CN106990148A - 生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物传感器,所述生物传感器包括多个电极,所述多个电极包括工作电极;和检测层,该检测层固定在工作电极上并且含有交联剂、导电高分子以及向所述工作电极传递电子和从所述工作电极接收电子的酶。工作电极为开放系统。
Description
技术领域
本发明涉及一种一次性生物传感器。
背景技术
常规所使用的一次性生物传感器是通过下属方式形成的生物传感器:将含有酶和介质的试剂涂敷于放置在基材上的电极系统,并且使用间隔体和盖子形成毛细管以将液体样品吸取到毛细管中(例如专利文献1)。向生物传感器施加电压使得能够基于介质导致的扩散电流来测量样品中待测量物质的浓度。
引用列表
专利文献
专利文献1:日本专利第2901678号公报
发明内容
一次性生物传感器(例如,葡萄糖传感器)允许被吸取到毛细管中的样本(液体样品)溶解并扩散试剂并且将由酶反应产生的电流检测为响应电流。出于该原因,葡萄糖传感器的灵敏度受试剂中物质的扩散状况影响。对毛细管的维度(特别是高度)和体积进行限定,从而在传感器之间不造成由样本导致的试剂扩散状况的不一致性。
然而,毛细管的形成需要诸如间隔体和盖子等部件层叠在基板上,并且这些部件的存在是增加生物传感器的制造成本的因素。在具有毛细管的生物传感器中,使样本更靠近毛细管的吸入开口,以将样本引入到毛细管中。然而,适量的样本根据用户操作生物传感器的方式而不引入到毛细管中,从而在一些情况下无法适当测量样本中待测量物质的浓度。
本发明具有的目的是提供一种在降低制造成本的同时能够使测量时的操控更容易的生物传感器。
用于解决问题的方案
本发明一个方面是一种生物传感器,该生物传感器包括多个电极,所述多个电极包括工作电极;和检测层,该检测层固定在所述工作电极上,并且含有交联剂、导电高分子以及向所述工作电极传递电子和从所述工作电极接收电子的酶,其中,所述工作电极为开放系统。
在生物传感器中,所述检测层与所述工作电极的接触面积可以由预定面积来限定。
【发明效果】
根据本发明,可以提供一种能够使测量时的操控更容易且降低制造成本的生物传感器。
附图说明
图1是例示了根据实施方式的生物传感器的构造的示例的图;
图2是例示了测量设备的构造的示例的图;
图3是例示了由测量设备进行的处理序列的示例的流程图;
图4是描绘了基于测试1的使用计时安培分析法的葡萄糖浓度的测量结果的校准曲线的图;
图5是描绘了基于测试2的结果,具体为使用计时安培分析法的葡萄糖浓度的测量结果的校准曲线的图;
图6是描绘了基于使用实施例1的生物传感器进行的葡萄糖浓度的测量结果的S/B(样品/空白)比的图;
图7是描绘了基于使用比较例1的生物传感器进行的CV法和CA法的测量结果的S/B比的图;以及
图8是例示了根据第二实施方式的生物传感器的构造的示例的图。
具体实施方式
下文中将参照附图说明根据本发明的实施方式的酶电极。下面描述的实施方式的构造是例示性的,并且本发明不限于此。
【第一实施方式】
<生物传感器的构造>
图1是示意性地例示了根据实施方式的一次性生物传感器的构造的示例的图。在图1中,生物传感器1包括绝缘基板2、电极3、电极4、绝缘层5和试剂层(下文中称为“检测层”)6。生物传感器1不具有用间隔体和盖子形成的毛细管(在一些情况下不使用盖子)。特别是,至少工作电极为开放系统。
<<绝缘基板>>
绝缘基板2被形成为具有纵向方向和宽度方向的矩形平板的形式。绝缘基板2可以由诸如聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚乙烯(PE)等热塑性树脂、诸如聚酰亚胺树脂和环氧树脂等各种树脂(塑料)、或诸如玻璃、陶瓷和纸张等绝缘材料制成。
<<电极>>
电极3、4形成在绝缘基板2的一个表面2a上。电极3具有一个端部3a和另一个端部3b,并且另一个端部3b延伸到绝缘基板2的宽度方向并且用作工作电极。一个端部3a用作导引单元(电极引出单元)。电极4具有一个端部4a和另一个端部4b,并且另一个端部4b延伸到绝缘基板2的宽度方向,并且(与另一个端部3b(工作电极)设置有预定间隔),并且用作对电极。一个端部4a也用作导引单元(电极引出单元)。
电极3、4中的每一个使用诸如金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)或钯等金属材料或诸如碳等碳材料来形成。例如,通过由物理气相沉积(PVD,例如,溅射)或化学气相沉积(CVD)沉积金属材料形成膜,电极3、4可以被形成为具有期望厚度的金属层。另选地,电极3、4可以通过在绝缘基板2上丝网印刷含有碳材料的墨水而形成。另选地,电极3、4可以形成为通过丝网印刷形成膜而获得的银/氯化银电极。还可以使用三电极系统,其中,参比电极是银/氯化银电极、通过使用丝网印刷形成膜而获得的碳电极、或通过使用物理气相沉积(PVD,例如,溅射)或化学气相沉积(CVD)形成膜而获得的金属电极。
