DD283683A5

DD283683A5 - Verfahren und apparat fuer amperometrische diagnostische analysen

Info

Publication number: DD283683A5
Application number: DD89326624A
Authority: DD
Inventors: Paul A Pottgen; Neil J Szuminsky; Jonathan L Tabbott; Joseph Jordan
Original assignee: Life-Chek Laboratories,Us
Priority date: 1988-03-15
Filing date: 1989-03-15
Publication date: 1990-10-17
Also published as: AU3343689A; SE9002930L; AU644059B2; JPH04501309A; JP2901678B2; SE9002930D0

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Messung der Menge einer ausgewählten Verbindung in Körperflüssigkeiten und eine Probezelle, gekennzeichnet dadurch, dass a) eine zu testende Flüssigkeitsprobezelle in einer Probezelle untergebracht wird, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist; b) die Probe mit einem Oxydationsmittel und einem Puffer vermischt wird; c) ein Potential an die Elektrode und die Probe angelegt wird; d) der resultierende Strom zur Bestimmung der Konzentration der in der Probe vorhandenen ausgewählten Verbindung gemessen wird.{Messung; Verbindungen; biologisch wichtig; Körperflüssigkeiten; amperometrisch; Probezelle neuartig}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine elektroanalytische Einwegzelle sowie eine Methode zur quantitativen Bestimmung des ' Vorhandenseins von biologisch wichtigen Voraussetzungen wie Glucose; THS; T4; Hormonen wie ECQ; Oigitalisglycosiden wie Digoxion; antiarrhythmischen Mitteln wie Lldocaln; antieplleptischen Mitteln wie Phenobarbital; Antibiotika wie Gentamicin; Cholesterin; nichttherapeutitthen Arzneimitteln und dergleichen In Körperflüssigkeiten.

Obwohl die Erfindung ein breites Anwendungsfeld findet, wird zum Zwecke der Erläuterung der Erfindung besonderes Augenmerk auf ihre Anwendung bei der quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins von zwei biologisch wichtigen Voraussetzungen - Glucose und Cholesterin - gelegt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Erfindung stellt eine Teilweiterführung unserer früher eingereichten Anmeldung, Anmeldeaktenzeichen Nr. 168.295 der Vereinigten Staaten, eingereicht am 15. März 1988, dar

Im Falle von Glucose:

Diabetes, und vor allem Diabetes mellitus, ist eine Stoffwechselkrankheit, die durch eine mangelhafte Insulinproduktion der Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist, wodurch abnormale Blutglucosespiegel entstehen. Wenn diese Krankheit auch bei nur annähernd 4% der Bevölkerung der Vereinigten Staaten zu verzeichnen ist, so ist sie doch die dritthäufigste Todesursache hinter Herzerkrankungen und Krebs. Durch einwandfreie Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels des Patienten durch tägliche Injektionen von Insulin und strenge Kontrolle der Nahrungsaufnahme ist die Prognose bei Diabetes ausgezeichnet. Allerdings muß der Blutglucosespiegel bei einem Patienten entweder durch klinische Laboranalyse oder durch eine tägliche Analyse, die der Patient mit Hilfe verhältnismäßig einfacher nichttechnischer Verfahren selbst durchführen kann, genau verfolgt werden. Gegenwärtig beruht die übliche Technologie für die Überwachung der Blutglucose auf der visuellen oder instrumenteilen Bestimmung der durch aromatische Reaktionen auf einer trockenen Reagenzunterlage auf einem schmalen Plastestreifen hervorgerufenen Farbver änderung. Diese kolorimetrischen Methoden, bei denen das natürliche Oxydationsmittel für Glucose zu Gluconsäure, speziell Sau, rstoff, herangezogen wird, basieren auf den folgenden Reaktionen:

B-D-Glucose + O₂ + H₂O-* D-Gluconsäure + H₂O₂ H₂O₂ + Reaktionsmittel -» H₂O + Farbe

Im Falle von Cholesterin:

Der gegenwärtigen Technologie fürdie Bestimmung von Cholesterin liegen ebenfalls ähnliche Methoden zugrunde. Im Falle von Cholesterin basieren die zur Zeit angewandten Methoden auf den verellgemeinerten Reaktionen:

Cholesterin + H₂O + O₂-* Cholestenon + H₂O₂ H₂O₂ + Reaktionsmittel -> H₂O + Farbe

Bei allen zur Zeit angewandten Techniken stellt Disauerstoff das einzige direkte Oxydationsmittel dar, das mit dem Enzym Cholesterinoxidase für die Bestimmung von sowohl freiem als auch Gesamtcholesterin angewandt wird. Bei der Durchführung konventioneller Testverfahren muß der Sauerstoff während des Gebrauchs aus der umgebenden Luft in die Sensorlösung diffundieren, damit ausreichend Reaktionsmittel für eine vollständige Reaktion mit dem Analyten Cholesterin in unverdünnten Serum- und Gesamtblutproben zur Verfugung stehen kann.

In beiden Fällen wird das Vorhandensein der Substanz entweder durch kolorimetrische oder anderweitige Quantifizierung des vorhandenen Wasserstoffperoxids bestimmt. Die gegenwärtigen Nachweismethoden können die direkte Messung des erzeugten Wasserstoffperoxids entweder durch spektroskopische der elektrochemische Maßnahmen und indirekte Methode umfassen, bei denen das Wasserstoffperoxid mit verschiedenen Farbstoffen in Gegenwart des Enzyms Peroxidase umgesetzt wird, so daß eine Farbe erzeugt wird, die beobachtet wird.

Wenn diese Tests auch verhältnismäßig einfach auszuführen sind, so erfordern sie doch zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse eine konsequente Anwendertechnik. Bei diesen Test ist beispielsweise die Entnahme von Blut von einer fiesgensmittelschicht in spezifilierten und kritischen Zeitintervallen erforderlich. Nach diesem Zeitintervall muß überschüssiges Blut durch Waschen oder Abtupfen, oder nur durch Abtupfen, entfernt werden, weil die Farbmessung auf der Oberfläche der Reagensmittelschicht vorgenommen wird. Die Farbentwicklung wird entweder sofort abgelesen oder zu einem späteren Zeitpunkt.

Liese Schritte verlangen eine gute und konsequente Arbeitstechnik sowie die strikte Einhaltung der Zeitvorgabe. Selbst bei der Anwendung einer guten Arbeitstechnik hat sich darüber hinaus bei kolorimetrischen Methoden für die Bestimmung von beispielsv eise Glucose gezeigt, daß sie keine gute Präzision und Genauigkeit, vor allem im hyperglycämischen Bereich, aufweisen. Außerdem weichen die für die quantitative kolorimetrische Messung verwendeten Instrumente sehr stark in ihren Eichungsmethoden voneinander ab; einige sehen keine Eichung durch den Benutzer vor, während andere sekundäre Standards liefern.

Wegen des allgemeinen Mangels an Genauigkeit und Standardisierung der verschiedenen Methoden und Geräte, die zur Zeit für die Prüfung biologisch wichtiger Verbindungen in Körperflüssigkeiten zur Verfügung stehen, zögern einige Ärzte, derartige Vorrichtungen für die Beobachtungen vor. Mengen und Dosierungen zu verwenden. Sie haben vor allem Bedenken, solche Methoden für die Anwendung durch die Patienten selbst zu empfehlen. Daher wäre es wünschenswert, wenn es eine Methode und ein Gerät gäbe, durch die nicht nur der Arzt in die Lage versetzt wird, derartige Verbindungen mit besserer Zuverlässigkeit zu testen, sondern der Patient es auch selbst tun könnte.

