JP2901678B2 - 電流測定による診断分析の方法及び装置 - Google Patents

電流測定による診断分析の方法及び装置

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1988年３月15日付出願の米国特許第168295
号の一部継続出願である。
［発明の分野］ 本発明は、使い捨てできる電気分析セルに関し、生物
学的に重要な化合物（compounds）、例えば、グルコー
ス、TSH、T4、HCGの如きホルモン、ジゴキシンの如き強
心性配糖体、リドカインの如き不整脈抗剤（antiarrhyt
hmics）、フェノバルビタールの如き癲癇抗剤（antiepi
leptics）、ゲンタミシンの如き抗生物質、コレステロ
ール、非治療性薬剤（non-therapeutic drugs）等のよ
うに、体液から化合物の存在を、定量的に決定するため
の方法及び装置に関する。
本発明は広い範囲において適用可能であるが、本発明
の説明では、生物学的に重要なグルコースとコレステロ
ールの２つの化合物を例示して、これら化合物の存在を
定量的に決定する場合について説明する。
［グルコースの場合］ 糖尿病、特に真性糖尿病は、膵臓で作られるインシュ
リンの欠乏を特徴とする代謝疾患であり、血液グルコー
ス値が異常になる。この糖尿病患者は、米国の人口の約
４％にすぎないが、その死亡原因は、心臓病、癌に続き
第３位を占めている。インシュリンを毎日注入し、食餌
を厳密にコントロールして、患者の血糖を適当な値に維
持すれば、糖尿病の予後（prognosis）は極めて良好に
なる。しかしながら、患者の血液グルコース値は、臨床
機関が分析するか、或は、患者が比較的簡単な非技術的
方法を用いて毎日分析するかして、綿密にフォローして
いく必要がある。
現在、血液グルコースをモニターする場合、小さなプ
ラスチック片に試薬を含んだ乾燥パッドを載せ、酵素反
応によって生じるカラー変化を、視覚又は器具を用いて
観察することにより行なっている。これらの比色法（co
lorimetric method）は、グルコースをグリコン酸に変
える天然酸化剤、具体的には酸素に対する関係を利用す
るもので、反応式は次の通りである。
B-D-グルコース+O2+H2O-→D-グルコン酸+H2O2 H2O2＋試薬−→H2O＋色 ［コレステロールの場合］ コレステロールの判定技術も、同様な方法に基づいて
行なわれる。コレステロールの場合、現在使用されてい
る方法は、次の一般反応式に基づいて行なわれる。
コレステロール+H2O+O2-→コレステノン+H2O2 H2O2＋試薬−→H2O＋色 現在のあらゆる技術において、自由コレステロール及
び全コレステロールの両コレステロールを定量する場
合、酵素コレステロールオキシダーゼと使用される直接
の酸化剤（oxidant）としては、ジオキシゲンが唯一の
ものである。従来の試験方法を用いた場合、未希釈の血
清及び全血液試料中の検体（analyte）を完全に反応さ
せるためには、使用中、センサー溶液の中に周囲の空気
から酸素を拡散して十分な試薬（reagent）を供給しな
ければならない。
両方の場合とも、色を標準色と比較するか、又は過酸
化水素を定量することにより、物質の存在を決定するの
である。本発明の検出方法は、分光器又は電気化学的手
段により、生成した過酸化水素を直接測定する方法と、
ペルオキシダーゼ酵素の存在下で過酸化水素を種々の染
料（dyes）と反応させて着色し、その色をモニターする
間接的な方法を含むものである。
これらの試験方法は、比較的簡単に使用できるが、結
果を再現するためには、使用者は熟練した技術を備えて
いなければならない。例えば、これらの試験を行なうに
は、試薬を含んだパッドから血液を所定の時間間隔で除
去しなければならない。色測定は試薬パッドの上表面で
行なうため、所定時間を経過した後、過剰の血液を、洗
浄及び吸取り（blotting）により、又は吸取りだけによ
り取り除く必要がある。色の検査は、反応直後に行なう
か、或は所定時間の経過後に行なう。
これらは、熟練した技術を必要とし、タイミングに十
分な注意を払って行なう必要がある。また、たとえ熟練
した技術を用いても、例えばグルコースを比色法で定量
する場合、特に血糖値の低い範囲では精度に劣る問題が
ある。さらに、比色分析に使用される器具によって、較
正方法が多様である。使用者の較正を必要としないもの
もあるし、第２標準を必要とするものもある。
体液中の生物学的に重要な化合物を調べるのに現在使
用されている方法及び装置は、一般的には、精度が低
く、また標準化しにくいという不都合がある。このた
め、医師は、そのような装置を用いて、値（level）又
は適量（dosage）をモニターするのに消極的である。ま
た、患者自身にこの方法を実施させることについては、
特に消極的である。このため、医師だけでなく、患者自
らがこれら化合物をよりすぐれた精度で検査できる方法
及び装置の出現が要請される。
本発明は、上記の要請に鑑み、全血、血清、その他の
体液内の化合物をモニターできるようにした、酵素の電
流滴定（enzymatic amperometry）方法及び装置を提供
することを目的とする。酵素の電流滴定方法は、使用者
の熟練を必要としないだけでなく、より直線的なダイナ
ミックレンジ（dynamic range）を得ることができる。
この方法であれば、医師は自分の患者に対して、自ら検
査を実施するように奨めることもできる。
酵素の電流滴定方法は、これまで、グルコース、血液
の尿素の窒素、乳酸塩等の多くの検体を、実験室ベース
で測定するのに用いられてきた。この方法では、これま
で、嵩ばった金属ワイヤ、円筒体、円板を絶縁材料に埋
め込んだ電極が使用されてきた。しかし、各々の電極が
個々の特性を有するから、製造工程において、各センサ
ーに対する較正を必要とする。また、これらの電極は、
コストが高すぎるため、使い捨てにするわけにはいか
ず、電極の信頼性を維持するために細心の注意を払う必
要がある。しかし、熟練していない素人の場合、このよ
うな維持管理を適切に行なうことはできない。このた
め、素人である患者自身が酵素の電流滴定方法を実施で
きるようにするには、センサーからセンサーへと出力を
再生できるように使い捨てのセンサーを使用することが
前提である。従って、コストについても、従来の電極よ
りもはるかに低いコストで製造できるようにせねばなら
ない。
本発明は、ミクロの部分標本（micro-aliquote）のサ
ンプリングを精度良く行なうために、小型化して使い捨