各种已知材料可应用为形成电极3、4的电极材料和用于绝缘基板2的材料。电极3、4和绝缘基板2的尺寸和厚度可以酌情确定。绝缘基板2和电极3、4的组合还称为“基材”。要注意的是,在实施方式中,包括工作电极和对电极的两电极系统被呈现为示例,但也可以采用还包括参比电极的三电极系统。
<<绝缘层>>
绝缘层5设置在基材上,形成开口5a从而使电极3、4的另一端部3b、4b暴露。电极3、4的一个端部3a、4a类似地进行设置从而被暴露。在开口5a处暴露的另一个端部3b用作工作电极,而另一个端部4b用作对电极。下文中,另一个端部3b可以由“工作电极3b”表示,而另一个端部4b可以由“对电极4b”表示。
绝缘层5还可以使用抗蚀剂墨水由丝网印刷而形成。另选地,绝缘层5还可以通过将上面形成有开口5a的树脂板贴附到基材上而形成。要注意的是,在一些情况下不设置绝缘层5。绝缘层5要防止噪声电流混入,并且由绝缘层5造成的开口5a处的水平差不会限定要贴附到电极(工作电极3b、对电极4b)的样品的分布(分散)范围。由此,生物传感器1不具有覆盖电极(工作电极3b、对电极4b)的毛细管(盖子或间隔体)。
<<检测层>>
检测层6固定在工作电极3b(所暴露的另一个端部3b)上。检测层6含有接触工作电极3b的酶、导电高分子和交联剂7,但不含有电子传递介质。检测层6可以含有糖和导电颗粒中的至少一种。
要使用根据实施方式的生物传感器测量的对象不是随待测量物质的扩散而改变的电流,而是基于电子从待测量物质向电极传递的电荷传递限制电流。这是当来自酶的电子由于酶和待测量物质的反应被传递到电极时产生的电流。电荷传递限制电流是不依赖时间的稳态电流,并且优选地是因电双层的充电造成的瞬态电流出现之后的稳态电流。
为了测量电荷传递限制电流,工作电极是“直接电子传递型酶电极”。这里使用的“直接电子传递型酶电极”指的是这样酶电极:电子通过酶与电极之间的直接电子传递而交换(即,酶向所述工作电极传递电子和从所述工作电极接收电子),从而使得由试剂层中酶反应产生的电子直接传递到电极或由导电高分子介导而传递到电极,而不涉及诸如电子传递介质等氧化还原物质。
要注意的是,即使当使用电子传递介质时,在电子传递介质被固定从而不扩散的情况下,可以测量电荷传递限制电流。
检测层6内酶的分子由交联剂交联,并且由于导电高分子而具有复杂的交织结构。由酶反应产生的电子可以直接或沿着具有导电性的导电高分子被传递到电极(工作电极3b)。如上所述,在根据实施方式的生物传感器中,电子通过检测层6中的直接电子传递在酶与工作电极3之间交换。
要注意的是,在生理反应系统中,发生直接电子传递的限制距离被认为是1nm至2nm。甚至在由电极和酶组成的电化学反应系统中的电子交换中,电极上的电子交换也难以在比上述限制距离更长的距离检测,除非涉及介质的传递(例如,由于扩散进行的传递)。因此,在检测层6内,酶的活性部位(由酶反应生成电子的部位)和导电高分子的导电部位位于适合于电子传递的距离内,具体地,导电部位和活性部位位置足够靠近,使得电子在它们之间适当传递。
(酶)
酶4的示例包括氧化还原酶。氧化还原酶的示例包括:葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、肌氨酸氧化酶、L-乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙三醇脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、细胞色素氧化还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶等。其中,糖的氧化还原酶是优选的。糖的氧化还原酶的示例包括:葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶以及山梨糖醇脱氢酶。
作为催化亚单元和催化域,氧化还原酶还可以包含吡咯喹啉醌(PQQ)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少一种。包含PQQ的氧化还原酶的示例包括PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)。包含FAD的氧化还原酶的示例包括细胞色素葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)和葡萄糖氧化酶(GOD),其具有含FAD的α-亚单元。
氧化还原酶还可以包含电子传递亚单元或电子传递域。电子传递亚单元的示例包括含有具有电子交换功能的血红素的亚单元。包含这种含血红素的亚单元的氧化还原酶的示例包括那些包含细胞色素的酶,并且例如,可以使用葡萄糖脱氢酶以及PQQGDH和细胞色素的融合蛋白。