Methoden der enzymatischen Amperometrie sind auf Laborbasis für die Messung einer Reihe von Analyten, die Glucose, Blut -Harnstoff- Stickstoff und Lactat umfassen, angewandt worden. Herkömmlich bestehen die Elektroden in diesen Systemen aus eperrlpon Metalldrähten, Zylindern oder Scheiben, die in ein Isoliermaterial eingebettet sind. Der Herstellungsprozeß resultiert ' in Individualistischen Eigenschaften jeder Elektrode, so daß eine Eichung jedes Sensors erforderlich ist. Diese Elektroden sind außerdem für die Einweg-Anwendung zu teuer und machen eine sehr sorgfältige Instandhaltung der Elektroden für eine kontinuierliche und zuverlässige Anwendung erforderlich. Diese Instandhaltung wird von ungeübtem Personal (wie Patienten) kaum richtig ausgeführt werden können, daher muß eine erfolgreiche Enzym-Amperometriemethode, die für das Selbst-Testen vorgesehen ist (oder nichttraditionelles beliebiges Testen) auf einem wegwerf baren Sensor basieren, der in einer Weise hergestellt worden kann, durch die er in der Lage ist, daß jeder einzelne Sensor reproduzierbare Ergebnisse liefern kann, und das bei Kosten, die weit unter denen herkömmlicher Elektroden liegen.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung werden enzymatisch-amperometrische Methoden für die Überwachung von Verbindungen im Gesamtblut, Serum und in anderen Körperflüssigkeiten zur Verfügung gestellt. Enzymatisch^ Amperometrie bietet verschiedene Vorteile für die Kontrolle oder Eliminierung von Techniken, die vom Benutzer abhängig sind, und sie weist einen größeren linearen dynamischen Bereich auf.

Gegenüber bereits bekannten Selbst-Test-Systemen werden mit den erfindungsgemäßen Methoden genaue und zuverlässige Analysenergebnisse erhalten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, als Selbst-Test-Systome geeignete Methoden zur quantitativen Analyse ausgewählter Verbindungen in Körperflüssigkeiten zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird eine Methode zur Messung der Menge einer ausgewählten Verbindung in Körpbrflüssigkeiten unter Verwendung miniaturisierter elektroanalytischer Einweg-Probenahmezellen für präzise Mikro-Aliquoten-Probenahme und einer unabhängigen automatischen Vorrichtung zur Messung der elektrochemischen Reduktion der Probe zur Verfügung gestellt. Enzymatische Amperometrie bietet verschiedene Vorteile für die Kontrolle oder Eliminierung von'Techniken, die vom Benutzer abhängig sind, und sie weist einen größeren linearen dynamischen Bereich auf. Ein auf dieser Verfahrensweise beruhendes System könnte die Bedenken des Arztes, seinen Patienten das Solbst-Testen zu empfehlen, beseitigen. Methoden der enzymatischen Amperometrie sind auf Laborbasis für die Messung einer Reihe von Analyten, die Glucose, Blut -Harnstoff - Stickstoff und Lactat umfassen, angewandt worden.

Herkömmlich bestehen die Elektroden in diesen Systemen aus sperrigei. Metalldrähten, Zylindern oder Scheiben, die in ein Isoliermaterial eingebettet sind. Der Herstellungsprozeß resultiert in individualistischen Eigenschaften jeder Elektrode, so daß eine Eichung jedes Sensors erforderlich Ist. Diese Elektroden sind außerdem für die Einweg-Anwendung zu teuer und machen eine sehr sorgfältige Instandhaltung der Elektroden für eine kontinuierliche und zuverlässige Anwendung erforderlich. Diese Instandhaltung wird von ungeübtem Personal (wie Patienten) kaum richtig ausgeführt werden können, daher muß eine erfolgreiche Enzym-Amperometriemethode, die für das Selbst-Testen vorgesehen ist (oder nichttraditionelles beliebiges Testen) auf einem wegwerfbaron Sensor basieren, der in einer Weise hergestellt werden kann, durch die er in der Lage ist, daß jeder einzelne Sensor reproduzierbare Ergebnisse liefern kann, und das bei Kosten, die weit unter denen herkömmlicher Elektroden liegen.

Die Erfindung befaßt sich mit diesen Anforderungen, indem sie miniaturisierte elektroanalytische Einweg-Probenahmezellen für präzise Mikro-Aliquoten-Probonahme, eim unabhängige automatische Vorrichtung zur Messung der elektrochemischen Reduktion der Probe und ein Verfahren für die Anwendung der erfindungsgemäßen Zelle und des erfindungsgemäßen Gerätes zur Verfügung stellt. Die erfindungsgemäßen Einwegzellen sind vorzugsweise aus laminierten Schichten von metallisiertem Plaste- und nichtleitendem Werkstoff zusammengesetzt. Die metallisierten Schichten stellen die Arbeits- und Bezugselektroden dar, deren Flächen durch den Laminierungsprozeß reproduzierbar ausgelegt wurden. In diesen Schichten befindet sich eine Öffnung, die den Bereich für die Aufnahme der Probe oder die Zelle für die genaue Messung der Probe bildet. Durch das Einsetzen der Zelle in das erfindungsgemäße Gerät wird der Meßzyklus automatisch in Gang gesetzt.

Zum besseren Verständnis des Meßverfahrens wird ein gegenwärtig bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben, das eine Zweistufenreaktionsfolge umfaßt, bei der ein chemischer Oxydationsschritt unter Einsatz anderer Oxydationsmittel anstelle von Sauerstoff und ein elektrochemischer Reduktionsschritt für die Quantifizierung des Reaktionsproduktes des ersten Schrittes angewandt werden. Die Anwendung eines anderen Oxydationsmittels anstelle von Disauerstoff für die direkte Bestimmung eines Analyten hat den Voi teil, daß es in einem großen Überschuß in bezug auf den Analyten vorher in den Sensor eingebracht werden kann und dadurch sichert, daß das Oxydationsmittel nicht das einschränkende Reaktionsmittel ist (bei Disauerstoff ist anfangs normalerweise nicht ausreichendes Oxydationsmittel in der Sensorlösung zur quantitativen Umwandli ng des Analyten vorhanden).

Bei der Oxydationsreaktion wird eine beispielsweise Glucose enthaltende Probe in Gluconsäure und ein Reduktionsprodukt des Oxydationsmittels umgewandelt. Es wurde festgestellt, daß diese chemische Oxydationsreaktion in Gegenwart eines Enzyms, Glucoseoxidase, das für das Substrat B-D-Glucose überaus spezifisch ist und Oxydationen mit einfachen und doppelten Elektronenakzeptoren katalysiert, bis zum Abschluß abläuft. Man hat jedoch gefunden, daß der Oxydationsprozeß nicht bis über die Bildung von Gluconsäure hinaus verläuft, wodurch diese Reaktion für die elektrochemische Messung von Glucose ganz besonders geeignet ist.

Bei einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform werden Oxydationen mit einem Elektronenakzeptor unter Verwendung von Ferrlcyanld, Ferrlcinlum, CobaltdlD-orthophenantrolln und CobaltdlD-dlpyrldyl bevorzugt. Benzochlnon ist ein Zwei· Elektronenakzeptor, der ebenfalls ausgezeichnete Elektro-Oxydationseigenschaften für die amperometrische Quantifizierung ' liefert.