て可能にした試料セルを提供すること、試料の電気化学
的還元を自動的に測定するための手段を内蔵した装置を
提供すること、及び前記セル及び装置を用いるための方
法を提供することを目的とする。
本発明にかかる使い捨てセルは、金属化（metallize
d）プラスチックと非導電性材料の層構造にすることが
望ましい。金属化した層は、作用電極（working electr
ode）と標準電極（reference electrode）を備え、その
面積は積層工程により規定され、再現可能である。この
層を貫通する開口を設け、試料の正確な測定を行なうた
めに、試料を含む領域すなわちセルを配備できるように
している。本発明の装置は、セルを挿入すれば、自動的
に測定サイクルが開始するようにしている。
測定工程をより良く理解するために、本発明の望まし
い実施例では、２段階の反応シーケンスを示している。
ここで、２段階とは、酸素以外の酸化剤を用いる化学的
酸化の第１段階と、第１段階での反応生産物を定量（qu
antify）するのに適当な電気化学的還元段階のことであ
る。ジオキシゲン以外の酸化剤を用いて検体を直接定量
した場合、非常に過剰の検体中のセンサーの中に予め配
置することができるから、酸化剤が、最終的決定を左右
する試薬（limiting reagent）にならないという利点が
あるジオキシゲンの場合、検体を定量変換するためのセ
ンサー溶液中に当初から存在する酸化剤は、通常、不十
分である。） 酸化反応においては、例えば、試料に含有されるグル
コースは、グルコン酸と、酸化剤の還元生成物に変換さ
れる。酵素、グルコースオキシダーゼの存在下では、こ
の化学的酸化反応が先行することがわかった。これは、
特に、基質がＢ−Ｄ−グルコースである場合に特異であ
り、１個の電子受容体（electron acceptor）及び２個
の電子受容体で酸化反応の触媒作用が行なわれる。しか
し、この酸化反応は、グルコン酸が形成されてからは進
行しないから、この反応はグルコースの電気化学的測定
に特に適している。
本発明の望ましい実施例において、１個の電子受容体
での酸化は、フェリシアン化物、フェリシニウム（ferr
icinium）、コバルト（III）オルトフェナントロレン、
及びコバルト（III）ジピリジルを用いるのが望まし
い。ベンゾキノーンは２個の電子受容体であり、電流滴
定定量を行なうためにすばらしい電子酸化特性をもたら
す。
例えば、本発明にかかるグルコースの電流滴定は、コ
ットレル電流（Cottrell current）のマイクロークロノ
アンペロメトリーを利用しており、グルコースと、酸化
された電子受容体が、グルコン酸と還元受容体を生成す
る。この方法は、副基質副産物（bi-substrate bi-prod
uct）の酵素機構による触媒作用により、化学酸化反応
が先行する。これについては、本明細書を通じて明らか
なものとなるであろう。
この定量方法の場合、電位を加えた後、正確に設定し
た時間（例えば、20、30又は50秒）に拡散コントローラ
電流を測定し、電流滴定の次の等式を適用して電位をコ
ントロール（Ｅ＝定数）しながら行なう。
ここで、ｉは電流、nFはモル当たりのクローン数、Ｄ
は試薬の還元された形態の拡散係数、ｔは電流測定を行
なうために予め設定された時間、Ｃは代謝産物（metabo
lite）の濃度である。本発明の方法に基づいて、受容体
の再酸化による電流を測定した場合、その測定結果は試
料のグルコース濃度に比例することがわかった。
本発明の方法及び装置の望ましい実施例では、血液グ
ルコース、コレステロール等を直接測定した。さらに、
本発明の試料セルは、予め測定を実施することなく、血
液量をコントロールしながら分析試験を行なうことがで
きる。試料セルを装置内に挿入すれば、自動的に機能し
て反応のタイミングを決定するため、患者自らが試験を
行なっても、非常に高い精密さ及び精度が得られる。
本発明の望ましい実施例の一例として、Ｂ−Ｄ−グル
コースを測定する場合を例示し、これについて詳細に説
明する。特に、本発明の実施例にかかる方法及び装置
は、糖尿病患者が自ら血液グルコースをモニターできる
ようにしたものである。本発明を試料セルを用いること
により、試料の量及び反応媒体（reaction media）を管
理するとともに、試料セルを電気化学センサーとして作
用させるものである。この実施例では、電子受容体とし
て、ベンゾキノーンを用いている。
本発明にかかる方法は、次の基本的な化学二元反応式
を用いている。
Ｂ−Ｄ−グルコース＋ベンゾキノーン＋H2O −→グルコン酸＋ヒドロキノーン ヒドロキノーン−→ベンゾキノーン＋2e-＋2H+ 第１の反応は酸化反応であり、酵素グルコースオキシ
ダーゼの存在下で反応が進行する。電気化学酸化は反応
の第２パートで生じ、酸化反応で作られたヒドロキノー
ンの量を定量するための手段となる。これは、触媒酸化
が、例えばフェリシアン化物（酸化還元のカップルはFe
(CN)6 -3/Fe(CN)6 -4となる）、フェリシニウム（ferrici
nium）、コバルト（III）三オルトフェナントロレン、
及びコバルト（III）三ジピリジルのように、２個の電
子受容体で行なわれる場合でも、或は１個の電子受容体
で行なわれる場合でも同じである。
グルコースオキシダーゼによる触媒酸化は、Ｂ−Ｄ−
グルコースに対して特に有効であるが、酸化剤に関して
は選択性がない。前述した望ましい酸化剤は、殆んど全
てのＢ−Ｄ−グルコースをグルコン酸に変換するのに十
分な正電位を有していることがわかった。さらに、この
装置では、デシリットル当たりの試料につき測定できる
グルコースの量は、1mg（望ましい実施例）から1000mg
まで可能である。これは、グルコースを用いたその他の
自己テスト装置ではこれまで得られたことはなかった。
本発明に基づいて、所望の定量を行なうための化学剤
を含んだセンサーを作ることができる。これを自己テス
ト装置の携帯用メータと共に使用することができる。使
用に際しては、センサーをメータの中に挿入するとメー
タはオン状態となり、試料を受け入れられる状態とな
る。試料を入れると、電荷電流が突然流れるため、メー
タは試料が入れられたことを感知する。これは、電極
と、その上の試薬の層が、当初は試料液によりウェット
の状態にあるからである。試料が入れられたことが感知
されると、反応の培養（incubation）が開始し（その長
さは化学剤により異なる）、酵素反応が終了する。この
間の時間は、グルコースの場合、15〜90秒のオーダが望
ましく、培養時間は20〜45秒が望ましい。培養時間の経
過後、器具を用いて既知の電位を電極に負荷し、コット