包含电子传递域的酶的示例包括胆固醇氧化酶和喹啉并血红素(quinoheme)乙醇脱氢酶(QHEDH(PQQ Ethanol dh))。对于电子传递域来说,还优选的是,使用包含细胞色素(具有电子交换功能的血红素)的域。示例包括:“QHGDH”(融合酶;具有QHGDH的血红素域的GDH)、山梨醇脱氢酶(山梨醇DH)、D-果糖脱氢酶(果糖DH)、根癌农杆菌来源的葡萄糖-3-脱氢酶(来自根癌农杆菌的G3DH)以及纤维二糖脱氢酶。
应注意到,例如,在国际公报WO2005/030807中公开了PQQGDH和细胞色素的上述融合蛋白(其是包含细胞色素的亚单元的示例)和PQQGDH的细胞色素域(其是包含细胞色素的域的示例)。
而且,对于氧化还原酶来说,可以使用由至少催化亚单元和包含细胞色素(含有具有电子受体功能的血红素)的亚单元组成的寡聚酶。
不含有电子传递亚单元的氧化还原酶在可以用作本实施方式中的酶。示例是细胞色素葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)。Cy-GDH具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚单元γ。在本实施方式中,不具有电子传递亚单元β(含有催化亚单元α和γ)的Cy-GDH可以用作所述酶。
与具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚单元γ的Cy-GDH相比,不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH可以以低价格购买。出于该原因,当不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH用作要含有在检测层2中的酶时,可以降低酶电极的制造成本。
与具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚单元γ的Cy-GDH相比,不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH作为物质还具有更高的稳定性。这意味着与使用具有电子传递亚单元β、催化亚单元α和催化亚单元γ的Cy-GDH的酶电极(生物传感器)相比,使用不具有电子传递亚单元β的Cy-GDH的酶电极(生物传感器)可以存储更长时间。因此,可以获得用于电荷传递限制测量的并且产品寿命更长的酶电极。
(导电高分子(导电聚合物))
导电聚合物的示例包括:聚吡咯、聚苯胺、聚苯乙烯磺酸酯、聚噻吩、多异硫茚、聚乙烯二氧噻吩(聚(3,4-乙烯二氧噻吩)聚(苯乙烯磺酸盐)),及其组合等。作为聚吡咯,其商业产品的示例包括“SSPY”(乙基-3-甲基-4-吡咯羧酸酯)(由KAKENSANGYOU CORPORATION制造)等。作为聚苯胺,示例包括“AquaPASS 01-x”(由TA Chemical Co.,Ltd.制造)等。作为聚苯乙烯磺酸,示例还包括“Poly-NaSS”(由TOSOH ORGANIC CHEMICAL CO.,LTD.制造)等。作为聚噻吩,示例包括:“ESPACER 100”(由TA Chemical Co.,Ltd.制造)等。作为多异硫茚,示例包括“ESPACER 300”(由TA Chemical Co.,Ltd.制造)等。作为聚乙烯二氧噻吩(聚(3,4-乙烯二氧噻吩)聚(苯乙烯磺酸酯)),示例包括“PEDOT-PSS”(Polyscience,Inc.)等。
另外,可以使用具有各种特性(例如,水溶性)的导电聚合物。导电聚合物的官能团优选具有羟基或磺基。
(糖)
如图1例示,除了酶、交联剂和导电高分子之外,检测层6可以含有糖。所述糖是不充当酶底物的糖,而且该糖的构成糖的数量例如为1至6,并且优选为2至6。这些糖可以是D-形或L-形,或其混合物,并且可以单一使用或者适当组合使用其中两种或更多种。然而,对于诸如葡萄糖等糖被用作测量目标的情况来说,与作为测量目标的糖不同并且不充当酶底物的糖被用作所述糖。
二糖的示例包括:木二糖、琼脂二糖、角叉藻二糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐二糖、纤维二糖、海藻糖、新海藻糖、异海藻糖、菊粉二糖(inulobiose)、巢菜糖、异樱草糖(isoprimeverose)、山姆卜二糖(sambubiose)、樱草糖、茄双糖、蜜二糖、乳糖、番茄二糖、表纤维二糖(epicellobiose)、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、乳果糖、表位二糖(epigentibiose)、洋槐二糖、硅烷二糖(silanobiose)、芸香糖等。
