DE69915850T2

DE69915850T2 - Kleinvolumiger in vitro sensor mit diffusionsfähigem oder nichtauswaschbarem redoxvermittler

Info

Publication number: DE69915850T2
Application number: DE69915850T
Authority: DE
Inventors: J. Benjamin FELDMAN; Adam Heller; Ephraim Heller; Fei Mao; A. Joseph VIVOLO; V. Jeffery FUNDERBURK; C. Fredric COLMAN; Rajesh Krishnan
Original assignee: Therasense Inc
Current assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Priority date: 1998-10-08
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: ES2223185T3; US20100012516A1; US20100076285A1; US6592745B1; US6618934B1; JP2002526759A; US20100012523A1; US9891185B2; US7225535B2; JP3553884B2; US20100032317A1; US20060169599A1; US20100012520A1; EP1119637A1; US8182671B2; WO2000020626A1; US8377378B2; US9291592B2; US8186044B2; US8083928B2

Description

Diese Erfindung betrifft analytische Sensoren für den Nachweis von Bioanalyten in einer kleinvolumigen Probe.
Hintergrund der Erfindung
Analytische Sensoren sind in der Chemie und der Medizin für die Bestimmung der Anwesenheit und der Konzentration eines biologischen Analyten nützlich. Derartige Sensoren werden beispielsweise für die Überwachung der Glucose bei Diabetes-Patienten und von Lactat in der Intensivmedizin benötigt.
Die derzeit verfügbare Technologie misst Bioanalyten in relativ großen Probenvolumina, die z. B. im allgemeinen 3 Mikroliter oder mehr an Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten erfordern. Diese flüssigen Proben werden von einem Patienten beispielsweise mittels einer Nadel und einer Spritze erhalten oder durch das Anstechen eines Teiles der Haut, beispielsweise der Fingerspitze, und das "Melken" des Gebietes, um ein nützliches Probenvolumen zu erhalten. Diese Prozeduren sind für den Patienten unangenehm und oft schmerzhaft, insbesondere dann, wenn häufige Proben benötigt werden. Es sind weniger schmerzhafte Verfahren für die Gewinnung einer Probe bekannt, beispielsweise das Anstechen des Armes oder des Schenkels, die eine geringere Dichte an Nervenendigungen zeigen. Allerdings produziert das Anstechen des Körpers in den bevorzugten Gebieten Blutproben im Submikroliterbereich, da diese Gebiete nicht besonders gut mit Kapillargefäßen versorgt sind, die knapp unter der Oberfläche liegen.
Es wäre deshalb wünschenswert und sehr hilfreich, einen relativ schmerzfreien, leicht zu verwendbaren Sensor für Blutanalyten zu entwickeln, der imstande ist, eine genaue und empfindliche Analyse der Konzentration von Analyten in einem kleinen Probenvolumen durchzuführen. Sensoren, die einen Analyten in einer Probe elektrochemisch messen können, sind in der Technik bekannt. Einige in der Technik bekannte Sensoren verwenden zumindest zwei Elektroden und können einen Redoxmediator enthalten, um bei der elektrochemischen Reaktion zu helfen. Jedoch führt die Verwendung eines elektrochemischen Sensors zum Messen eines Analyten in einem kleinen Volumen einen Fehler in die Messungen ein. Eine Art von Ungenauigkeit kommt von der Verwendung eines diffundierbaren Redoxmediators. Da die Elektroden in einem kleinvolumigen Sensor so dicht zusammen sind, kann ein diffundierbarer Redoxmediator sich zwischen der Arbeits- und der Gegenelektrode hin- und herbewegen und das für den Analyten gemessene Signal vergrößern. Eine andere Quelle für eine Ungenauigkeit bei einem kleinvolumigen Sensor ist die Schwierigkeit beim Bestimmen des Volumens der kleinen Probe oder beim Bestimmen, ob die Probenkammer gefüllt ist. Es würde daher erwünscht sein, einen kleinvolumigen elektrochemischen Sensor zu entwickeln, der die Fehler vermindern kann, die von der Größe des Sensors und der Probe stammen.