レル電流が減衰する間、所定時間における電流を測定す
る。電流測定は、電位を負荷した後、２〜30秒の範囲内
で行ない、測定時間は10〜20秒が望ましい。次に、これ
らの電流値を用いて検体の濃度を計算し、これをディス
プレイに表示する。次にメータは待機状態となり、使用
者がセンサーを取り出すか、又は一定時間を経過した
後、オフ状態となる。
本発明は、使用者によって測定値に差が生じることを
防止し、精度及び信頼性に悪影響を及ぼすことはなく、
他の自己テスト装置よりもダイナミックレンジがはるか
に大きい測定装置を提供するものである。
本発明のこれらの目的及びその他の目的については、
グルコース測定の一実施例、及びコレステロール測定の
他の実施例に関して、添付の図面を参照しながら説明す
る以下の詳細な記載によって明らかなものとなるであろ
う。
図面において、類似の要素については、類似した引用
符号を付している。
第１図は本発明にかかる携帯式試験装置の分解図であ
る。
第２図は本発明の試料セルの平面図である。
第３図は第２図に示す試料セルの分解図である。
第４図は本発明にかかる試料セルの他の実施例の分解
図である。
第５図は第４図に示す試料セルの平面図である。
第６図は試料セルのさらに別の実施例である。
第７図は電流をグルコース濃度の関数として示したグ
ラフである。
第８図はコットレル電流をグルコース濃度の関数とし
て示したグラフである。
第９図は第１図に示す装置に使用される電気回路の望
ましい実施例を示したブロック図である。
第10図は電気化学セルの望ましい実施例を示す図であ
る。
第１図を参照すると、患者が血液グルコース値等を自
ら調べることのできるようにした携帯式の電気化学的試
験装置（10）を示している。装置（10）は、前部ハウジ
ング（11）と後部ハウジング（12）を備えており、前部
ハウジングには前部パネル（13）、後部ハウジングには
回路基板（15）が夫々配備される。前部パネル（13）に
は、グラフィックディスプレイパネル（16）が設けら
れ、該パネルに、情報を表示し、患者に指令を与え、試
験結果が直接読み出される。分析を開始させるためのス
タートボタン（18）を設けているが、試料セル（20）が
装置の窓部（19）に挿入された時に分析動作を開始させ
るようにすることが望ましい。
第３図を参照すると、試料セル（20）は、金属化した
プラスチック基板を備え、該基板に所定サイズの開口
（21）が形成される。この開口は、セルを組み立てたと
き、一定量の試料入れ（21）を構成し、この試料入れに
試薬パッド及び分析用血液が入れられる。セル（20）
は、第１基板（22）と第２基板（23）を備えており、こ
の基板は、スチレン等の実質的に非導電性プラスチック
から作ることが望ましい。第２基板（23）の上に標準電
極（24）を配置する。標準電極（24）は、ポリイミドカ
プトン（polyimide Kapton）の如き材料からなる基板
に、真空メッキして作ることが望ましい。望ましい実施
例では、標準電極（24）は、銀−塩化銀電極である。こ
の電極は、基板を用いてセルを作る前に、化学的手段又
は電気化学手段の何れかの手段により銀層に塩化銀をメ
ッキすることができる。なお、試薬層がフェリシアン化
物等の酸化剤、及び塩化物を含んでいるとき、下記反応
に示されるように、塩化銀層は銀電極の上にその場で
（in-situ）作ることもできる。
Ag＋Ox−−→ag+＋Red Ag+＋Cl-−−→AgCl 銀−塩化銀電極は、或はまた、酸化銀の層を（反応性
スパッタリングにより）、銀フィルム上にメッキするこ
とにより作ることもできる。この酸化銀の層は、下記反
応式により、試験時にその場で塩化銀に変換される。
Ag2O＋H2O＋2Cl-−−→2AgCl＋2(OH)- センサーが試料液によってウエット状態であるとき、
試薬層を含む塩化物が再び形成される。銀電極は、塩化
銀を含む層を有している。
標準電極は、一般に「擬似（pseudo）」標準電極とし
て知られているものを用いることができる。これは酸化
源（oxidizing species）を過剰に多く有しており、貴
金属電極において所定電位を得ることができる。望まし
い実施例では、同じ貴金属からなる２つの電極を用いて
いるが、一方の表面積を大きくして標準電極として用い
ている。酸化源が多いほど、また表面積が大きいほど、
標準電極の電位は変動しにくくなる。
インジケータ又は作用電極（26）は、プラチナ、金、
パラジウム又は金属化プラスチックの小片を、標準電極
（24）の上に配置したものでもよいし、或はまた、作用
電極（26）と標準電極を、電極（26）を共面電極（24）
材料の間に挟んだ共面ユニットにすることもできる。試
料セル（20）は、基板の間に電極を挟んだ複合ユニット
を形成することが望ましい。
第２図に示すように、第１基板（22）の長さは少し短
くして、電極（24）（26）の端部（27）を露出し、装置
内に配備された試験回路と電気的に接触できるようにし
ている。この実施例では、試料を試料入れ（21）の中に
入れた後、セル（20）を前部パネルの窓部（19）の中に
押し込むことにより、分析（testing）が開始される。
この実施例では、試薬を試料入れ（21）の中に入れる
が、望ましくは乾燥試薬のパッドをいれ、（１滴の）血
液試料を、試薬の入った試料入れ（21）の中に入れるこ
とが好ましい。
試料セル（20）の他の実施例を第４図ないし第６図に
示している。第４図において、試料セル（120）は、第
１の基板（122）と第２の基板（123）を有している。標
準電極（124）と作用電極（126）は、基板（122）と（1
23）の間に挟まれている。分析用試料を入れるための開
口（121）が設けられる。端部（130）は、装置の中に挿
入できるような構造とし、セルの切取り部（131）（13
2）を通じて、各電極と電気的に接続される。標準電極
（124）には、さらに切取り部（133）を形成し、作用電
極（126）と電気的に接続している。
第６図は、作用電極（226）を折り畳んだ形態を示し
ており、開口（221）の周囲の表面積を大きくすること
により、感度（sensitivity）又は特異性（specificit
y）を高めている。この場合、標準電極（224）は、作用
電極（226）の下方に配置される。作用電極には、切取
り部（234）を形成して、基板（222）の切取り部（23
2）を通じて、標準電極（224）と電気的に接触させてい
る。基板（222）の端部（230）には、切取り部（232）
を形成し、作用電極（226）と電気的に接触させてい
る。