三糖的示例包括:葡糖基海藻糖、纤维三糖、马铃薯三糖、龙胆三糖、异麦芽三糖、异潘糖(isopanose)、麦芽三糖、甘露三糖、松三糖、潘糖、车前糖、棉子糖、茄三糖、伞形糖等。
四糖的示例包括:麦芽糖基海藻糖、麦芽四糖、水苏糖等。五糖的示例包括:麦芽三糖海藻糖、麦芽五糖、毛蕊花糖等。六糖的示例包括麦芽六糖等。
(交联剂)
具体作为含醛基的化合物,交联剂类型的示例包括戊二醛、甲醛、丙二醛、对酞醛、异丁醛、戊醛、异戊醛、肉桂醛、烟碱醛、甘油醛、乙醇醛、丁二醛、己二醛、间酞醛、对酞醛等。作为含碳二亚胺基的化合物,示例包括:六亚甲基二异氰酸酯、氢化亚二甲苯基二异氰酸酯、亚二甲苯基二异氰酸酯、2,2,4-三甲基六亚甲基二异氰酸酯、1,12-二异氰酸酯十二烷、降冰片烷二异氰酸酯、2,4-双-(8-异氰酸酯辛基)-1,3-二辛基环丁烷、4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯、四甲基苯二亚甲基二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯等。
含碳二亚胺基的化合物还可在下列名称之下商业获得:CARBODILITE V-02、CARBODILITE V-02-L2、CARBODILITE V-04、CARBODILITE V-06、CARBODILITE E-02、CARBODILITE V-01、CARBODILITE V-03、CARBODILITE V-05、CARBODILITE V-07、CARBODILITE V-09(全部是产品名称,由Nisshinbo Chemical,Inc.制造)等。
作为含马来酰亚胺基的化合物,示例包括:间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯、间马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯、N-琥珀酰亚胺-2-马来酰亚胺基乙酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺丁酸、N-琥珀酰亚胺基-6-马来酰亚胺己酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸、N-磺基琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸、N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺甲基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-马来亚氨基苯基-4-丁酸、N-磺基琥珀酰亚胺基-4-马来亚氨基苯基-4-丁酸、N,N-'-氧二亚甲基-二马来酰亚胺、N,N'-邻亚苯基二马来酰亚胺、N,N'-间亚苯基二马来酰亚胺、N,N'-对亚苯基二马来酰亚胺、N,N'-六亚甲基二马来酰亚胺、N-琥珀酰亚胺马来酰亚胺羧酸酯等。示例还包括商业产品,如SANFEL BM-G(由SANSHIN CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.制造)等。
作为含噁唑啉基的化合物,示例包括噁唑啉化合物,如:2,2'-双-(2-噁唑啉)、2,2'-亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-乙烯-双(2-噁唑啉)、2,2'-三亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-四亚甲基双(2-噁唑啉)、2,2'-六亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-八亚甲基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-乙烯双-(4,4'-二甲基-2-噁唑啉)、2,2'-对-亚苯基-双-(2-噁唑啉)、2,2'-间亚苯基-双(2-噁唑啉)、2,2'-间亚苯基-双-(4,4'-二甲基-2-噁唑啉)、双-(2-噁唑啉基环己烷)硫醚、双-(2-噁唑啉基降冰片烷)硫醚等。
作为加成聚合性噁唑啉化合物,示例包括:2-乙烯基-2-噁唑啉、2-乙烯基-4-甲基-2-噁唑啉、2-乙烯基-5-甲基-2-噁唑啉、2-异丙烯基-2-噁唑啉、2-异丙基-4-甲基-2-噁唑啉、2-异丙烯基-5-乙基-2-噁唑啉等,并且可以使用其中一种或更多种的聚合或共聚化合物。