Die WO 98/35225 offenbart einen Sensor mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Probenkammer zum Aufnehmen einer Probe mit dem zu messenden Analyten. Die Probenkammer umfaßt eine Messzone mit einem Volumen von weniger als ungefähr 1 μl. Ein nicht-auslaugbarer Redoxmediator, der als ein Elektronenübertragungsmittel zwischen dem Analyten und der Arbeitselektrode funktioniert, ist auf einem Teil der Arbeitselektrode vorhanden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Sensoren stellen ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Analyten in Proben im Submikroliterbereich bereit. Allgemein umfasst die Erfindung ein Verfahren und einen Sensor für die Analyse eines Analyten in einem kleinen Probenvolumen, vorzugsweise durch Coulometrie, Amperometrie und/oder Potentiometrie. Ein Sensor der Erfindung verwendet einen nicht-auslaugbaren oder diffundierbaren Redoxmediator. Der Sensor umfaßt auch eine Probenkammer, um die Probe in elektrolytischen Kontakt mit der Arbeitselektrode zu halten. In vielen Fällen enthält der Sensor auch eine nicht-auslaugbares oder diffundierbares zweites Elektronenübertragungsmittel.
Bei einer bevorzugten Ausführung liegt die Arbeitselektrode einer Gegenelektrode gegenüber und bildet in der Probenkammer zwischen den beiden Elektroden eine Messzone, die so dimensioniert ist, dass sie ein Volumen von nicht mehr als ungefähr 1 μl Probe enthält, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 0,5 μl, weiter vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 0,25 μl, und am bevorzugtesten nicht mehr als ungefähr 0,1 μl Probe. Ein Sorbensmaterial ist optional in der Probenkammer und Messzone angeordnet, um das Volumen an Probe zu vermindern, das benötigt wird, um die Probenkammer und die Messzone zu füllen.
Bei einer Ausführung der Erfindung ist ein Biosensor vorgesehen, der coulometrisches elektrochemisches Messen mit einem nicht-auslaugbaren oder diffundierbaren Redoxmediator kombiniert, um einen Bioanalyten in einem Probenvolumen im Submikroliterbereich genau und effizient zu messen. Der bevorzugte Sensor umfaßt eine Elektrode, einen nicht-auslaugbaren oder diffundierbaren Redoxmediator auf der Elektrode, eine Probenkammer zum Halten der Probe in elektrischen Kontakt mit der Elektrode und vorzugsweise Sorbensmaterial, das in der Probenkammer angeordnet ist, um das Volumen der Kammer zu reduzieren. Die Probenkammer ist zusammen mit irgendeinem Sorbensmaterial dimensioniert, um für die Analyse eines Probenvolumens zu sorgen, das typischerweise nicht mehr als ungefähr 1 μl, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 0,5 μl, mehr vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 0,25 μl und am bevorzugtesten nicht mehr als ungefähr 0,1 μl beträgt. In einigen Fällen enthält der Sensor auch ein zweites nicht-auslaugbares oder diffundierbares Elektronenübertragungsmittel.
Eine Ausführung der Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten in einer Probe, indem zuerst die Probe mit einem elektrochemischen Sensor in Kontakt gebracht wird, und dann die Konzentration des Analyten bestimmt wird. Der elektrochemische Sensor umfaßt ein sich gegenüberliegendes Elektrodenpaar mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode und einer Probenkammer einschließlich einer Messzone, die zwischen den beiden Elektroden angeordnet ist. Die Messzone ist dimensioniert, um nicht mehr als ungefähr 1 μl Probe zu enthalten.
Die Erfindung umfaßt auch einen elektrochemischen Sensor mit zwei oder mehr sich gegenüberliegenden Elektrodenpaaren. Jedes Elektrodenpaar hat eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine Messzone zwischen den beiden Elektroden, wobei die Messzone dimensioniert ist, um nicht mehr als ungefähr 1 μl Probe zu halten. Außerdem enthält der Sensor auch einen nicht-auslaugbaren Redoxmediator auf der Arbeitselektrode von zumindest einem der Elektrodenpaare oder einen diffundierbaren Redoxmediator auf einer Oberfläche in der Probenkammer oder in der Probe.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten in einer Probe, indem die Probe mit einem elektrochemischen Sensor in Kontakt gebracht wird und die Konzentration des Analyten durch Coulometrie bestimmt wird. Der elektrochemische Sensor umfaßt ein Elektrodenpaar mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode. Der Sensor umfaßt auch eine Probenkammer zum Halten einer Probe in elektrolytischem Kontakt mit der Arbeitselektrode. In der Probenkammer ist Sorbensmaterial, um das Probenvolumen zu reduzieren, das benötigt wird, um die Probenkammer zu füllen, so dass die Probenkammer dimensioniert ist, um nicht mehr als ungefähr 1 μl Probe zu enthalten. Die Probenkammer kann auch einen nicht-auslaugbaren oder diffundierbaren Redoxmediator enthalten, und enthält optional ein zweites nicht-auslaugbares oder diffundierbares Elektronenübertragungsmittel.