本発明にかかる試料セルを窓部（19）から挿入するこ
とにより、分析が開始する。試料セルが挿入されると、
試料セルの端部（27）において電極（24）（26）間に電
位が加えられ、試料の存在が感知される。試料の存在が
感知されると、電位が取り除かれ、培養が開始される。
培養中、必要に応じて、バイブレータ手段（31）を作動
させ、試薬を攪拌することにより、溶解力（dissolutio
n）を高めることもできる。なお、グルコースを定量す
る場合、培養時間は20〜45秒が望ましく、通常の場合、
バイブレータ手段は不要である。次に、試料セルの端部
（27）から電極（24）（26）に電位を加え、試料を流れ
る電流を測定し、ディスプレイ（16）に表示する。
上記装置の利点を十分に発揮するために、自己テスト
に必要な化学剤を乾燥試薬層に含ませ、その試薬層を使
い捨てセルの中に配置して、所望通りの検体用センサー
を形成する。使い捨て式の電気化学セルは、金属化プラ
スチックと非導電性物質の層状体であって、作用電極面
積は精密に規定されている。試薬層は、セルの上に直接
コーティングしてもよいが、フィルター紙、薄膜フィル
ター、織りファブリック又は非織ファブリック等の支持
マトリックスにコーティングし、それをセルの中に入れ
ることが望ましい。支持マトリックスを用いるとき、所
望の精密さ及び機械的支持強度に合わせて、細孔のサイ
ズや空隙容積を調節することができる。一般的に言っ
て、試薬層の支持体の材料としては、薄膜フィルター又
は非織ファブリックが最も望ましい。細孔のサイズは0.
45〜50μｍ、空隙容積は50〜90％が適当である。コーテ
ィングは、ゼラチン（gelatin）、カラギーナン（carra
geenan）、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等の結合剤（binder）により形成
することができろ。コーティングは、試薬の溶解を遅延
させる作用があり、その間に試薬層が試料から液の大部
分を吸収することができる。結合剤の濃度は、一般的に
は0.1〜10％のオーダであり、１〜４％が望ましい。
試薬層が層の表面に施されると、試薬層は一定量の試
料液を吸収するから、試料の量を予め測定する手間を省
くことができる。さらに、反射光ではなく、電流を測定
するから、反射分光光度法のように、測定前に試薬層の
表面から血液を除去する必要はない。試料液は直接試薬
層に施すことができるが、試薬層の全表面に血液を拡げ
ることができるために、センサーは分散広がり層又はウ
イッキング層を設けるのが望ましい。この層は、一般的
には、非織ファブリック又は吸取り紙を用いて、試薬層
の上に設けられ、血液を試薬層の上に急速に拡散させる
作用を有する。用途によっては、この分散層に、更に試
薬を含めることもできる。
グルコースを定量する場合、セルは共面構造のものを
使用し、試薬層は次の組成である。
グルコースオキシダーゼ 600u/ml. フェリシアン化カリウム 0.4M 燐酸緩衝液 0.1M 塩化カリウム 0.5M ゼラチン 2.0g/dl これは、薄膜フィルターを上記組成の溶液でコーティ
ングし、空気乾燥して作った。試薬層は、次にセルの窓
部の開口面積に合わせて小片に切り取る。その小片を窓
部の内部に露出した電極の上に載置する。非織レーヨン
ファブリックのウイッキング層をこの試薬層の上に載
せ、テープにて適当な位置に保持する。
本発明にかかる技術の適用法を明らかにするために、
多数の実施例について、25℃の水溶液中にて調べた。電
解質をpH6.8の燐酸緩衝液から作った。緩衝液は、約0.1
モルの全燐酸塩と、0.5Mの塩化カリウムの試薬を含んで
いる。電位は標準水素電極（NHE）を基準としている。
これらの試験において、酸化剤としてベンゾキノーンを
用いたとき、約＋0.8ボルトと1.2ボルト（NHEに対し
て）の間の電位であればヒドロキノーンの定量に適して
いることがわかった。ヒドロキノーンの濃度が0.0001M
〜0.050Mの範囲内である場合には、限界電流は、該濃度
に比例する。
グルコースを、本発明にかかるコットレル電流（it）
のマイクロクロノアンペロメトリーで定量する工程は、
ヒドロキノーンが反応してベンゾキノーンとなる際に行
なわれる。コットレル電流は時間と共に次の式に基づい
て減衰（decay）する。
it・t1/2＝一定 これら２つの技術間における主な相違点は、グルコー
ス−ベンゾキノーン反応が完了した後に、適当にコント
ロールされた電位を加えること、及びグルコース濃度
と、一定時間経過後に測定したコットレル電流とを関連
づけることにある。電流−時間の読出し結果を第８図に
示している。第７図は、グルコース濃度とコットレル電
流（電位を加えた後、ｔ＝30秒で記録した）との間に比
例関係のあることを示している。
代謝産物のコットレル電流滴定法は、酵素触媒と、コ
ントロールされた電位の電気分解との二重の保護手段
（dual safeguards）を必要とすることに留意すべきで
ある。99.5＋％のグルコン酸は、グルコースオキシダー
ゼの存在下にて得られた。これに伴って、等量のベンゾ
キノーンがヒドロキノーンに還元される。これは、静止
した溶液中にて、定置パラジウム薄膜アノード又は試料
セルで定量できる。
これらの数多くの試験結果から、本発明のマイクロク
ロノアンペロメトリーによる方法論は、糖尿病に罹患し
たとき、グルコースを自分でモニターするのに有用であ
る。
フェロシアン化物を用いた本発明の望ましい実施例に
おいて、多くのテストを実施した結果、すぐれた性能を
示すことが明らかにされた。
第９図に、装置（10）に使用される回路（15）の望ま
しい実施例を示している。試料セル（20）の作用電極及
び標準電極は、接点Ｗ（作用電極）及び接点Ｒ（標準電
極）にて夫々接触する。基準電圧（41）は、アナログ電
極スイッチ（43）を通じてバッテリー（42）に接続され
る。電極Ｗ及びＲからの電流は、可変抵抗器（44）によ
って変換され、電圧−周波数変換器（46）によって変換
され、該変換器（46）は、マイクロプロセッサーに電気
的に接続される。当該分野の専門家であれば、その他の
回路を用いて本発明の利点を得ることができることは明
白である。
第10図において、セル（400）は、上部非電導材（42
2）と下部非電導材（426）の間に平面を共通にした作用
電極（426）と標準電極（424）を介在して構成される。
接着層（425）上に層を形成することもできる。上部材
（422）は、型取りした開口（428）を形成しており、作
用電極材の幅方向に沿って作用電極エリアを構成し、セ