含噁唑啉基的化合物还可在下列名称之下商业获得:EPOCROS WS-500、EPOCROSWS-700、EPOCROS K-1010E、EPOCROS K-1020E、EPOCROS K-1030E、EPOCROS K-2010E、EPOCROS K-2020E、EPOCROS K-2030E、EPOCROS RPS-1005、EPOCROS RAS-1005(全部由NIPPON SHOKUBAI CO.,LTD.制造)、NK Linker FX(由Shin-Nakamura Chemical Co.,Ltd.制造)等。
作为含环氧基的化合物,示例具体包括:山梨糖醇聚缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚等,并且还可以组合使用这些化合物中的两种或更多种。含环氧基的化合物还可在下列名称之下商业获得:Denacol EX-611、Denacol EX-612、Denacol EX-614、Denacol EX-614B、DenacolEX-512、Denacol EX-521、Denacol EX-421、Denacol EX-313、Denacol EX-314、DenacolEX-321、Denacol EX-810、Denacol EX-811、Denacol EX-850、Denacol EX-851、DenacolEX-821、Denacol EX-830、Denacol EX-832、Denacol EX-841、Denacol EX-861、DenacolEX-911、Denacol EX-941、Denacol EX-920、Denacol EX-145以及Denacol EX-171(全部是产品名称,由Nagase ChemteX Corporation制造),SR-PG、SR-2EG、SR-8EG、SR-8EGS、SR-GLG、SR-DGE、SR-4GL、SR-4GLS以及SR-SEP(全部是产品名称,由Sakamoto Yakuhin KogyoCo.,Ltd.制造),Epolite 200E、EEpolite 400E以及Epolite 400P(全部由KYOEISHACHEMICAL Co.,LTD制造)等。
交联剂的类型不限于上述化合物和商业产品,而可以是包含醛基、马来酰亚胺基、碳二亚胺基、噁唑啉基和环氧基中的至少一种官能团的化合物。交联剂的形式没有限制,而是可以采用单体或聚合物的形式。
(导电颗粒)
检测层6还可以包含导电颗粒。对于导电颗粒来说,可以使用诸如金、铂、银或钯的金属颗粒;或者由碳材料制成的高级结构体。该高级结构体例如可以包含导电炭黑、碳纳米管(CNT)以及碳颗粒或碳微粒如富勒烯。导电炭黑的示例包括:Ketjenblack(由Degussa AG制造)、BLACK PEARL(Cabot Corporation)等。
要注意的是,检测层6的表面还可以用诸如醋酸纤维素等外层膜覆盖。其中,外层膜的原材料的示例包括但不限于聚氨酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯和聚醚醚酮等。
(用于制造生物传感器的方法)
上述生物传感器1按以下方式生产(制造)。具体地,充当电极3、4的金属层形成在绝缘基板2的一个表面2a上。例如,通过物理气相沉积(PVD,例如溅射)或化学气相沉积(CVD)沉积金属材料,以具有预定厚度(例如,大约100μm)的膜的形状在绝缘基板2的一个表面2a上形成膜。由此,形成具有期望厚度(例如,大约30nm)的金属层(电极3、4)。代替金属层,电极3、4可以另选地由例如丝网印刷碳材料而形成。
接着,在形成有电极3、4的一个表面2a上,使用抗蚀剂墨通过丝网印刷形成具有预定暴露图案(具有开口5a)的绝缘层5。
接着,检测层6形成在工作电极3b上。例如,制备至少含有酶、导电高分子和交联剂的溶液(试剂)。当糖添加到试剂中时,糖的浓度优选地是0.1wt%至2wt%,更优选0.2wt%至2wt%。将溶液(试剂)滴加到工作电极3b的表面上。当溶液(试剂)通过在工作电极3b上进行干燥被固化时,检测层6形成在工作电极3b上。由此,可以获得工作电极3b为开放系统的生物传感器1。
根据实施方式的生物传感器1的使用使得能够基于电荷传递限制电流测量样品(样本)中的待测量物质的浓度。这里提到的待测量物质没有具体限制,只要该物质可由使用生物传感器1的测量方法来测量即可,但优选地是生物来源的物质并且可以是疾病或健康状况的指示物。物质的示例包括葡萄糖和胆固醇等。样品没有具体限制,只要其含有待测量物质即可。优选生物样品。生物样品的示例包括血液和尿等。
(测量设备)
接着,描述使用根据实施方式的生物传感器1测量物质的浓度的测量设备。这里例示了使用作为生物传感器1的示例的葡萄糖传感器的葡萄糖测量设备。然而,测量设备不限于葡萄糖测量设备,并且测量设备的使用目的根据要由生物传感器1测量的物质而改变。