Die Sensoren können auch einen Füllstandanzeiger enthalten, wie z. B. eine Anzeigeelektrode oder ein zweites Elektrodenpaar, das verwendet werden kann, um zu bestimmen, wann die Messzone oder Probenkammer gefüllt ist. Eine Anzeigeelektrode oder ein zweites Elektrodenpaar kann auch verwendet werden, um die Genauigkeit der Messung der Konzentration des Analyten zu vergrößern. Die Sensoren können auch ein Heizelement umfassen, um die Messzone oder Probenkammer zu erwärmen, um die Oxidations- oder Reduktionsgeschwindigkeit des Analyten zu vergrößern.
Die Sensoren können für eine Seiten- oder Spitzenbefüllung konfiguriert sein. Außerdem kann bei einigen Ausführungen der Sensor Teil einer integrierten Vorrichtung zur Probennahme und Bestimmung des Analyten sein. Die integrierte Vorrichtung zur Probennahme und Bestimmung des Analyten kann den Sensor und ein Hautpunktierglied enthalten, derart, dass die Vorrichtung verwendet werden kann, um die Haut eines Benutzers zu punktieren, um einen Fluss einer flüssigen Probe, wie z. B. Blut, zu bewirken, die dann von dem Sensor gesammelt werden kann. Bei zumindest einigen Ausführungen kann die flüssige Probe gesammelt werden, ohne die integrierte Vorrichtung zur Probennahme und Bestimmung des Analyten zu bewegen.
Ein Verfahren zum Ausbilden eines Sensors, wie oben beschrieben, umfasst das Ausbilden zumindest einer Arbeitselektrode auf einem ersten Substrat und das Ausbilden zumindest einer Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode auf einem zweiten Substrat. Eine Abstandshalterschicht wird auf entweder dem ersten oder dem zweiten Substrat angeordnet. Die Abstandshalterschicht definiert einen Kanal, in dem eine Probe gezogen und gehalten werden kann, wenn der Sensor komplettiert ist. Ein Redoxmediator und/oder ein zweites Elektronenübertragungsmittel sind auf dem ersten oder zweiten Substrat in einem Bereich angeordnet, der in dem Kanal freiliegen wird, wenn der Sensor komplettiert ist. Das erste und das zweite Substrat werden dann zusammengebracht und durch die Abstandshalterschicht mit dem Kanal voneinander im Abstand gehalten, wobei Zugang zu der zumindest einen Arbeitselektrode und der zumindest einen Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode geschaffen wird. Bei einigen Ausführungen sind das erste und das zweite Substrat Teile einer einzelnen Folie oder einer durchgehenden Materialbahn.
Diese und verschiedene andere Merkmale, die die Erfindung charakterisieren, sind mit Ausführlichkeit in den beigefügten Ansprüchen herausgestellt. Für ein besseres Verständnis der Erfindung, ihrer Vorteile und der durch ihre Verwendungen erhaltenen Ziele sollte Bezug genommen werden auf die Zeichnungen und die beigefügte Beschreibung, in der bevorzugte Ausführungen der Erfindung dargestellt und beschrieben sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das Folgende bezieht sich auf die Zeichnungen, wobei gleiche Bezugszeichen und Buchstaben bei allen der verschiedenen Ansichten sich entsprechende Strukturen bezeichnen:
1 zeigt eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform eines elektrochemischen Sensors gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, der eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die sich gegenüber liegen, aufweist;
2 zeigt eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform eines elektrochemischen Sensors gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, der eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die in derselben Ebene liegen, aufweist;
3 zeigt eine schematische Ansicht einer dritten Ausführungsform eines elektrochemischen Sensors gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, der eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die sich gegenüber liegen, aufweist und eine vergrößerte Probenkammer besitzt.