ルの試料投入口を構成している（なお、重なる薬剤層の
部分は図示していない）。
本発明にかかる装置を用いることにより、糖尿病患者
（望ましい実施例）は、家庭内で自らテストを実施する
ことができる。本発明にかかる技術を、公知の４つの方
法と比較した結果を次の表に示している。次の表から明
らかなように、公知の方法と比べ、本発明は簡単であ
り、その簡単さ故に一定した結果を得ることができる。
本発明を用いたコレステロールの定量法に関し、一般
化した化学式で表わせば次の通りである。
［機構（Scheme）Ｉ］ コレステロールエステル＋H2O＋CE −−→コレステロール＋脂肪酸 （１） コレステロール＋OX＋CO −−→コレステノン＋Red （２） Red−−→Ox＋ｅ− （３） ここで、酵素コレステロールエステラーゼ（CE）は反
応式（１）に、コレステロールオキシダーゼ（CO）は反
応式（２）において触媒作用を及ぼす。COは、多様な電
子活性カップル（Ox及びRed）と共に電子を移動させ
る。反応式（２）は、酵素コレステロールオキシダーゼ
の存在下でコレステロールを酸化させるために、ジオキ
シゲン以外の電子受容体を用いることができるという点
において新規である。反応式（１）は当該分野ではよく
知られており、全コレステロール（自由コレステロール
とコレステロールエステル）の定量に必要である。反応
式（３）はコレステロールを探し出して定量化するため
の電気酸化プロセスである。
なお、異なる酸化剤を用いると、具体的な反応（spec
ific reactions）は次のようになる。
A: 上記の反応式（１） コレステロール＋２フェリシアン化物−CO −−→コレステノン＋２フェロシアン化物 フェロシアン化物−−→フェリシアン化物＋1e− B: 上記の反応式（１） コレステロール＋ベンゾキノーン−CO −−→コレステノン＋ヒドロキノーン ヒドロキノーン −−→ベンゾキノーン＋2H+＋2e− 種々の源から得られるコレステロールオキシダーゼ
（CO）は、コレステロールから種々の酸化剤への電子移
動に対して触媒作用を呈する。なお、酸化剤として、ベ
ンゾキノーン、ベンゾキノーン誘導体、フェリシアン化
カリウムが挙げられ、ベンゾキノーン誘導体には、メチ
ルベンゾキノーン、エチルベンゾキノーン、クロロベン
ゾキノーン、オルト−ベンゾキノーン（カテコールの酸
化形態）、スルホン酸ベンゾキノーンが含まれる。更に
また、酵素は、その他の酸化剤に対しても電子移動を可
能ならしめることは予想される。反応式（３）に示され
るように、還元生成物を電流滴定法でモニターし、コレ
ステロールの定量を決定することができる。
酸化剤でコレステロールを酸化するときの触媒作用を
行なう酵素源には、ノカルジア、ストレプトマイシス、
スキゾフィラム（Schizophyllum）、プソイドモナス、
及びブレビバクテリウムからのCOが含まれる。実験条件
下では、ベンゾキノーンはコレステロールの酸化を急速
に促進する触媒作用を呈することができる。その他の酸
化剤については、酵素源により若干異なる。例えば、ス
トレプトマイシスからのCOは、オクチルグルコノピラノ
シド及びCHAPSOを含む種々の界面活性剤の存在下、燐酸
緩衝液中におけるベンゾキノーンによる基質酸化を著し
く促進させる。同じ条件下で、ブレビバクテリウム又は
ノカルジアからのCOを使用した場合、反応は遅い。しか
しながら、ノカルジアとブレビバクテリウムの酵素源
は、両方とも、別の条件で、別の酸化剤を用いてコレス
テロールの酸化反応を行なう場合、有効な触媒となる。
酸化剤は、酵素を最も活性にする役割を果たす。例え
ば、ノカルジアからのコレステロールオキシダーゼは、
0.2モルのトリス緩衝液及び3g/dLのCHAPSOの中で、ベン
ゾキノーンとの基質酸化反応を著しく促進するが、同じ
条件でも、フェリシアン化物の場合、反応は遅い。ブレ
ビバクテリウムを源とする酵素は、種々の界面活性剤
（surfactants）を含むトリス（TRIS）緩衝液中のフェ
リシアン化物とは比較的不活性であるが、ベンゾキノー
ンを酸化剤として用いたとき、反応は非常に速い。ま
た、スキゾフィラムを源とする酵素のCOは、フェリシア
ン化物又はベンゾキノーンと種々の界面活性剤を含む燐
酸緩衝液中のコレステロールの酸化反応を著しく促進す
る。
前述したように、コレステロールオキシダーゼは、フ
ェリシアン化物によるコレステロールの酸化反応の触媒
として作用する。更に、COがフェリシアン化物によるコ
レステロールの酸化反応の触媒として作用する例とし
て、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコー
ル酸ナトリウム、CHAPS、Thesit、CHAPSO等の種々の界
面活性剤が含まれるトリス緩衝液のノカルジア源が挙げ
られる。さらに、ノカルジアからのCOは、ジオクチルス
ルホ琥珀酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、
タウロデオキシコール酸ナトリウム及びTriton X-100等
が含まれる燐酸緩衝液中でのフェリシアン化物との基質
酸化反応の触媒作用を呈する。緩衝液の濃度は、0.1〜
0.4モルである。オキシダーゼ酵素の活性作用を最大な
らしめるための界面活性剤の濃度は、各々の浄化剤（de
tergent）によって異なる。例えば、デオキシコール酸
化物又はタウロデオキシコール酸化物の場合、0.2Mのト
リス緩衝液中での酵素は、浄化剤が20〜90ミリモル（mi
llimolar）のときに活性力は最大となる。しかしなが
ら、酵素触媒の活性が観察されるのは、濃度が10％まで
である。オクチルグルコノピラノシドの場合、酵素がフ
ェリシアン化物酸化剤に対する活性が最大になるのは、
浄化剤濃度が約1.2％のときである。しかし、酵素は、
界面活性剤の濃度がそれより高くても低くても活性状態
は維持される。
エステラーゼとCOは両方とも、活性を高めるために界
面活性剤を必要とする。界面活性剤の具体例として、デ
オキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナ
トリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、CHAPS
（３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ
−１−プロパンスルフォネート）、CHAPSO（３−（３−
クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロ
キシ−１−プロパンスルフォネート）、オクチル−グル
コノピラノシド、オクチル−チオグルコノピラノシド、
ノニル−グルコノピラノシド、ドデシル−グルコノピラ
ノシド、Triton X-100、スルフォ琥珀酸ジオクチル、Th
esit（ヒドロキシポリエトキシドデカン）、及びレシチ
ン（ホスファジルコリン）が挙げられる。酵素との反応
に使用できる緩衝剤として、燐酸塩、トリス（TRIS）、
MOPS、MES、HEPES、Tricine、Bicine、ACES、CAPS、及
びTAPSが挙げられる。血清その他の体液中に含まれるコ
レステロールの測定を別の反応構成で一般化すると次の
通りである。
［機構II］ コレステロールエステル−CE −−→コレステロール＋脂肪酸 （１） コレステロール＋Ox1−CO −−→コレステノン＋Red1 （４） Red1＋Ox2−−→Ox1＋Red2 （５） Red2−−→Ox2＋ｅ− （６） OxとRed2は、コレステロールと電子活性カップル（el
ectroactive couple）Ox2/Red2との間の電子媒介カップ
ル（electron mediator couple）として機能する。この
場合、Ox1とRed1は、電気酸化プロセス（反応式
（６））に関与する必要はないから、電子活性である必
要はない。しかしながら、熱力学及び運動学上の釣合い
のため、このカップルは、酵素コレステロールオキシダ
ーゼの補助を受けて、コレステロールからの電子を受容
し、その電子を電子活性カップル（Ox2/Red2）に中継す
ることができなければならない。
この化学反応の具体例として次のものが挙げられる。
実施例１ 上記反応式（１） コレステロール＋ベンゾキノーン−CO −−→コレステノン＋ヒドロキノーン ヒドロキノーン＋２フェリシアン化物 −−→ベンゾキノーン＋２フェロシアン化物 フェロシアン化物−−→フェリシアン化物＋1e− コレステロールと機構Ｉで示す電気活性酸化物との反
応速度が遅くてその使用ができないときに、この機構II
は利点がある。また、前述したように、電子媒体自体
（Ox1/Red1）が電気活性でない場合や、酵素剤の存在下
での電気化学的性質が乏しい場合にも、この機構IIは有
利である。これらの条件にあるとき、機構IIが適用され
る。コレステロールと、機構IIで使用されるフェリシア
ン化物との電子媒体（Ox1/Red1）として、その他に、エ
イ硫酸フェナジン、メト硫酸フェナジン、テトラメチル
ベンチジン、ベンゾキノーンの誘導体、ナフトキノーン
及びナフトキノーンの誘導体、アントラキノーン及びア
ントラキノーンの誘導体、カテコール、フェニレンジア
ミン、テトラメチルフェネンジアミン、及びフェニレン
ジアミンのその他誘導体が挙げられる。
酸化された形態の電子は、センサー内のコレステロー
ルから電子を受けるが、コレステロールとフェリシアン
化物に対して速やかに反応するのであれば、媒体は酸化
された形態又は還元された形態のどちらでもよい。も
し、還元された形態は十分に安定であるが、酸化された
形態はそうでない場合、比較的少量（調べようとする検
体と比較して）の還元剤をセンサー内に入れると、電子
の中継を行なうことができる。しかしながら、この場合
は、背景信号（background signal）を考慮せねばなら
ない。還元剤はまた、別個の試薬層に入れて、センサー
内のフェリシアン化物と分離せねばならない。
機構Ｉ及びIIを包含する上記の化学組成物は、薄膜上
に乾燥フィルムとして調製した。これらの薄膜はセンサ
ー内に設けて、コレステロールの定量に使用することが
できる。機構IIに使用される試薬の望ましい組成は次の
通りである。
コレステロールエステル ＠ 400ユニット/mL ストレプトマイシスからの コレステロールオキシダーゼ ＠ 200ユニット/mL フェリシアン化カリウム 0.05モル 塩化カリウム 0.5モル pH6.9の燐酸塩 0.2モル CHAPSO 3g/dL ゼラチン 2g/dL ヒドロキノーン （分散広がり層又はウイッキング層内） 0.0001モル 濃度は、多孔性支持体、フィルター紙又は薄膜上にコ
ーティングする溶液の濃度である。これらの濃度は、薄
膜が血清又は全血液試料を吸収するときに回復する（re
established）。コレステロールの定量を行なうために
は、グルコースの場合よりも、フィルター支持体の細孔
を大きくする必要がある。これは、血清中のコレステロ
ールは、大きなリポタンパク質（キロミクロン、LDL、V
LDL、HDL）で存在し、試薬に達するまで、センサーの種
々の層の中に侵入しなければならないからである。大部
分の界面活性剤は、これら天然ミセル（natural micell
es）を破壊して、さらに小さなミセルとし、酵素が反応
触媒として作用する全表面積を更に大きくする。ベンゾ
キノーンは不安定であるため、蒸気圧が低くてより安定
なヒドロキノーンをセンサーの中に少量加えることによ
り、コレステロールとフェリシアン化物との間の電子媒
介作用を補助することができる。血清試料をセンサー内
に導入すると、ヒドロキノーンは酸化されてベンゾキノ
ーンになる。ベンゾキノーンは基質から電子を自由にピ
ックアップし、フェリシアン化物に循環させる。これら
の条件下では、コレステロールと、少量のベンゾキノー
ンとの反応速度は、大量のフェリシアン化物との反応よ
りも速い。
センサーの試薬層として用いられ、機構IIに使用され
る試薬の望ましい組成は次の通りである。
ストレプトマイシスからのコレ ステロールオキシダーゼ ＠ 200ユニット/mL カンディアからの リパーゼ ＠ 500ユニット/mL CHAPSO 3g/dL TRIS pH7.5 0.2モル フェリシアン化カリウム 0.05モル 塩化カリウム 0.5モル MgCl2 0.05モル ゼラチン 2g/dL ヒドロキノーン（分散広がり層内） 0.001モル この組成物内のマグネシウム塩は、燐酸塩を含まない
試薬層内のエステラーゼ酵素の安定性を高める作用があ
る。リパーゼはリポタンパク質の分散を促進する。これ
らの乾燥試薬をセンサー内に入れ、前述した方法論（me
thodology）で評価すると、次の結果が得られた。血清コレステロール mo％ 平均電流 μＡ 91 19.3 182 27.2 309 38.5 これらの結果は、血清のコレステロール値に対するセ
ンサーの量的応答結果を示している。
機構Ｉを用いた他の望ましい実施例は、次の試薬組成
物によってもたらされる。