Erfindungsgemäß wird zum Beispiel für die amperometrische Bestimmung von Glucose die Cottrell-Strom-Mikrochronoamperometrie angewandt, bei der Glucose plus ein oxydierter Elektronenakzeptor Gluconsäure und einen reduzierten Akzeptor erzeugen. Diese Bestimmung umfaßt einen vorausgehenden chemischen Oxydationsschritt, der durch einen enzymatlschen Doppelsubstrat-Doppelprodukt-Mechanlsmus katalysiert wird, wie aus der Spezifikation deutlich wird. Bei dieser Quantifizierungsmethode erfolgt die Messung eines gesteuerten Diffusionsstromes zu einem genau vorgeschriebenen Zeitpunkt (z. B. 20,30 oder 50 Sekunden) nach dem Moment der Anlegung eines Potentials nach der für die Amperomc.. Ie anwendbaren Gleichung bei einem kontrollierten Potential (E = konstant) von:

'COTTRELL" "f*'⁷«**"' 'Cme&Wit bei t > 0

* Formel unleserlich (d. Üben.)

worin i den Strom bezeichnet, nF die Anzahl Coulomb je Mol ist, D der Diffusion ikoeffizient der reduzierten Form des Reaktionsmittels ist, t die festgesetzte Zelt ist, bei der der Strom gemessen wire, jnd C die Konzentration des Metaboliten ist. Die Messungen des auf die Reoxydation der Akzeptoren zurückzuführenden Stromes mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode erwiesen sich als zur Glucosekonientration in der Probe proportional.

Mit der erfindungsgemäßen Methode und dem erfindungsgemäßen Gerät sind bei bevorzugten Ausführungsbeispielen direkte Messungen von Blutglucose, Cholesterin und dergleichen möglich. Außerdem gestattet die erfindungsgemäße Probezelle die Prüfung von kontrollierten Blutvolumen ohne vorheriges Messen. Das Einführen der Probenahmezelle in das Gerät ermöglicht somit ein automatisches Funktionieren und Timing der Reaktion und erlaubt dem Patienten das Selbst-Testen mit einem sehr hohen Präzisions- und Genauigkeitsgrad.

Eine der vielen gegenwärtigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung für die Anwendung bei der Messung von B-D-Glucose wird zum besseren Verständnis der Art und des Geltungsbereiches der Erfindung ausführlich beschrieben. Das Verfahren und das Gerät gemäß dieser Ausführungsform sind vor allem für die klinische Selbst-Überwachung der Blut-Glucoeespiegel durch einen Diabetes-Patienten vorgesehen. Die erfindungsgemäße Probezelle wird für die Kontrolle des Probenahmevolumens und der Reaktio ismittel verwendet und wirkt als der elektrochemische Sensor. Bei dieser beschriebenen Ausführung wird Benzochinon als der Elektronenakzeptor eingesetzt. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandte grundlegende chemische Zweistoff-Reaktion ist folgendermaßen:

B-D-Glucose + Benzochinon + H₂O-^ Gluconsäure -I Hydrochinon Hydrochinon -» Benzochinon + 2 e" + 2H⁺

Bei der ersten Reaktion handelt es sich um eine Oxydationsreaktion, die in Gegenwart des Enzyms Glucoseoxidase bis zum Abschluß abläuft. Im zweiten Teil der Reaktion findet eine elektrochemische Oxydation statt, die die Möglichkeit für di6 Quantifizierung der in der Oxydationsreaktion erzeugten Hydrochinonmenge liefert. Das ist der Fall, gleich ob die katalytische Oxydation mit Zwei-Elektronenakzeptoren oder Ein-Elektronenakzeptor wie Ferricyanid (worin das Redoxpaar Fe(CN)(T³/ Fe(CN)₈"⁸ wäre), Ferricinium, CobaltdlD-trisorthophenantrolin und CobaltdlD-trispyridiyl durchgeführt wird. Die katalytische Oxydation durch Glucoseoxidase ist für B-D-Glucose sehr spezifisch, ist aber hinsichtlich des Oxydationsmittels nichtselektiv. Es ist jetzt entdeckt worden, daß die oben beschriebenen bevorzugten Oxydationsmittel ausreichend positive Potentiale besitzen, um im wesentlichen die gesamte B-D-Glucose in Gluconsäure umzuwandeln. Außerdem bietet d^!<tses System die Möglichkeit, daß mit seiner Hilfe nur 1 mg Glucose (bei der bevorzugten Ausführungsform) bis 1000mg Glucose je Deziliter Probe gemessen werden können - Ergebnisse, die bisher bei der Anwendung anderer Selbst-Test-Systeme für Glucose nicht erzielt werden konnten.

Die Sensoren, die die chemischen Mittel zur Durchführung der verlangten Bestimmung enthalten und gemäß der Erfindung hergestellt wurden, werden mit einem tragbaren Meßgerät für die Selbst-Test-Systeme verwendet. Bei Gebrauch wird der Sensor in das Meßgerät eingesetzt, wodurch das Meßgerät eingeschaltet und eine Wartezeit für den Einsatz der Probe eingeleitet wird. Das Meßgerät erkennt den Probeneinsatz durch den plötzlichen Ladestromfluß, der erfolgt, wenn die Elektroden und die darüberliegende Reagensschicht zu Beginn durch die Probenflüssigkeit angefeuchtet werden. Sobald der Probeneinsatz erkannt ist, beginnt das Meßgerät den Reaktionsinkubationsschritt (dessen Länge vom chemischen Mittel abhängig ist), damit die enzymatische Reaktion bis zum Ende erfolgen kann. Diese Periode liegt in der Größenordnung von 15 bis 90 Sekunden bei Glucose, wobei Inkubationszeiten von 20 bis 45 Sekunden bevorzugt werden. Nach der Inkubationsperiode legt das Instrument dann ein bekanntes Potential an die Elektroden an und mißt den Strom zu spezifischen Zeitpunkten während der Cottrell-Strom-Abnahme. Strommessungen können im Bereich von 2 bis 30 Sekunden nach der Anlegung des Potentials vorgenommen werden, wobei Meßzeiten von 10 bis 20 Sekunden bevorzugt werden. Diese Stromwerte werden anschließend für die Berechnung der Analytkonzentration verwandt, die dann angezeigt wird. Das Meßgerät wird dann warten, daß der Benutzer entweder den Sensor entfernt, oder daß eine bestimmte Zeit vergeht, bevor es sich selbst ausschaltet. Die Erfindung betrifft ein Meßsystem, das verschiedene der kritischen, vom Benutzer abhängigen Variablen, die die Genauigkeit und Zuverlässigkeit nachteilig beeinflussen, ausschaltet und einen größeren dynamischen Bereich als andere Selbst-Test-Systeme bietet.

Diese und andere Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung einer zur Zeit für die Messung

' von Glucose bevorzugten Aueführungeform und einer änderen für die Messung von Cholesterin hervorgehen, die in Verbindungmit den beigefügten Zeichnungen, in der gleiche Zahlen gleiche Bestandteile darstellen, zu lesen Ist. In der Zeichnung stellen dar:

Fig. 1: eine auseinandergezogene Ansicht eines erfindungsgemäßen tragbaren Testgerätes; Fig. 2: eine Draufsicht der erfindungsgemäßen Probenahmezelle; Fig. 3: eine auaeinandergezogene Ansicht der in Fig. 2 gezeigten Probezellu; Fig. 4: eine auseinandergezogene Ansicht einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probezelle; Fig. 5: eine Draufsicht der in Fig. 4 gezeigten Zelle; Fig. 6: noch eine andere Ausführungsform der Probezelle; Fig. 7: ein Diagramm, das den Strom als Funktion der Glucosekonzentration zeigt; FIj. 8; eine graphische Darstellung von Cottrell-Strom als Funktion der Glucosekonientration; Fig. 9: ein gegenwärtig bevorzugtes Blockschaltbild einer elektrischen Schaltung für die Anwendung bei dem in Fig. 1 gezeigten

Gerät;

Fig. 10: eine bevorzugte Ausführungsform der elektrochemischen Zelle.