4 zeigt eine nicht maßstabsgetreue seitliche Schnittzeichnung eines Teils des Sensors der 1 oder 3, die die relativen Positionen des Redoxmediators, der Probenkammer und der Elektroden zeigt;
5 zeigt eine Aufsicht auf eine Ausführungsform eines elektrochemischen Sensors gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, wobei dieser Sensor mehrere Arbeitselektroden aufweist;
6 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur Messung eines Analyten gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, die eine Vorrichtung zur Probenahme und den Sensor aus der 4 aufweist;
7 zeigt eine graphische Darstellung der Ladung, die benötigt wird, um eine bekannte Menge an Glucose in einer gepufferten Lösung eines Elektrolyten (ausgefüllte Kreise) oder einer Serumlösung (offene Kreise) unter Verwendung des Sensors aus der 1 mit Glucoseoxidase als zweitem Elektronenübertragungsmittel elektrisch zu oxidieren;
8 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen Glucosekonzentrationen für die Daten der 7 (nur gepufferte Lösungen) mit Eichkurven, die so berechnet wurden, dass sie den Mittelwerten angepasst waren. Eine lineare Eichkurve wurde für die Konzentrationen von 10 bis 20 mM berechnet, und eine polynomische Eichkurve zweiter Ordnung wurde für die Konzentrationen von 0 bis 10 mM berechnet;
9 zeigt ein klinisches Diagramm vom Clarke-Typ zur Analyse der klinischen Relevanz der Glucosemessungen in der 7;
10 zeigt eine graphische Darstellung der Ladung, die benötigt wird, um eine bekannte Menge an Glucose in einer gepufferten Elektrolytlösung mittels des Sensors aus der 1 mit Glucosedehydrogenase als zweitem Elektronenübertragungsmittel elektrisch zu oxidieren;
die 11A, 11B und 11C zeigen Aufsichten auf drei Konfigurationen für überlappende Arbeits- und Gegenelektroden gemäß der vorliegenden Erfindung;
die 12A und 12B zeigen Querschnittsansichten einer Ausführungsform eines Elektrodenpaars der vorliegenden Erfindung, das unter Verwendung einer Ausnehmung in einem Basismaterial gebildet wurde;
die 13A und 13B zeigen Querschnittsansichten einer noch weiteren Ausführungsform eines Elektrodenpaars der vorliegenden Erfindung, das in einer Ausnehmung in einem Basismaterial gebildet wurde;
die 14A und 14B zeigen Querschnittsansichten einer weiteren Ausführungsform eines Elektrodenpaars der vorliegenden Erfindung, das unter Verwendung einer Ausnehmung in einem Basismaterial und eines Sorbensmaterials gebildet wurde;
15 zeigt eine graphische Darstellung der von einem Sensor mit einem diffundierbaren Redoxmediator gelieferten Ladung über die Zeit für verschiedene Konzentrationen an Glucose;
16 zeigt eine graphische Darstellung an von einem Sensor mit einem diffundierbaren Redoxmediator gelieferter Ladung für verschiedene Glucose-Konzentrationen;
17 zeigt eine graphische Darstellung an von Sensoren mit verschiedenen Mengen an diffundierbaren Redoxmediator gelieferter Ladung über die Zeit;
18A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer fünften Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
18B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 18A;
18C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 18A und 18B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 18B und dem ersten Film von 18A;
19A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer sechsten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
19B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 19A;
19C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 19A und 19B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 18B und dem ersten Film von 19A;
20A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer siebten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
20B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 20A;
20C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 20A und 20B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 20B und dem ersten Film von 20A;
21A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer achten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
21B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 21A;
21C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 21A und 21B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 21B und dem ersten Film von 21A;
22A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer neunten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
22B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 22A;
22C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 22A und 22B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 22B und dem ersten Film von 22A;
23A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer zehnten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
23B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 23A;
23C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 23A und 23B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 23B und dem ersten Film von 23A;
24A zeigt eine Aufsicht eines ersten Films mit einer Arbeitselektrode zur Verwendung in einer elften Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
24B zeigt eine Aufsicht eines Abstandshalters zur Anordnung auf den ersten Film von 24A;
24C zeigt eine Bodenansicht eines zweiten Films (invertiert bezüglich der 24A und 24B) mit Gegenelektroden zur Anordnung über den Abstandshalter von 24B und dem ersten Film von 24A;
25 zeigt eine Aufsicht einer zwölften Ausführung eines elektrochemischen Sensors gemäß der Erfindung;
26 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführung einer integrierten Probennahme- und Sensorvorrichtung;
27 zeigt eine Querschnittsansicht einer dreizehnten Ausführung eines Sensors gemäß der Erfindung;
28 zeigt eine graphische Darstellung, die Messungen einer Analytenkonzentration in Blutproben vergleicht, die von einem Arm eines Subjekts gesammelt wurden, die von einem Sensor der Erfindung gemacht wurden, mit solchen, die durch einen Standardbluttest bestimmt wurden;
29 zeigt eine graphische Darstellung, die Messungen einer Analytenkonzentration in Blutproben vergleicht, die von einem Finger eines Subjekts gesammelt wurden, die von einem Sensor der Erfindung gemacht wurden, mit solchen, die durch einen Standardbluttest bestimmt wurden;
30 zeigt eine graphische Darstellung, die die Messungen von der Konzentration eines Analyten in venösen Proben vergleicht, die von einem Sensor der Erfindung gemacht wurden, mit solchen, die durch einen Standardbluttest bestimmt wurden;
31A zeigt eine Aufsicht einer Ausführung einer Folie von Sensorkomponenten gemäß der Erfindung;
31B zeigt eine Aufsicht einer weiteren Ausführung einer Folie von Sensorkomponenten gemäß der Erfindung und
32 zeigt eine Querschnittsansicht gesehen von innerhalb des Messgeräts zu einem Sensor der Erfindung, der in einem Messgerät angeordnet ist.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Wenn die folgenden Definitionen hier verwendet werden, definieren sie den folgenden Begriff:
Ein "luftoxidierbarer Mediator" ist ein Redoxmediator, der durch Luft oxidiert wird, und zwar vorzugsweise so, dass sich wenigstens 90% des Mediators nach der Lagerung an Luft entweder als Feststoff oder als eine Flüssigkeit über einen Zeitraum von z. B. einem Monat oder weniger, vorzugsweise einer Woche oder weniger, und noch bevorzugter einem Tag oder weniger, in einem oxidierten Zustand befinden.