图2例示了测量设备B中容纳的主要电子部件的构造的示例。控制计算机18、恒电势计19和电源装置11设置在壳体中所容纳的基板20上。控制计算机18包括诸如CPU(中央处理单元)等处理器、诸如存储器(RAM(随机存取存储器)和ROM(只读存储器)等记录介质和通信单元,作为硬件。
当处理器将记录介质(例如,ROM)中存储的程序装载到RAM并且执行程序时,控制计算机18充当包括输出单元10、控制单元12、算术单元13和检测单元14的设备。控制计算机18可以还包括辅助存储器,诸如半导体存储器(EEPROM或闪存)或硬盘,用于存储程序和数据。
控制单元12控制用于施加电压的时机、和要施加的电压的值等。电源装置11包括电池16,并且向控制计算机18和恒电势计19供给电,以便运行。还可以将电源装置11设置在壳体外侧。
恒电位仪19是相对于参比电极来保持工作电极的电位恒定的装置,并且通过控制单元12控制。恒电位仪19利用端子CR、W,在葡萄糖传感器17的对电极与工作电极之间施加预定量的电压,测量可以在端子W处获取的工作电极的响应电流,并将该响应电流的测量结果发送给检测单元14。
算术单元13基于所检测电流的值来计算并存储要测量的物质的浓度。输出单元10执行与显示单元15的数据通信,并将要测量的物质的浓度的计算结果(其由算术单元13提供)发送给显示单元15。显示单元15例如能够按预定格式在显示屏上显示从测量装置B接收的葡萄糖浓度的计算结果。
图3是例示通过控制计算机18执行的葡萄糖浓度测量的处理顺序的实例的流程图。控制计算机18的CPU(控制单元12)接收用于开始测量葡萄糖浓度的指令。控制单元12控制恒电位仪19向工作电极施加预定量的电压,并且开始测量来自工作电极的响应电流(步骤S01)。应注意到,检测葡萄糖传感器17安装至测量装置B可以被用作开始浓度测量的指令。
接下来,恒电位仪19基于向该电极传递的从样本中要测量的物质(在此为葡萄糖)导出的电子,来测量通过施加电压而生成的响应电流,具体为电荷传递限制电流,并将该测量电流发送至检测单元14(步骤S02)。作为电荷传递限制电流,测量因电双层充电而产生瞬态电流之后(例如,在施加电压之后的1至20秒钟)的稳态电流。
算术单元13基于该电流值执行算术处理,并且计算葡萄糖浓度(步骤S03)。例如,用于计算葡萄糖浓度的公式或者葡萄糖浓度校准曲线的数据(其对应于包含在设置在工作电极上的检测层中的酶(例如,葡萄糖脱氢酶))被预先安装至控制计算机18中的算术单元13。该算术单元13利用这些计算公式或校准曲线来计算葡萄糖浓度。
输出单元10经由向显示单元15提供的通信链路将葡萄糖浓度的计算结果发送至显示单元15(步骤S04)。此后,控制单元12确定是否存在检测到的任何测量错误(步骤S05),如果没有错误,则完成该测量,并将该葡萄糖浓度显示在显示单元上。如果存在任何错误,则显示错误通知,并接着完成图3所示流程顺序。计算结果可以存储在存储介质中,并且从存储介质读出计算结果,以显示和确认。要注意的是,在图3的示例中在计算结果发送到显示单元15(步骤S04)之后,进行由控制单元12进行的测量误差的检测(步骤S05),但也可以以切换顺序进行这些步骤。
【示例】
下文中,描述酶电极的示例。
<测试1>
生产具有间隔体厚度不同的毛细管的多个生物传感器并且测量葡萄糖。
(生物传感器的生产)
工作电极和对电极使用碳墨水通过丝网印刷形成在绝缘基板的一个表面上,并且参比电极使用Ag/AgCl通过丝网印刷而形成,从而形成由三个电极组成的电极系统。将用以下配方制备的试剂溶液滴加到工作电极上并且通过干燥而固化,形成检测层。此外,使用间隔体和盖子在其上形成有电极系统的绝缘基板上形成毛细管,以获得间隔体厚度分别为150μm、300μm和450μm的生物传感器。
【试剂的配方】
·磷酸盐缓冲剂溶液:(pH 5.8):10mM
·蔗糖:0.5%
·酶(Cy-GDH:γαβ):4.5mg/mL
·导电高分子:磺化后的聚苯胺水溶液(商标名:aquaPASS-01x,由MitsubihiRayon有限公司制造):0.4%
·含有噁唑啉基的聚合物EPOCROS WS-700(NIPPON SHOKUBAI有限公司):6.0%
·Lion糊W-311N(由狮王公司(LionCorporation)制造):2.42%
要注意的是“%”表示试剂溶液中含有的试剂的wt%浓度。
(样品)
制备样品中的葡萄糖浓度分别是0、100mg/dL、200mg/dL、400mg/dL和800mg/dL的20mM HEPES溶液(pH 7.0),作为样本(样品)。在23±1℃在大气中,通过各生物传感器由计时安培分析法(+60mV vs.Ag/AgCl)来测量葡萄糖浓度。
图4描绘了测试1的结果,使用计时安培分析法基于葡萄糖浓度的测量结果的校准曲线。根据图4的结果,以不依赖间隔体厚度的方式获得具有类似斜率的校准曲线。这意味着贴附到电极上的样品的量不影响响应电流值。