In Fig. 1 wird ein elektrochemisches Testgerät tür den Gebrauch des Patienten zum Selbst-Prüfen, wie beispielsweise des Blut-Giucosespiegele, gezeigt. Das Gerät 10 besteht aus einer vorderen und hinteren Gehäuse 11 bzw. 12, einer Frontplatte 13 und einer Schaltungstafel 15. Die Frontplattn 13 enthält Tafeln 16 für die graphische Anzeige, die Informationen und Instruktionen für den Patienten liefern sowie eine direkte Anzeige der Testergebnisse. Obwohl ein Startknopf 18 zur Einleitung der Analyse vorhanden ist, wird bevorzugt, daß das System den Betrieb beginnt, wenn eine Probezelle 20 in das Fenster 19 des Gerätes eingeschoben wurde.

In Fig.3 ist die Probezelle 20 ein metallisiertes Plastesubstrat mit einer speziell bemessenen Öffnung, die eine volumetrische Vertiefung 21 nach dem Zusammenbau der Zelle für die Aufnahme der Reagensmittelschicht und des zu analysierenden Blutes bildet. Die Probezelle 20 enthält ein erstes Substrat 22 und ein zweites Substrat 23, die vorzugsweise aus Styrol oder einem anderen nichtleitenden Plastematerial bestehen können. Aus dem zweiten Substrat 23 befindet sich die Bezugselektrode 24. Die Bezugselektrode 24 kann vorzugsweise so hergestellt werden, daß die Elektrode zum Beispiel auf ein Substrat, das aus einem Material wie Polyimid-Kapton hergestellt ist, aufgedampft wird. In dem bevorzugten Ausführungebeispiel ist die Bezugselektrode 24 eine Silber-Silberchlorid-Elektrode. Diese Elektrode kann so hergestellt werden, daß zuerst eine Silberschicht von Silberchlorid entweder mit Hilfe chemischer oder elektrochemischer Mittel aufgebracht wird, bevor das Substrat zur Herstellung der Zelle benutzt wird. Die Silberchloridschicht kann auch in situ auf einer Silberelektrode erzeugt werden, wenn die Reaktionsmittelschicht bestimmte Oxydationsmittel wie Ferricyanid und Chlorid enthält, wie in den folgenden Reaktionen gezeigt wird:

Ag + Ox -> Ag⁺ + Red Ag⁺-Cl"-* AgCI

Alternativ kann die Silbor-Silberchloridelektrode durch Aufbringen einer Silberoxidschicht (durch reaktives Zerstäuben) auf den Silberfilm hergestellt werden. Diese Silberoxidschicht wird anschließend in situ zum Zeitpunkt des Testes in Silberchloric nach folgender Reaktion umgewandelt:

Ag₂O + H₂O + 2Cr -> 2AgCI + 2(OH)"

wenn der Sensor durch die ProbenPüssigkeit angefeuchtet wird und wieder die das Chlorid enthaltende Reagensschicht herstellt. Die Siiberelektrode besitzt eine Silberchlorid enthaltende Schicht. Die Bezugselektrode kann auch von der Art sein, die allgemein als „Pseudo'-Bezugselektrode bekannt ist, die auf dem großen Überschuß der oxydierenden Mittel beruht, um ein bekanntes Potential an einer Edelmetallelektrode zu schaffen. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden zwei Elektroden aus dem gleichen Edelmetall verwendet, allerdings hat eine im allgemeinen eine größere wirksame Oberfläche und wird als die Bezugselektrode verwendet. Durch den großen Überschuß der oxydierten Mittel und die größere wirksame Oberfläche der Bezugselektrode wird ein Widerstand gegen eine Verschiebung des Potentials der Bezugselektrode geschaffen. Die Indikator- oder Arbeitselektrode 26 kann entweder als Streifen von Platin, Gold, Palladium oder metallisierter Plaste auf der Bezugselektrode 24 vorhanden sein, oder alternativ können die Arbeitselektrode 26 und die Bezugselektrode als koplanare Einheit hergestellt werden, wobei die Arbeitselektrode 26zwischen das Material der koplanaren Bezugselektrode 24 eingebettet wird. Die Probezelle 20 wird vorzugsweise durch Einbetten oder Laminieren der Elektroden zwischen das Substrat hergestellt, um eine Verbundstoffeinheit zu bilden.

Wie in Fig. 2 zu sehen ist, weist das erste Substrat 22 eine etwas geringere Länge auf, so daß der Endabschnitt 27 der Bezugselektrode 24 und Arbeitselektrode 26 freiliegt, damit dar elektrische Kontakt mit der in dem Gerät vorhandenen Prüfschaltung hergestellt werden kann. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die Probezelle 20, nachdem eine Probe in die Vertiefung 21 gegeben wurde, in das Fenster 19 der Frontplatte geschoben, um den Test in Gang zu setzen. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann ein Reaktionsmittel in die Vertiefung 21 gegeben werden, oder es wird vorzugsweise eine Schicht trockenen Reaktionsmittels darin untergebracht und eine Probe (Tropfen) des Blutes in die das Reaktionsmittel enthaltende Vertiefung 21 gegeben.

In Fig.4 bis 6 werden alternative Ausführungsformen der Probezelle 20 gezeigt. In Fig. 4 wird die Probezelle 120 gezeigt, die erstes Substrat 122undzweitesSubstrat 123 aufweist. Die Bezugselektrode 124unddieArbeitselektrode 126 sind zwischen das erste Substrat 122 und zweite Substrat 123 laminiert. Die öffnung 121 ist so bemessen, daßsledie Probe für den Test aufnehmen «kann. Das Ende 130 ist so beschaffen, daß es In das Gerat eingeschoben werden kann, und der elektrische Kontakt mit den betreffenden Elektroden wird durch die Ausschnitte 131 und 132 an der Zelle hergestellt. Die Bezugselektrode 124 weist auch den Ausschnitt 133 für die Herstellung des elektrischen Kontaktes mit der Arbeitselektrode 126 auf. In Fig.6 ist die Arbeitselektrode 226 gefaltet, wodurch eine größere wirksamere Oberfläche um die Öffnung 221 herum geschaffen wird, um eine höhere Sensitivität oder Spezifität zu erzielen. In diesem Fall befindet sich die Bezugselektrode 224 unter der Arbeitselektrode 226. Die Arbeitselektrode weist den Ausschnitt 234 auf, damit der elektrische Kontakt mit der Bezugselektrode 224 durch den Ausschnitt 231 in dem Substrat 222 hergestellt werden kann. Das Ende 230 von Substrat 222 weist auch den Ausschnitt 232 auf, durch den der elektrische Kontakt mit der Arbeitselektrode 226 geschaffen werden kann. Die erfindungsgemMße Probezelle wird durch Fenster 19 geschoben, um das Testverfahren In Gang zu setzen. Sobald sie eingesetzt ist, wird über die Bezugselektrode 24 und Arbeitselektrode 26 an den Endabschnitt 27 der Probezelle ein Potential angelegt, um das Vorhandensein der Probe nachzuweisen. Sobald das Vorhandensein der Probe ermittelt Ist, wird das Potential entfernt und die Inkubationsperiode eingeleitet. Wahlweise kann während dieser Periode eine Vibratorvorrichtung für die Bewegung der Reaktionsmittel in Gang gesetzt worden, um ihre Auflösung zu unterstützen (eine Inkubationsperiode von 20 bis 45 Sekunden wird normalerweise für die Bestimmung von Glucose vorgesehen, und im allgemeinen ist keine Vibration erforderlich). Als nächstes wird ein elektrisches Potential an Endabschnitt 27 der Probezelle zu der Bezugselektrode 24 und Arbeitselektrode 26 gelegt, und der durch die Probe fließende Strom wird gemessen und auf der Tafel 16 angezeigt. Um das erfindungsgemäße Gerät mit vollem Vorteil einsetzen zu können, sind die erforderlichen chemischen Mittel für die Selbst-Test-Systeme in einer trockenen Reagensschicht enthalten, die sich auf der Einwegzelle befindet und einen vollständigen Sensor für den betreffenden Analyten bildet. Die elektrochemische Einwegzelle wird zusammengesetzt, indem metallisierte Plaste- und nichtleitende Werkstoffe in einer solchen Weise laminiert werden, daß eine genau definierte Arbeitselektrodenfläche entsteht. Die Reaktionsmittelschicht wird entweder direkt auf die Zelle aufgetragen oder vorzugsweise in eine Trägermatrix eingearbeitet (oder dsrauf aufgetragen) wie Filterpapier, Membranfilter, Gewebe, Faservliesstoff, die dann in der Zelle untergebracht wird. Wenn eine Trägermatrix verwendet wird, können ihre Porengröße und ihr Zwischenporenvolumen so gewählt werden, daß die erforderliche Genauigkeit und eine mechanische Unterlage geschaffen werden. Im allgemeinen stellen Membranfilter und Faservliesstoff die besten Werkstoffe für die Unterlage der Reaktionsmittelschicht dar. Porengrößen von 0,45 bis 50μπι und Zwischenporenvolumen von 50 bis 90% sind angemessen. Die Beschichtungsformulierung enthält im allgemeinen ein Bindemittel wie Gelatine, Carrageen, Methylcellulose, Polyvinylalkohol, PolyvinyHpyrroplidon usw., das zur Verzögerung der Auflösung der Reaktionsmittel dient, bis die Reaktionsmittelschicht den größten Teil der Flüssigkeit aus der Probe absorbiert hat. Die Konzentration des Bindemittels liegt im allgemeinen in der Größenordnung von 0,1 bis 10%, wobei 1 bis 4% bevorzugt werden.