"Amperometrie" umfaßt Steady-State-Amperometrie, Chronoamperometrie und Cottrell-Typ-Messungen.
Eine "biologische Flüssigkeit" ist eine beliebige Körperflüssigkeit, in der der Analyt gemessen werden kann, beispielsweise Blut, Interstitialflüssigkeit, Hautflüssigkeit, Schweiß und Tränen.
Der Begriff "Blut" umfasst im Kontext der Erfindung Vollblut und seine zellfreien Bestandteile, nämlich Plasma und Serum.
"Coulometrie" ist die Bestimmung der Ladung, die bei der vollständigen oder nahezu vollständigen Elektrolyse des Analyten übertritt oder hochgerechnet übertritt, und zwar entweder direkt an der Elektrode oder über ein oder mehrere Elektronenübertragungsmittel. Die Ladung wird über die Messung der Ladung bestimmt, die während der teilweisen oder nahezu vollständigen Elektrolyse des Analyten übertritt, oder, häufiger, durch mehrere Messungen eines während der Elektrolyse abnehmenden Stroms und der verstrichenen Zeit. Der abnehmende Strom resultiert aus der Abnahme der Konzentration der elektrolysierten Spezies, die durch die Elektrolyse verursacht wird.
Eine "Gegenelektrode" bezieht sich auf eine oder mehrere Elektroden, die mit der Arbeitselektrode gepaart ist, und durch die ein elektrochemischer Strom fließt, der bezüglich seiner Größe dem Strom, der durch die Arbeitselektrode fließt, gleich ist und das entgegengesetzte Vorzeichen hat. Der Begriff "Gegenelektrode" soll Gegenelektroden einschließen, die auch als Bezugselektroden fungieren (d. h. eine Gegen-/ Bezugselektrode), sofern die Beschreibung nicht angibt, dass eine "Gegenelektrode" eine Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode ausschließt.
Ein "effektiver Diffusionskoeffizient" ist der Diffusionskoeffizient, der den Transport einer Substanz charakterisiert, z. B. eines Analyten, eines Enzyms oder eines Redoxmediators, in das Volumen zwischen den Elektroden der elektrochemischen Zelle. In zumindest einigen Fällen kann das Zellvolumen durch mehr als ein Medium besetzt sein (z. B. der Probenflüssigkeit und einem Polymerfilm). Die Diffusion einer Substanz durch jedes Medium kann bei einer unterschiedlichen Geschwindigkeit geschehen. Der effektive Diffusionskoeffizient entspricht einer Diffusionsgeschwindigkeit durch dieses Mehr-Mediumvolumen und ist typischerweise anders als der Diffusionskoeffizient für die Substanz in einer Zelle, die nur mit der Probenflüssigkeit gefüllt ist.
Ein "elektrochemischer" Sensor ist eine Vorrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie die Anwesenheit eines Analyten nachweist und/oder die Konzentration eines Analyten misst, und zwar über elektrochemische Oxidations- und Reduktionsreaktionen. Diese Reaktionen werden in ein elektrisches Signal umgewandelt, das mit der Menge oder der Konzentration des Analyten korreliert werden kann.
"Elektrolyse" ist die Elektrooxidation oder Elektroreduktion einer Verbindung entweder direkt an einer Elektrode oder über ein oder mehrere Elektronen-Übertragungsmittel (z. B. Redoxmediatoren und/oder Enzyme).