コレステロールエステラーゼ ＠ 400ユニット/mL ノカルジアからのコレス テロールオキシダーゼ ＠ 200ユニット/mL Triton X-100 1g/dL TRIS緩衝液 pH8.6 0.1モル フェリシアン化カリウム 0.2モル 塩化カリウム 0.5モル MgCl2 0.02モル ゼラチン 2g/dL 又は コレステロールエステラーゼ ＠ 200ユニット/mL ストレプトマイシスからのコ レステロールオキシダーゼ ＠ 200ユニット/mL デオキシコール酸ナトリウム 0.06モル TRIS緩衝液 pH8.6 0.1モル フェリシアン化カリウム 0.2モル 塩化カリウム 0.5モル ゼラチン 2g/dL 本発明の望ましい実施例を詳細に説明したが、本発明
に変更又は変形を加えることが可能であることは理解さ
れるべきである。本発明は前述した語句そのもので限定
されるものではなく、必要に応じて、使用条件等に合わ
せて変形等はなしうることができる。従って、そのよう
な変形等は、均等の範囲内で成し得ることができ、それ
らは添付の請求の範囲の中に含まれると解すべきであ
る。前述の説明において使用した語句、表現等は、限定
するものではなく、その語句、表現等と均等なものを排
除するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲に規
定されていると認識すべきである。
当該分野の専門家が、本発明と同じものを作り、使用
できるように、本発明の作成及び使用方法について、明
瞭かつ正確な語句で記載した。
フロントページの続き (72)発明者 タルボット，ジョハサン エル. アメリカ合衆国 16046 ペンシルベニ ア，マース・ウッドヘイブン ドライブ 165 (72)発明者 ジョーダン，ジョセフ アメリカ合衆国 16803 ペンシルベニ ア，ステート カレッジ・グレン サー クル ノース 1007 (56)参考文献 Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｔａｌｂｏｔｔ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｊｏｒｄａｎ “Ａ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｍｐ ｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｓｉ ｓ”ＭＩＣＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＪＯ ＵＲＮＡＬ 37（1988．02）ｐ５−12 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/403

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】体液内の選択された化合物の量を測定する
    方法であって、以下の工程を有している、 a.酸化剤と緩衝剤を含有し、少なくとも第１の電極と第
    ２の電極を有する測定用セルを準備し、 b.試験されるべき体液の試料を前記セルの中に入れ、こ
    れにより前記電極に電流が流れて前記試料を検出して、
    次に記載の工程を自動的に開始し、 c.酸化剤と緩衝剤が、体液試料と一緒になるようにして
    所定の反応を生じさせ、 d.その反応は、実質的に反応が終了する段階まで行なわ
    せしめ、 e.電極と試料の間に電位を加え、 f.コットレル電流を測定し、試料中に含まれる選択され
    た化合物の濃度を決定する。
  2. 【請求項２】化合物は、グルコース、コレステロール、
    TSH、T4、ホルモン、不整脈抗剤、癇癪抗剤及び非治療
    性薬剤からなる群から選択される請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】酸化剤は、ベンゾキノーン、フェリシアン
    化物、フェリシニウム、コバルト（III）オルトフェナ
    ントロレン、及びコバルト（III）ジピリジルからなる
    群から選択される物質である請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】第１の電極は作用電極として使用し、第２
    の電極は標準電極として使用する請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】セルの中に、オキシドレドクターゼ酵素を
    触媒として供給する請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】緩衝剤は、リン酸塩、TRIS、MOPS、MES、H
    EPES、Tricine、Bicine、ACES、CAPS及びTAPSからなる
    群から選択される請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】血液中のグルコースの量を測定する方法で
    あって、以下の工程を有している： a.酸化剤、緩衝剤及び酵素を含有し、少なくとも第１の
    電極と第２の電極を有する測定用セルを準備し、 b.試験されるべき血液試料を前記セルに入れ、これによ
    り前記電極に電流が流れて前記試料を検出して、次に記
    載の工程を自動的に開始し、 c.酸化剤、緩衝剤及び酵素が、試料と一緒になるように
    して所定の反応を生じさせ、 d.直ちに、電極と血液試料の間に電位を加え、 e.反応がその終了段階まで進行したときコットレル電流
    を測定し、血液試料中に含まれるグルコースの濃度を求
    める。
  8. 【請求項８】酸化剤は、ベンゾキノーン、フェリシアン
    化物、フェリシニウム、コバルト（III）オルトフェナ
    ントロレン、及びコバルト（III）ジピリジルからなる
    群から選択される物質である請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】第１の電極は作用電極として使用し、第２
    の電極は標準電極として使用する請求項７に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】酵素として、グルコースオキシダーゼが
    加えられる請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】試験されるべき血液試料をセルに入れる
    ステップｂにおいて電流を発生して時間シーケンスを開
    始し、ステップｄの反応は、第１電極と第２電極の間が