Die Reaktionsmittelschicht absorbiert eine bestimmte Menge der Probenflüssigkeit, wenn diese auf die Oberfläche der Schicht aufgebrachtwird, wodurch jegliche Notwendigkeit einer vorausgehenden Messung des Probenvolumens entfällt. Außerdem ist · es aufgrund der Messung des Stromflussos anstelle des reflektierten Lichtes nicht erforderlich, das Blut vor der Messung von der Oberfläche der Reaktionsmittelschicht zu entfernen, wie es bei Reftaxions-Spektroskopie-Systemen der Fall sein muß. Obwohl die Flüssigkeitsprobe direkt auf die Obei fläche der Reaktionsmittelschicht aufgetragen werden könnte, enthält der Sensor zur besseren Ausbreitung des Blutes auf der gesamten Oberfläche vorzugsweise eine Dispergler-Ausbreitungs- oder Saugschicht. Diese Schicht, im allgemeinen ein Faservliesstoff oder ein Saugpapier, befindet sich über der Reaktionsmittelschicht und dient zur raschen Verteilung des Blutes auf der Reaktionsmittelschicht. In einigen Anwendungsfällen könnte die Dispergierer.hicht zusätzliche Reaktionsmittel enthalten.

Zur Bestimmung von Glucose wurden Zellen in koplanarer Ausführung hergestellt, deren Reaktionsmittelschicht die folgenden Formulierungen enthält:

Glucoseoxidase	600p/ml
Kaliumferricyanid	0,4 M
Phosphatpuffer	0,1 M
Kaliumchlorid	0,5 M
Gelatine	2,0 g/dl

Diese wurde durch Beschichten eines Membranfilters mit einer Lösung der obigen Zusammensetzung und Lufttrocknung hergestellt. Die Reaktionsmittelschicht wurde anschließend in Streifen geschnitte 1, die gerade in die Fensteröffnung der Zellen paßten, und diese Streifen wurden auf die in den Fenstern freiliegenden Elektroden gelegt. Eine Saugschicht aus Kunstseide-Faservliesstoff wurde dann über dieser Reaktionsmittelschicht angebracht und mit Hilfe eines darüberliegenden Streitens festgehalten. Um die Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Technologie zu beweisen, wurde eine große Anzahl von Beispielen in einer wäßrigen Lösung bei 25⁰C durchgeführt. Der Elekti olyt bestand aus oinem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 und wies annähernd 0,1 Mol Gesamtphosphat und 0,5 M Kaliumchloridreagenz auf. Die Potentiale wurden mit einer normalen Wasserstoff-Elektrode (NHE) verglichen. Bei diesen Tests ergab es sich, daß jedes Potential zwischen annähernd +0,8 und 1,2 Volt (gegen NHE) für die Quantifizierung von Hydrochinon geeignet ist, wenn Benzochinon als Oxydationsmittel verwendet wird. Die Grenzströme sind den Hydrochinonkonzentrationen im Bereich von 0,0001 M und 0,050 M proportional. Die Bestimmung von Glucose durch Cottrell-Strom (i,)-Mikrochronoamperometrie mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich aus der Reaktion von Hydrochinon zu Benzochinon. Die Abnahme der Cottrell-Ströme im Laufe der Zeit erfolgt nach Gleichung:

i,.,V2 = konst.

Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Techniken liegt in der Anlegung des entsprechenden kontrollierten Potentials nach Beendigung der Glucose-Benzochinon-Reaktinn und der Korrelation der Glucoeekonzentrationen mit den zu einem bestimmten späteren Zeitpunkt gemessenen Ccttrell-Strömen. Die Strom-Zeit-Darstellung wird In Fig.8 gezeigt. Die ' Proportionalität zwischen den Glucosekonzentratlonen und den Cottrell-Strömen (aufgezeichnet bei t = 30 Sekunden nach der Anlegung des Potentials) ist in Fig.7 wiedergegeben.

Es ist zu beachten, daß die Cottrell-Chronoamperometrie von Metaboliten doppelte Sicherheiten der enzymatischen Katalyse und der Elektrolyse mit gesteuertem Potential erfordert. Gluconeäureauebeu'.en von 99,9 + % wurden in Gegenwart von Glucoseoxidase erzielt. Gleichzeitig wurden äquivalente Mengen von Benzochinon zu Hydrochinon reduziert, das an stationären Palladium-Dünnfümanoden oder Probezellen in ruhigen Lösungen einfach quantifiziert wurde.Die Ergebnisse dieser vielen Tests demonstrieren die mikrochronoamperometrische Methodologie der Erfindung und ihre praktische Anwendung für die Selbstüberwachung der Glucose durch Diabetiker. Bei einem gegenwärtig bevorzugten Anwendungsbeispiel der Erfindung wurden unter Einsatz von Ferrocyanid eine Reihe von Tests ausgeführt, die einige verbesserte Arbeitsmöglichkeiten zeigten.

In Fig.9 wird ein schematisches Diagramm einer für die Anwendung in Gerät 10 bevorzugten Schaltungsanordnung 15 gezeigt. Die Schaltungstafel 15 umfaßt einen Mikroprozessor und die LCD-Ta(el 16. Die Arbeit?· und Bezugselektrode auf der Probezelle 20stellen an den Kontakten W (Arbeitselektrode) bzw. R (Bezugselektr tde) den Kontakt her. Die Spannungsquelle 41 ist durch den Analogleistungsschalter 43 mit der Batterie 42 verbunden. Der von den Elektroden W und R kommende Strom wird durch den einstellbaren Widerstand 44 umgewandelt, und die Spannung des Frequenzwandlers 46 ist elektrisch mit dem Mikroprozessor verbunden. Andere, dem erfahrenen Techniker bekannte Schaltungen können selbstverständlich zur Erzielung der Vorteile der Erfindung angewandt werden.