Der Begriff "sich gegenüber liegende Elektroden" bezieht sich auf eine Konfiguration der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, bei der die Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode ungefähr gegenüber einer Oberfläche der Gegenelektrode angeordnet ist. In zumindest einigen Fällen ist die Entfernung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode geringer als die Breite der Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode.
Eine Verbindung ist auf einer Oberfläche "immobilisiert", wenn sie auf der Oberfläche gefangen oder chemisch gebunden ist.
Eine "Anzeigeelektrode" umfaßt eine oder mehrere Elektroden, die eine teilweise oder vollständige Befüllung einer Probenkammer und/oder Messzone detektieren.
Eine "Schicht" umfaßt eine oder mehrere Schichten.
Die "Messzone" ist hier als ein Bereich der Probenkammer definiert, dessen Größe so bemessen ist, dass er nur denjenigen Teil der Probe enthält, der während der Messung des Analyten analysiert wird.
Eine "nicht-diffundierbare", "nicht-auslaugbare" oder "nicht-freisetzbare" Verbindung ist eine Verbindung, die während der Dauer der Messung des Analyten im wesentlichen nicht von der Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode weg diffundiert.
Das "Potential der Gegen-/Bezugselektrode" ist das halbe Zellenpotential der Bezugselektrode oder Gegen-/Bezugselektrode der Zelle, wenn die Lösung in der Zelle eine 0,1 M Natriumchlorid-Lösung bei pH 7 ist.
"Potentiometrie" und "Chronopotentiometrie" beziehen sich auf das Durchführen einer potentiometrischen Messung an einem oder mehreren Zeitpunkten.
Ein "Redoxmediator" ist ein Elektronenübertragungsmittel für die Übertragung von Elektronen zwischen dem Analyten und der Arbeitselektrode, und zwar entweder direkt oder über ein zweites Elektronenübertragungsmittel.
Eine "Bezugselektrode" umfaßt eine Bezugselektrode, die auch als eine Gegenelektrode funktioniert (d. h. eine Gegen-/Bezugselektrode) sofern die Beschreibung nicht angibt, dass eine "Bezugselektrode" eine Gegen-/Bezugselektrode ausschließt.
Ein "zweites Elektronenübertragungsmittel" ist ein Molekül, das Elektronen zwischen dem Redoxmediator und dem Analyten überträgt.
"Sorbensmaterial" ist ein Material, das eine flüssige Probe einsaugt, zurück hält oder von ihr benetzt wird, und das typischerweise die Diffusion des Analyten zur Elektrode im wesentlichen nicht verhindert.
Eine "Oberfläche in der Probenkammer" umfaßt eine Oberfläche einer Arbeitselektrode, Gegenelektrode, Gegen-/Bezugselektrode, Bezugselektrode, Anzeigeelektrode, einen Abstandshalter oder irgendeine andere Oberfläche, die die Probenkammer begrenzt.
Eine "Arbeitselektrode" ist eine Elektrode, an der ein Analyt elektrooxidiert oder elektroreduziert wird, und zwar mit oder ohne Mitwirkung eines Redoxmediators.
Eine "Arbeitsoberfläche" ist derjenige Teil der Arbeitselektrode, der mit dem Redoxmediator beschichtet ist und für eine Exposition gegen die Probe konfiguriert ist, oder, wenn der Redoxmediator diffundierbar ist, ist eine "Arbeitsoberfläche" der Abschnitt der Arbeitselektrode, der der Probe ausgesetzt ist.
Die Sensoren der vorliegenden Erfindung für kleine Volumina von Analyten in vitro sind so konstruiert, dass sie die Konzentration eines Analyten in einem Teil einer Probe messen, die ein Volumen von weniger als ungefähr 1 μL, vorzugsweise weniger als ungefähr 0,5 μL, noch bevorzugter von weniger als 0,25 μL und am bevorzugtesten von weniger als ungefähr 0,1 μL hat. Der interessierende Analyt wird typischerweise in einer Lösung oder einer biologischen Flüssigkeit, beispielsweise Blut oder Serum, bereit gestellt. Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen im Allgemeinen und die 1 bis 4 im Besonderen enthält ein erfindungsgemäßer elektrochemischer Sensor 20 für kleine Volumina im Allgemeinen eine Arbeitselektrode 22, eine Gegenelektrode (oder Gegen-/Bezugselektrode) 24 und eine Probenkammer 26 (siehe 4). Die Probenkammer 26 ist so konfiguriert, dass, wenn eine Probe in der Kammer bereit gestellt wird, die Probe sich in elektrolytischem Kontakt mit sowohl der Arbeitselektrode 22 als auch der Gegenelektrode 24 befindet. Das macht es möglich, dass ein elektrischer Strom zwischen den Elektroden fließt und die Elektrolyse (Elektrooxidation oder Elektroreduktion) des Analyten bewirkt.