<测试2>
接着,生产具有毛细管的生物传感器和没有毛细管的生物传感器,其均具有含电子传递介质的检测层,并且通过计时安培分析法进行测量。
(试剂的配方)
·酶(FAD-GDH):1U
·介质(Ru络化物、1-甲氧基-PMS):200mM
·ACES缓冲剂溶液:(pH 7.5):0.17mM
·蒙脱石(Lucentite SWN):0.2%
(样品)
制备样品中葡萄糖浓度分别是100mg/dL、321mg/dL和624mg/dL的全血,作为样本(样品)。在24±1℃在大气中,通过计时安培分析法(+200mV vs.Ag/AgCl)使用各生物传感器测量葡萄糖响应电流。
图5描绘了测试2的结果,具体地描绘了基于经由计时安培分析法获得的葡萄糖浓度的测量结果的校准曲线。如图5显示的,与具有毛细管的情况相比,没有毛细管的情况具有更高的响应电流值,由此响应电流值被验证已受不存在毛细管的影响。
<测试3>
(实施例1)
接着,按以下方式制备根据实施例1的生物传感器。绝缘基板2的一个表面2a上,形成两个电极,这两个电极由使用碳墨水通过丝网印刷形成的工作电极3b和使用银/氯化银墨水(Ercon公司)通过丝网印刷形成的对电极4b组成。在电极上未设置毛细管,以使工作电极3b和对电极4b为开放系统。
将用以下配方制备的试剂墨水滴加到工作电极3b上并且通过干燥被固化,以形成检测层6。
【配方】
·磷酸盐缓冲剂溶液:(pH 5.8):10mM
·蔗糖:0.5%
·GDH:7mg/mL
·导电高分子:磺化聚苯胺水溶液(商标名:aquaPASS-01x,由Mitsubishi Rayon有限公司制造):0.40%
·含有噁唑啉基的聚合物EPOCROS WS-700(NIPPON SHOKUBAI有限公司):5.0%
·Ketjenblack:0.8%
要注意的是“%”表示试剂溶液中含有的试剂的wt%浓度。
葡萄糖浓度为0(空白:B)和336mg/DL(样品:S)的全血用作样本(样品)。各个样品分配(散布)在各个生物传感器的电极上,并且在25℃在大气下经由计时安培分析法测量葡萄糖浓度。通过制备多个具有不同散布样品量(1μL、2μL和4μL)的上述生物传感器进行浓度测量。
图6是描绘了基于使用实施例1的生物传感器进行的葡萄糖浓度的测量结果的S/B(样品/空白)的曲线图。如图6显示的,在所有1μL、2μL和4μL中,S/B比均具有大约20的S/B比水平,因此未暗示对样本量没有依赖性。
<测试4>
(比较例1)
制备具有毛细管的实施例1的生物传感器,作为比较例1。生产毛细管高度分别为10μm、30μm、50μm、100μm、200μm的生物传感器。检测层6的配方与实施例1相同。使用0和300mg/dL的水溶液作为样本(样品),电极被浸渍在样品中,以允许样本接触电极。
在25℃在大气中,使用循环伏安法(CV法)和计时安培分析法(CA法)检查比较例1的生物传感器的电极响应特性。图7描绘了基于使用比较例1的生物传感器进行的CV法和CA法的测量结果的S/B比。如图7显示的,验证了S/B比不取决于毛细管的高度。.
根据测试1至测试4,验证了响应电流值不取决于样本量或毛细管的高度。由此,根据至少工作电极为开放系统的生物传感器1,可以实现高精确的浓度测量,而无需通过毛细管调节或控制样本量。因此,不存在毛细管可以降低生物传感器的制造成本,这是因为部件数量减少。进一步地,由于不取决于样本量,可以消除由生物传感器1的用户操作生物传感器1的方式造成的测量结果差异。具体地,生物传感器可以容易地由用户操作。要注意的是,根据实施方式的生物传感器不需要用毛细管覆盖电极(开放系统),因为这一点,可以应用这样的构造:刺络针与生物传感器一同设置,以使得样本能够在穿刺的同时散布在电极上。
【第二实施方式】
下文中,描述第二实施方式。第二实施方式具有与第一实施方式相同的构造,因此主要描述不同的方面,而省略共同方面的描述。
第一实施方式中描述的电荷传递限制电流由以下公式(1)表示。公式(1)显示电流与底物的浓度和酶反应速率常数成比例。当常数项被定义为X时,公式(1)可以展开成公式(2)。要注意的是,常数项X可以包括校正系数等(尽管未出现在公式(1)和(2)中)。
【公式(1)】
i:电流(A)
n:反应电子数(eq/mol)
F:法拉第常数(96,485C/eq)
A:电极面积(cm2)
C0 s:底物(S)的浓度(mol/cm3)
τE:氧含量(mol)
Kcat/Km:氧反应速度常数
【公式(2)】
考虑到酶反应的初始速率公式和从酶至电极的电子传递速率的公式,在这些公式的值相等时,通过扩展这些公式,来导出公式(1)。根据该实施方式的生物传感器,例如,利用上述公式(1)和(2),来测量要测量的物质(底物)的浓度。