In Fig. 10 besteht die Zelle 400 aus der koplanaren Arbeitselektrode und der Bezugselektrode 424, die zwischen ein oberes 422 und unteres 426 nichtleitendes Material laminiert sind. Das Laminat befindet sich auf einer Klebeschicht 425. Das obere Material 422 enthält eine ausgestanzte Öffnung 428, die zusammen mit der Breite des Materials der Arbeitselektrode die Arbeitselektrodenfläche darstellt und (mit einer überlappenden, nicht gezeigten Reaktionsmittelschicht) die i'.-obenahmevertiefung der Zelle bildet. An einem Ende der Zelle 400 befindet sich ein dem Endabschnitt 27 ähnlicher offener Bereich 427.

Der Wirkungsgrad, der sich durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Gerätes als Vorrichtung für das Selbst-Testen durch Patienten wie Diabetiker in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel zu Hause ergibt, kann aus der folgenden Tabelle entnommen werden, in der die erfindungsgemäße Technologie mit vier zur Verfügung stehenden Geräten verglichen wird. Wie man feststellen kann, ist die Erfindung einfacher, und in diesem Falle bedeutet Einfachheit Konsistenz bei den Ergebnissen.

Vergleiche des Glucosesystems

Schritte	1	2	3	4	Erfindung
Instrument einschalten	X	X	X	X	X
Instrument eichen	X	X
Fingerdruck	X	X	X	X	X
Blut auftragen	X	X	X	X	X
Auslösen derTiming-Folge	X	X	X
Ablöschen	X	X	X
Einsetzen des Ablesestreifens	X	X	X	X
Ergebnisse ablesen	X	X	X -	X	X
Gesamte Schritte je Test	8	8	7	5	4
Nachweissystem	RS»	RS	RS	RS	polarographisch
Bereich (mg/dl)	10-400	40-400	25-450	40-400	0-1000
CV" hypoglycämisch	15%	15%			5%
euglycämisch	10%	10%			3%
hyperglycämisch	5%	5%			2%
Korrelation	0,921	0,862			0,95

* RS = Reflexions-Spektroskopie " Variatonskoeffizient

Wird speziell die Bestimmung von Cholesterin unter Anwendung der Erfindung in Betracht gezogen, kann der verallgemeinerte chemische Ablauf folgendermaßen dargestellt werden:

Cholesterinester + H₂O + CE -» Cholesterin + Fettsäure (1) Cholesterin + OX + CO -» Cholestenon + Red (2)

Red -> Ox + e" (3)

worin die Enzyme Cholesterinesterase (CE) und Cholesterinoxidase (CO) die Reaktion 1 bzw. 2 katalysieren und CO die Elektronenübertragung mit einer Vielzahl elektroaktiver Paare (Ox und Red) ermöglicht. Die Reaktion 2 ist insofern neuartig, als andere Elektronenakzeptoren anstelle von Disauerstoff zu Oxydieren von Cholesterin in Gegenwart des Enzyms Cholesterinoxidase verwendet werden können. Die Reaktion 1 ist Fachleuten aligemein bekannt, und sie ist für die Bestimmung

-8- 283 633

von Gesamtcholesterin (freiem Cholesterin und Cholesterinestern) erforderlich. Die Reaktion 3 ist oln Elektrooxydationsprozeßfür die Untersuchung und Quantifizierung von Cholesterin.

Unter Einsatz alternativer erfindungsgemäßer Oxydationsmittel werden die spezifischen Reaktionen zu: A: Reaktion 1 oben Cholesterin + 2Ferr!cyanld - CO-> Cholestenon + 2Ferrocyanld

Ferrocyanid-* Ferrlcyanid +1 e" B: Reaktion 1 oben

Cholesterin + Benzochinon - CO-> Cholestenon + Hydrochinon Hydrochinon -»Benzochinon + 2H⁺ + 2e~

Cholesterinoxidese (CO) aus den verschiedensten Quellen wird die Elektronenübertragung von Cholesterin zu einer Vielzahl von Oxydationsmitteln katalysieren, zu denen Benzochinon, Benzochinonderivate wie Methylbenzochinon, Ethylbenzochinon, Chlorbenzochinon, Orthobenzochinon (oxydierte Form von Catechol), Benzochinonsulfonat und Kaliumferricyanid zu zählen sind. Es ist auch vorgesehen, daß das Enzym die Elektronenübertragung mit anderen alternativen Oxydationsmitteln ermöglichen wird. Wie aus Reaktion 3 hervorgeht, kann das reduzierte Produkt dann amperometrlsch für die quantitative Bestimmung von Cholesterin verfolgt werden.

Quellen für das die Oxydation von Cholesterin mit alternativen Oxydationsmitteln katalysierende Enzym umfassen CO von Nocardia, Streptomyces, Schizophyllum, Peeudomanas und Brevibacterium; die experimentellen Bedingungen, unter denen es fähig ist, die Oxydation von Cholesterin durch Benzochinon oder eines der anderen Oxydationsmittel rasch zu katalysieren, hängen etwas von der Herkunft des Enzyms ab. Zum Beispiel katalysiert CO von Streptomyces die Substratoxydation mit Benzochinon in Phosphatpuffer in Gegenwart eines der zahlreichen oberflächenaktiven Mittel wie Octylgluconopyranosid und CHAPSO schnell; die gleiche Reaktion verläuft unter identischen Bedingungen mit CO von Brevibacterium oder Nocardia langsamer. Allerdings sind Nocardia und Brevibacterium-Quellen aktive Katalysatoren für die Cholesterinoxydation durch alternative Oxydationsmittel unter anderen Bedingungen.

Es spielt auch das Oxydationsmittel, in dem das Enzym am aktivsten ist, eine Rolle. Zum Beispiel katalysiert Cholesterinoyidase von Nocardia die Substratoxydation mit Benzochinon in 0.? Mol TRIS-Puffer und 3g/dl CHAPSO schnell, sie ist aber langsamer mit Ferricyanid unter identischen Bedingungen; das aus der Brevibacterium-Quelle stammende Enzym ist mit Ferricyanid in TRIS-Puffer mit den verschiedensten oberflächenaktiven Mitteln verhältnismäßig inaktiv, wenn aber Benzochinon als Oxydationsmittel verwendet wird, erfolgt die Reaktion sehr schnell. Alternativ wird die Oxydation'von Cholesterin in Phosphatpuffer mit entweder Ferricyanid oder Benzochinon und mit einer Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln als Aktivatoren durch Enzym CO aus der Schizophyllumquelle sehr schnell katalysiert.