Arbeitselektrode
Die Arbeitselektrode 22 kann aus einem geformten Verbundmaterial aus Kohlenstofffaser bestehen, oder sie kann aus einem inerten, nicht-leitenden Basismaterial, beispielsweise einem Polyester, bestehen, auf dem eine geeignete leitende Schicht abgelagert ist. Die leitende Schicht sollte einen relativ niedrigen elektrischen Widerstand aufweisen, und ist typischerweise während des Einsatzes elektrochemisch inert über den Potentialbereich des Sensors. Zu geeigneten Leitern gehören Gold, Kohlenstoff, Platin, Rutheniumdioxid, Palladium und leitfähige Epoxies, wie z. B. ECCOCOAT CT5079-3 Carbon-Filled Conductive Epoxy Coating (erhältlich von W. R. Grace Company, Woburn, Massachusetts), sowie andere, nicht-korrodierende Materialien, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Elektrode (z. B. die Leiterschicht) wird mittels Verfahren wie einer Dampfabscheidung oder eines Druckens auf der Oberfläche des inerten Materials abgelagert.
Ein Flachstecker 23 kann am Ende der Arbeitselektrode 22 für eine leichte Verbindung der Elektrode mit äußeren elektronischen Vorrichtungen (nicht gezeigt), wie einer Spannungsquelle oder einer Ausrüstung für die Strommessung, bereit gestellt sein. Es können andere bekannte Verfahren oder Strukturen (wie z. B. Kontaktflächen) zur Verbindung der Arbeitselektrode 22 mit der äußeren elektronischen Vorrichtung verwendet werden.
Um zu verhindern, dass elektrochemische Reaktionen an Abschnitten der Arbeitselektrode auftreten, die nicht durch den Mediator beschichtet sind, wenn ein nicht-auslaugbarer Mediator verwendet wird, kann ein Dielektrikum 40 auf die Elektrode über, unter oder den Bereich mit dem Redoxmediator umgebend angeordnet werden, wie in 4 gezeigt. Geeignete dielektrische Materialien umfassen Wachse und nicht-leitende organische Polymere, wie z. B. Polyethylen. Das Dielektrikum 40 kann auch einen Abschnitt des Redoxmediators auf der Elektrode bedecken. Der bedeckte Abschnitt des Redoxmediators wird nicht die Probe kontaktieren, und daher wird er nicht ein Teil der Arbeitsoberfläche der Elektrode sein.
Messchemie
Zusätzlich zu der Arbeitselektrode 22 werden Messchemiematerialien in der Probenkammer 26 für die Analyse des Analyten bereitgestellt. Diese Messchemie umfaßt vorzugsweise einen Redoxmediator und einen zweiten Elektronenübertragungsmediator, obwohl in einigen Fällen der eine oder andere alleine verwendet werden kann. Der Redoxmediator und das zweite Elektronenübertragungsmittel kann unabhängig diffundierbar oder nicht-auslaugbar (d. h. nicht-diffundierbar) sein, derart, dass einer oder beide diffundierbar oder nicht-auslaugbar sein können. Das Anordnen der Sensorchemiekomponenten kann davon abhängen, ob sie diffundierbar oder nicht-auslaugbar sind. Zum Beispiel bilden typischerweise (eine) nicht-auslaugbare und/oder diffundierbare Komponente(n) eine Messschicht auf der Arbeitselektrode. Alternativ können eine oder mehrere diffundierbare Komponenten auf einer beliebigen Oberfläche in der Probenkammer vor der Einbringung der Probe angeordnet werden. Als ein weiteres Beispiel können eine oder mehrere diffundierbare Komponente(n) in der Probe vor der Einbringung der Probe in den Sensor angeordnet werden.
Wenn der Redoxmediator nicht-auslaugbar ist, dann ist der nicht-auslaugbare Redoxmediator typischerweise auf der Arbeitselektrode 22 als eine Messschicht 32 angeordnet. Bei einer Ausführung mit einem Redoxmediator und einem zweiten Elektronenübertragungsmittel sind dann, wenn der Redoxmediator und das zweite Elektronenübertragungsmittel beide nicht-auslaugbar sind, beide der nicht-auslaugbaren Komponenten auf der Arbeitselektrode 22 als eine Messschicht 32 angeordnet.
