表面且于上表面具有开口部的分析部；设在位于上述基板上表面的上述分析部的周围的疏水性绝缘膜；以及、覆盖上述开口部的用于抑制液体透过且使气体分子透过的规定的膜，上述酶电极配置在位于上述基板的上表面的上述分析部的内部。
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PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
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