Wie dargestellt wurde, wird Cholesterinoxidase die Oxydation von Cholesterin durch Ferricyanid katalysieren. Weitere Beispiele, bei denen CO die Cholesterinoxydation durch Ferricyenid katalysiert, umfassen eine Nocardia-Quelle in TRIS-Puffer mit einer Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln wie Natriumdesoxycholat, Natriumtaurodesoxycholat, CHAPS, Thesit und CHAPSO. ' Außerdem wird CO von Nocardia auch die Substratoxydation mit Ferricyanid in Phosphatpuffer mit Natriumdioctylsulfosuccirtat, Natriumdesoxycholat, Natriumtaurodesoxycholat und Triton X-100 katalysieren. Die Pufferkonzentration beträgt von 0,1 bis 0,4 Mol. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels für eine maximale Aktivität des Oxidaseenzyms variiert mit jedem Detergens. Zum Beispiel ist das Enzym mit Desoxycholat oder Taurodesoxycholat in 0,2 M TRIS mit im Bereich von 20 bis 90 Millimol liegendem Detergens am aktivsten. Die katalytische Enzymaktivität ist jedoch bis zu einer und durch eine Konzentration von 10% zu beobachten. Mit Octylgluconopyranosid tritt die maximale Aktivität des Enzyms mit dem Oxydationsmittel Ferricyanid bei einer Detergenskonzentration von annähernd 1,2% auf; das Enzym behält aber auch die Aktivität bei höheren und niedrigeren Konzentrationen des oberflächenaktiven Mittels.

Sowohl Esterase als auch CO verlangen ein oberflächenaktives Mittel für eine hohe Aktivität. Spezifische oberflächenaktive Mittel umfassen Natriumdesoxycholat, Natriumtaurodesoxycholat, Natriumglycödesoxycholat, CHAPS Of-ChlolamidopropyDdimethylammonio-i-propansulfonat), CHAPSO (3(-Chlolamidopropyl)dimethylammonio-2-hydroxy-1-propansulfonat, Octylgluconopyranosid, Octylthiogluconopyranosid, Nonylglyconopyranosid, Dodecylgluconopyranosid, Triton X-100, Dioctylsulfosuccinat, Thesit (Hydroxypolythoxydodecan) und Lecithin (Phosphatidylchinon). Puffer, die für den Ablauf der Reaktion mit dem Enzym annehmbar sind, umfassen Phosphat, TRlS, MOPS, MES, HEPES, Tricine, Bicine, ACES, CAPS und TAPS. Ein alternatives verallgemeinertes Reaktionsschema für die Messung von Cholesterin in Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten wird wie folgt gegeben:

Schema Il

Cholesterinester - CE-»Cholesterin + Fettsäure (1) Cholesterin + Ox₍ -CO-* Cholestenon + Redi (4) Red, + Ox₂-* Ox₁ + Red₂ (5)

Red₂-»Ox_} + e~ (6)

worin Ox und Red₂ als Elektronenbeschleunigerpaar zwischen Cholesterin und dem elektroaktiven Paar Ox₂/Red₂ fungieren. In diesem Fall müssen Ox₁ und Redt nicht elektroaktiv sein, weil sie nicht an dem Elektrooxydationsprozeß beteiligt sein müssen (Reaktion 6). Unter einem thermodynamischen und kinetischen Gesichtspunkt muß dieses Paar mit Unterstützung des Enzyms Cholesterinoxidase jedoch in der Lage sein, Elektronen von Cholesterin aufzunehmen und sie zu dem elektroaktiven Paar (Ox₂/Red₂) weiterzugeben. Spezifische Beispiele für diese chemischen Vorgänge sind:

Beispiel 1

Reaktion 1 oben

, Cholesterin + Benzochlnon -CO-* Cholestenon + Hydrochinon

Hydrochinon + 2 Ferricyanid-» Benzochlnon + 2Ferrocyanld

Ferrocyanid -» Ferricyanld + 1 e~

Schema Il Ist günstig, wenn die Reaktionsgeschwindigkeit von Cholesterin mit dem elektroaktiven Oxydationsmittel nach Schema I so gering Ist, daß sie seine Verwendung in einem praktischen Sensor ausschließt. Wie oben gesagt wurde, !st Schema Il auch günstig, wenn der Elektronenbeschleuniger selbst (Οχι/Red,) entweder nicht elektroaktiv Ist oder unter den Bedingungen der Enzymchemie eine schlechte Elektrochemie aufweist. Unter diesen Bedingungen ist Schema Il ganz besonders anwendbar. Andere Elektronenbeschleuniger (Ox,/Red₍) zwischen Cholesterin und Ferrlcyanid könnon für Schema Il eingesetzt werden, wie Phenazinethosulfat, Phenazinmethosulfat,Tetramethylbenzidin, Derivate von Benzochinon, Naphthochinon und Naphthochinonderivate, Anthrachinon und Anthrachinonderivate, Catechol, Phenylendiamin, Tetramethylphenendiamin und andere Derivate von Phenylendiamin.

Außerdem kann, wenn auch beabsichtigt ist, daß die oxydierte Form des Elektronenzwischengliedes Elektronen von Cholesterin erhält, in den Sensor entweder die oxydierte oder die reduzierte Form des Beschleunigers eingefügt werden, vorausgesetzt, daß eine schnelle Reaktion mit Cholesterin und Ferricyanid zustandekommt. Wenn die reduzierte Form ausreichend beständig ist und die oxydierte Form es nicht ist, dann kann ein Reduktionsmittel in den Sensor In einer verhältnismäßig geringen Menge (im Vergleich zu dem zu bestimmenden Analyten) eingefügt werden und noch das Elektronenzwischenglied bilden. Dadurch entsteht jedoch ein entsprechendes Hintergrundsignal, das berücksichtigt werden muß. Das Reduktionsmittel muß auch von Ferricyanid in dem Sensor isoliert werden, indem es in eine getrennte Reaktionsmittelschicht eingefügt wird. Verschiedene Formulierungen der obigen chemischen Mittel, die in Schema I und Il eine Rolle spielen, sind als trockene Filme auf Membranen hergestellt worden. Diese Membranen sind in dem Sensor untergebracht, der dann für die Bestimmung von Cholesterin verwendet werden kann. Eine bevorzugte Formulierung der für Schema Il verwendeten Reaktionsmittel besteht aus folgendem:

Cholesterinesterase etwa 400 Einheiten/ml

Cholesterinoxidase von Streptomyces etwa 200 Einheiten/ml

0,05 Mol Kaliumferricyanid

0,5 Mol Kaliumchlorid

0,2 Mol Phosphat, pH 6,9

3g/dl CHAPSQ

2g/dl Gelatine und

0,0001 Mol Hydrochinon (in der Verteilungs- oder Saugschicht).

Die vorgesehenen Konzentrationen sind die der Lösungen, die auf die porösen Unterlagen, Filterpapier der Membranen aufgetragen wurden; diese Konzentrationen werden wiederhergestellt, wenn die Membran das Serum oder die Gesamtblutprobe aufsaugt. Für die Bestimmungen von Cholesterin sind in der Filterunterlage größere Porengrößen erforderlich als für Glucose angewandt werden. Die Ursache dafür ist, daß das Cholesterin in dem Serum in großen Lipoprotelnen vorliegt (Chylomicron, LDL, VLDL und HDL), die die verschiedenen Schichten des Sensors durchdringen müssen, bevor sie zu den Reaktionsmitteln gelangen. Die oberflächenaktiven Mittel brechen diese natürlichen Micelle zu einem großen Teil in kleinere Micelle auf, so daß eine größere wirksame Gesamtfläche geschaffen wird, auf der die Enzyme die Reaktion katalysieren. Infolge der Instabilität von Benzochinon wird eine geringe Menge Hydrochinon, das aufgrund seines niedrigeren Dampfdruckes beständiger ist, i.~. don Sensor zur Unterstützung der Elektronenbeschleunigung zwischen Cholesterin und Ferricyanid eingefügt. Nach dem Einsetzen der Serumprobe in den Sensor wird das Hydrochinon zu Benzochinon oxydiert; das Benzochinon ist dann frei, um Elektronen aus dem Substrat aufzunehmen und sie zu Ferricyanid weiterzuleiten. Unter diesen Bedingungen ist die Reaktionsgeschwindigkeit von Cholesterin mit einer geringen Menge Benzochinon höher als bei einem großen Überschuß von Ferricyanid.