该公式(1)是电荷传递限制电流的公式,其不包括在酶反应的初始速率公式的Cottrell电流中所包括的扩散系数。如公式(1)所揭示的,该电流与酶反应速率常数成比例。在根据第一实施方式的要测量的物质的测量方法中,电子被传递至电极,而不通过诸如电子受体物质等介质由氧化还原反应介导。因此,揭示了该电荷传递限制电流不受该物质的扩散影响或者不取决于时间。
应注意到,该电极系统可以通过利用循环伏安法来检查存不存在因电压的扫描方向而造成电流增加的峰值和模式,而确认为电荷传递限制。
根据第二实施方式的生物传感器也包括“直接电子传递型酶电极”,用于测量电荷传递限制电流。并且,根据第二实施方式的生物传感器中,检测层(其中,与工作电极的接触面积由预定面积限定)形成在工作电极上。具体地,检测层与工作电极的接触面积由预定面积来限定。检测层与工作电极的接触面积可以通过将检测层材料涂敷(涂抹)至多个电极当中的工作电极(但不是简单地滴落液体检测层材料)来限定。利用该过程,可以限定公式(1)中的“A:电极表面积”和“n:反应电子数”。由此,降低了各生物传感器之间的响应电流的不一致性,并且可以改进同时再现性。
为了限定检测层与工作电极的接触面积,在形成有该电极的绝缘基板上形成绝缘层可以被呈现为实例。该绝缘层被形成为使得工作电极在其底表面暴露,并且具有填充了绝缘层材料的开孔。该开孔具有连接内壁表面,以在该开孔内调节用以填充该开孔的检测层材料的扩散范围。当用以填充该开孔的检测层材料通过干燥固化时,形成填充该开孔(埋藏该开孔)的检测层。开孔的底部面积具有限定为匹配检测层与工作电极的接触面积的尺寸,并且该开孔按至少充分埋藏开孔的底部的量填充了检测层材料。通过该过程,可以容易地在该工作电极上形成与工作电极的接触面积限定为预定面积(以预定面积接触该工作电极)的检测层。可以,例如通过利用不导电墨水(还称作抗蚀剂墨水)进行丝网印刷来形成绝缘层。除了丝网印刷以外,还可以通过利用各种抗蚀剂(如光致抗蚀剂)和绝缘带等的工序来形成绝缘层,只要可以形成能够限定工作电极与检测层的接触面积的开孔即可。
作为另一用法,可以对应于酶的反应速率来确定检测层与工作电极的接触面积。酶的反应速率可以随着不同的特定活性而按批次(by lots)改变。为此,预先通过实验等来确定对应于酶的反应速率的检测层与工作电极的面积,并且在与按每批酶的反应速率相对应的接触面积上形成检测层。利用该过程,可以降低按批次的同时再现性的不一致性。
图8是例示了根据第二实施方式的生物传感器1A的构造的示例的图。生物传感器1A在以下方面具有与第一实施方式的生物传感器1(图1)不同的构造。
代替开口5a(图1),绝缘层5具有开口5b和开口5c。形成开口5b,从而使得对电极4b和其周围的绝缘基板2的上表面暴露。
另一方面,开口5c形成在工作电极3b上,并且工作电极3b除了开口5c处暴露的部分之外用绝缘层5覆盖。开口5c具有预定底面积和所连接的内壁面。在图8例示的示例中,开口5c具有圆形平面形状和具有圆筒状侧面形的连接内壁面。
开口5c的尺寸(底面积)形成在工作电极3b上,以便匹配接触工作电极3b的检测层6的接触面积。当开口5c充分填充有检测层材料时,形成检测层6。在图8的示例中,检测层6是圆筒状,以填埋开口5c。
如上所述,当检测层6使用具有限定底面积的开口5c形成时,就限定了工作电极3b与检测层6的接触面积。检测层6的部件如第一实施方式中所描述。
要注意的是,在图8的示例中,开口5c的平面形状是圆形,并且内壁面是圆筒状侧面。然而,开口5c可以形成为内壁面是截头锥侧面的锥形。开口5c的平面形状和内壁面的形状可以酌情确定,只要能够形成所连接内壁面即可,其调节填充开口的检测层材料的扩散范围。例如,开口5c的平面形状可以是椭圆形、三角形、四边形或由五条边或更多条边组成的多边形。另外,开口5c的内壁面的形状可以是对应于平面形状的柱侧面,或不对应于平面形状的柱侧面。具体地,开口5c的形状可以酌情确定,只要检测层6与工作电极3b的接触面积可以被限定为预定面积即可。
根据如上所述的第二实施方式的生物传感器,为开放系统(没有毛细管)的工作电极使样品的散布更容易。并且,检测层6以预定面积接触工作电极3b,具体地,限定检测层6与工作电极3b的接触面积。这样,可以改善CV值(同时再现性)。具体地,减小生物传感器之间的误差并且可以稳定精度。
Claims (2)
1.一种生物传感器,该生物传感器包括:
多个电极,所述多个电极包括工作电极;和
检测层,该检测层固定在所述工作电极上,并且含有交联剂、导电高分子以及向所述工作电极传递电子和从所述工作电极接收电子的酶,
其中,所述工作电极为开放系统。
2.根据权利要求1所述的生物传感器,其中,所述检测层与所述工作电极的接触面积由预定面积来限定。
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