    開回路で進行できるようにしている請求項１に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】水性流動体中の選択された化合物の濃度
    を求めるためのセルであって、該セルは、 a.作用電極として作用する、金属化された第１の電極、 b.標準電極として作用し、第１の電極と関連して作用す
    る第２の電極、 c.少なくとも１つの非導電層部材であって、該非導電層
    部材は、該部材を貫く開口を有し、少なくとも１つの電
    極と接して設けられ、少なくとも一方の電極に対してシ
    ールされ、前記開口内に既知の電極領域を形成してお
    り、その結果、前記開口は水性流動体試料を収容するた
    めの収容部を形成し、流動体試料を第１及び第２の電極
    に接触させて既知電極領域内に入れることができるよう
    にしている、及び d.前記試料の存在を検知するため、前記既知電極領域に
    前記試料を配置すると直ちに、電流が流れるようにさせ
    る手段、 を具えており、これにより、試料収容部の中にあるほぼ
    全てのものが、ほぼ同時に所定の反応を起こすようにし
    ている。
  13. 【請求項１３】流動体試料中の化合物を測定する装置で
    あって、 a.その中を貫く通路を有するハウジングと、 b.ハウジングの通路に収容されることのできる試料セル
    を具え、該試料セルは、 作用電極として作用する、金属化された第１の電極、 標準電極として作用し、第１の電極と関連して作用する
    第２の電極、 少なくとも１つの非導電層部材であって、該非導電層部
    材は、該部材を貫く開口を有し、少なくとも１つの電極
    と接して設けられ、少なくとも一方の電極に対してシー
    ルされ、前記開口内に既知の電極領域を形成しており、
    その結果、前記開口は流動体試料を収容するための収容
    部を形成し、流動体試料を第１及び第２の電極に接触さ
    せて既知電極領域内に入れることができるようにしてい
    る、及び 前記試料の存在を検知するため、前記既知電極領域に前
    記試料を配置すると直ちに、電流が流れるようにさせる
    手段、 を具えており、 c.第１の電極と第２の電極に電位を加えるための手段
    と、 d.試料を通じて、第１の電極と第２の電極間に電気回路
    を形成する手段と、 e.試料の中を流れるコットレル電流を測定するための手
    段と、 f.測定結果を視覚的に表示する手段、 を具えている。
  14. 【請求項１４】試料の中を流れるコットレル電流を測定
    する手段は、マイクロプロセッサーを有している請求項
    13に記載の装置。
  15. 【請求項１５】セルは、開口によって形成される試料収
    容部の内部に配備された試薬層を含んでいる請求項12に
    記載のセル。
  16. 【請求項１６】試薬層は、酸化剤、緩衝剤及び結合剤を
    含んでいる請求項15に記載のセル。
  17. 【請求項１７】試薬層は、多孔質基材にコーティングさ
    れた酸化剤、緩衝剤及び結合剤の層であって、該基材は
    セル内部に配備される請求項16に記載のセル。
  18. 【請求項１８】試薬層は、酸化剤、緩衝剤、結合剤の混
    合物がセルに直接付着されている請求項16に記載のセ
    ル。
  19. 【請求項１９】酸化剤は、ベンゾキノーン、フェリシア
    ン化物、フェリシニウム、コバルト（III）オルトフェ
    ナントロレン、及びコバルト（III）ジピリジルからな
    る群から選択される請求項16に記載のセル。
  20. 【請求項２０】緩衝剤は、リン酸塩、TRIS、MOPS、ME
    S、HEPES、Tricine、Bicine、ACES、CAPS及びTAPSから
    なる群から選択される請求項16に記載のセル。
  21. 【請求項２１】試薬層は酵素を含み、該酵素はオキシド
    レドクターゼである請求項16に記載のセル。
  22. 【請求項２２】第１の電極は、プラチナ、金、パラジウ
    ム、銀、炭素からなる群から選択される金属でコーティ
    ングされた非導電性基板から構成される請求項12に記載
    のセル。
  23. 【請求項２３】第２の電極は、プラチナ、金、パラジウ
    ム、銀、炭素、銀／塩化銀、銀／酸化銀からなる群から
    選択される金属でコーティングされた非導電性基板から
    構成される請求項12に記載のセル。
  24. 【請求項２４】第１の非導電層部材は、該部材を貫く開
    口を有し、第１の電極上に設けられており、第１の電極
    は第２の電極の上に設けられ、第２の電極は第２の非導
    電層部材の上に設けられている請求項12に記載のセル。
  25. 【請求項２５】第１の層部材は、第１の電極を露出して
    第１の電極に電気接触領域を形成する複数のノッチを含
    んでおり、第１の電極は、第２の電極を露出して第２の
    電極に電気接触領域を形成するノッチを有している請求
    項12に記載のセル。
  26. 【請求項２６】第１の電極は複数回、折り曲げられ、各
    々の折曲げ部の開口は、流動体試料を収容するための収
    容部を形成し、第１の電極は、第１の非導電層部材に対
    して、第１の部材の開口が第１の電極の開口と対向する
    ように配置される請求項24に記載のセル。
  27. 【請求項２７】第１の電極と第２の電極は、単一の基板
    の上に平面を共通して配備される請求項12に記載のセ
    ル。
  28. 【請求項２８】第２の電極は円形の開口を有し、非導電
    層部材の開口は第２の電極の開口と中心を同じくし、第
    ２の電極の開口は非導電層部材の開口よりも直径が小さ
    く、円形の機能性電極領域が第２の電極に形成され、第
    １の電極は第２の電極の下方に配備されており、第２の
    電極の開口は第１の電極を露出し、第１の電極に機能性
    電極領域を形成している請求項12に記載のセル。
  29. 【請求項２９】水性流動体試料が挿入されると、水性流
    動体試料の存在を検出するために、電位の印加を開始す
    る手段を具えており、該開始手段は、水性流動体試料の
    存在が検出されると反応の時間シーケンスを開始させる
    ために、信号をマイクロプロセッサーに送る手段と、反
    応の時間シーケンスが実行される間、電位を取り除く手
    段を具えている請求項24に記載のセル。
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