Eine alternative und bevorzugte Formulierung von Reaktionsmitteln für das Schema II, die in die Reaktionsmittelschicht des Sensors eingebracht werden können, ist folgendermaßen:

Cholesterinoxidase von Streptomyces etwa 200 Einheiten/ml

Lipase von Candida etwa 500 Einheiten/ml

3g/dl CHAPSO

0,2 Mol TRIS, pH 7,5

0,05 Mol Kaliumferricyanid

0,5 Mol Kaliumchlorid

0,05 Mol MgCI₂

2g/dl Gelatine und

0,001 Mol Hydrochinon (in der Verteilungsschicht).

Durch das Magnesiumsalz in dieser Formulierung wird die Beständigkeit des Esteraseenzyms in der phosphatfreien Reaktionsmittelschicht erhöht; Lipase unterstützt das Aufbrechen der Lipoproteine. Mit diesen in den Sensor eingefügten trockenen Reaktionsmittelschichten und unter Anwendung der beschriebenen Auswertungsmethodologie wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

-10- 283 683 Serumcholesterin, mg% Durchschnittlicher Strom, μΑ

91 19,3

182 27,2

309 38,6

Diese Ergebnisse zeigen das quantitative Ansprechen des Sensors auf die Cholesterlnspiegel im Serum. Eine alternative und bevorzugte Ausführungsform des Sensors bei Schema I wird durch die folgenden Roaktionsmittelzusammensetzungen geschaffen:

Cholesterinesterase etwa 400 Einheiten/ml Cholesterinoxidase von Nocardia etwa 200 Einheiten/ml

1 g/dl Triton X-100 0,1MolTRIS-Puffer,/jH8,6 0,2 Mol Kallumferrocyanid 0,5 Mol Kaliumchlorid 0,02MoIJvIgCI₂

2 g/dl Gelatine oder

Cholesterinesteraäe etwa 200 Einhelten/ml Cholesterinoxidase von Streptomyces etwa 200 Einheiten/ml

0,06 Mol Natriumdeeoxycholat

0,1MolTRIS-Puffer,pH8,6

0,2 Mol Kaliumferricyanid

0,5 Mol Kaliumchlorid

2 g/dl Gelatine.

Wenn auch die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erläutert und beschrieben wurde, so ist doch vorgesehen, daß die Erfindung verändert und modifiziert werden kann, und daher ist es nicht beabsichtigt, daß sie die oben dargestellten Bereiche beschränken soll, sondern es ist wünschenswert und beabsichtigt, daß von Veränderungen und Abwandlungen, die für die Anpassung der Erfindung an verschiedene Einsatzmöglichkeiten und bedingungen gemacht werden können, Gebrauch gemacht wird. Es ist vorgesehen, daß solche Veränderungen und Abwandlungen daher im vollen Bereich von Äquivalenten und somit im Geltungsbereich der folgenden Ansprüche liegen. Die in den obigen Spezifikation^ angewandten Begriffe und Ausdrücke werden darin als Begriffe für die Beschreibung und nicht als Einschränkung angewandt, und bei der Anwendung solcher Begriffe und Ausdrücke ist nicht vorgesehen, Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen, wobei zu beachten ist, daß der Geltungsbereich der Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche definiert und begrenzt wird. . Hiermit wurde die Erfindung und die Art und Weise sowie der Herstellungsprozeß und ihre Anwendung vollständig, klar, knapp und genau beschrieben, damit interessierte Fachleute oder Leute, die es betrifft, dieselbe herstellen und anwenden können.

Claims

1. Methode zur Messung der Menge einer ausgewählten Verbindung in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet dadurch, daß

a) eine zu testende Flüssigkeitsprobe in einer Probezelle untergebracht wird, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist;

b) die Probe mit einem Oxydationsmittel und einem Puffer vermischt wird;

c) ein Potential an die Elektroden und die Probe angelegt wird;

d) der resultierende Strom zur Bestimmung der Konzentration der in der Probe vorhandenen ausgewählten Verbindung gemessen wird.

2. Methode nach Anspruch \, gekennzeichnet dadurch, daß die Verbindung aus der Glucose, Cholesterin, TSH, T4_; Hormone, antiarrhythmische Mittel, antiepileptische Mittol und nichttherapeutische Arzneimittel umfassende Gruppe ausgewählt wird.

3. Methode nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Oxydationsmittel aus der Benzochinon, Ferricyanid, Ferricinium, Cobalt(lll)-trosorthophenantroline und Cobalt(lll)-tripyridyl umfassenden Gruppe ausgewählt wird.

4. Methode nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Elektroden der Probezelle eine Bezugs- und eine Arbeitselektrode darstellen.

5. Probezelle, gekennzeichnet durch

a) ein erstes und ein zweites nichtleitendes Substrat, wobei sich in dem ersten Substrat eine Öffnung befindet; eine metallisierte erste Elektrode auf dem zweiten Substrat untergebracht ist; und

eine zweite Elektrode auf der ersten Elektrode angebracht ist, wobei sich die erste Elektrode über einem Abschnitt der zweiten Elektrode befindet, um mit der dazwischen befindlichen ersten und zweiten Elektrode ein Laminat zu bilden, und die Öffnung die Elektrodeazur Bildung einer Probenvertiefung freilegt;
oder

b) ein erstes und zweites nichtleitendes Substrat und eine erste und zweite metallisierte Elektrode, wobei sich die erste elektrode auf dem zweiten Substrat befindet und die zweite Elektrode einschließlich eines nichtleitenden Substrats zwischen dem ersten und dem zweiten Substrat untergebracht ist; eine Öffnung durch das erste Substrat und die zweite Elektrode führt, wobei die Öffnung eine Probenvertiefung bildet.

oder

c) ein erstes und zweites nichtleitendes Substrat und eine Arbeits-und eine Bezugselektrode, wobei die Bezugselektrode eine metallisierte Schicht auf dem zweiten Substrat aufweist und die Arbeitselektrode eine metallisierte Schicht auf einer zwischen das erste und das zweite Substrat laminierten nichtleitenden Unterlage aufweist; wobei die Arbeitselektroden einen gefalteten Abschnitt mit einer hindurchführenden Öffnung, die eine Probenvertiefung darstellt, hat, und eine durch das erste Substrat führende Öffnung mit der Öffnung in der Arbeitselektrode ausgerichtet ist.

6. Probezelle nach Anspruch 5a), gekennzeichnet dadurch, daß die erste Elektrode eine Bezugselektrode darstellt und die zweite Elektrode eine Arbeitsolektrode ist.

7. Probezelle nach Anspruch 5 b), gekennzeichnet dadurch, daß die erste Elektrode eine Arbeitselektrode ist und die zweite Elektrode eine Bezugselektrode ist, und daß die Öffnung in der zweiten Elektrode kleiner als die Öffnung des ersten Substrates ist.

8. Probezelle nach Anspruch 5 b), gekennzeichnet dadurch, daß die erste Elektrode eine Bezugselektrode ist und die zweite Elektrode eine Arbeitselektrode ist.

9. Probezelle nach Anspruch 5c), gekennzeichnet dadurch, daß das erste Substrat ein Paar Aussparungen aufweist, die eine Kontaktfläche auf der Arbeitselektrode und eine Kontaktfläche auf der Bezugselektrode freilegen und bilden, und eine Aussparung in der Arbeitselektrode unter der Aussparung in dem ersten Substrat liegt, um die Kontaktfläche der Bezugselektrode zu bilden.

Hierzu 6 Seiten Zeichnungen