Wenn zum Beispiel das zweite Elektronenübertragungsmittel diffundierbar ist, und der Redoxmediator nicht-auslaugbar ist, dann ist zumindest der Redoxmediator auf der Arbeitselektrode 22 als ein Messschicht 32 angeordnet. Das zweite diffundierbare Elektronenübertragungsmittel muß nicht auf einer Messschicht der Arbeitselektrode angeordnet sein, sondern kann auf einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet sein, einschließlich in der Redoxmediator-Messschicht oder kann in der Probe angeordnet sein. Wenn der Redoxmediator diffundierbar ist, dann kann der Redoxmediator auf einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet sein, oder er kann in der Probe angeordnet sein.
Wenn sowohl der Redoxmediator als auch das zweite Elektronenübertragungsmittel diffundierbar sind, dann können die diffundierbaren Komponenten unabhängig voneinander oder gemeinsam auf einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet und/oder in der Probe plaziert werden (d. h. jede diffundierbare Komponente muß nicht auf der gleichen Oberfläche der Probenkammer angeordnet oder in der Probe plaziert sein).
Der Redoxmediator, egal ob er diffundierbar oder nicht-auslaugbar ist, vermittelt einen Strom zwischen der Arbeitselektrode 22 und dem Analyten und ermöglicht die elektrochemische Analyse von Molekülen, die für eine direkte elektrochemische Reaktion an einer Elektrode nicht geeignet sein können. Der Mediator funktioniert als ein Elektronenübertragungsmittel zwischen der Elektrode und dem Analyten.
Bei einer Ausführung sind der Redoxmediator und das zweite Elektronenübertragungsmittel diffundierbar und auf der gleichen Oberfläche der Probenkammer angeordnet, wie z. B. auf der Arbeitselektrode. Bei dieser gleichen Vene können beide an z. B. der Gegenelektrode, Gegen-/Bezugselektrode, Bezugselektrode oder Anzeigeelektrode angeordnet sein. In anderen Fällen sind der Redoxmediator und das zweite Elektronenübertragungsmittel beide diffundierbar und unabhängig an einer Oberfläche der Probenkammer und/oder in der Probe angeordnet. Zum Beispiel kann der Redoxmediator an der Arbeitselektrode angeordnet sein, während das zweite Elektronenübertragungsmittel an einer beliebigen Oberfläche außer der Arbeitselektrode angeordnet ist, oder in der Probe angeordnet ist. Entsprechend ist die umgekehrte Situation auch eine geeignete Ausführung, bei der das zweite Elektronenübertragungsmittel an der Arbeitselektrode angeordnet ist, und der Redoxmediator auf einer beliebigen Oberfläche außer der Arbeitselektrode angeordnet oder in der Probe angeordnet. Als ein weiteres Beispiel kann der Redoxmediator an der Gegenelektrode angeordnet sein, und das zweite Elektronenübertragungsmittel ist auf einer beliebigen Oberfläche außer der Gegenelektrode angeordnet, oder ist in der Probe angeordnet. Die umgekehrte Situation ist auch geeignet.
Der diffundierbare Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel können schnell in die Probe diffundieren, oder eine Diffusion kann über eine Zeitdauer passieren. Entsprechend können sich der diffundierbare Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel zuerst von der Oberfläche lösen, auf der sie als ein Feststoff aufgetragen wurden, und dann können der diffundierbare Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel in die Probe diffundieren, entweder schnell oder über eine Zeitdauer. Wenn der Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel über eine Zeitdauer diffundieren, kann ein Benutzer gleitet werden, eine Zeitdauer vor dem Messen der Konzentra tion des Analyten zu warten, um eine Diffusion des Redoxmediators und/oder des zweiten Elektronenübertragungsmittels zu ermöglichen.
Hintergrundsignal
Bei zumindest einigen Fällen kann ein diffundierbarer Redoxmediator von der Arbeitselektrode zu der Gegenelektrode sich hin- und herbewegen, selbst in der Abwesenheit eines Analyten. Das erzeugt typischerweise ein Hintergrundsignal. Für coulometrische Messungen wird dieses Hintergrundsignal hier als "Q_Back" bezeichnet. Das Hintergrundsignal entspricht der Ladung, die bei einer elektrochemischen Untersuchung in der Abwesenheit des Analyten fließt. Das Hintergrundsignal hat typischerweise sowohl eine schwankende Komponente als auch eine gleichbleibende Komponente. Zumindest ein Teil der schwankenden Komponente kann zum Beispiel von der Ausbildung eines Konzentrationsgradienten des Mediators in einem bestimmten Oxidationszustand herrühren. Zumindest ein Anteil der gleichbleibenden Komponente kann zum Beispiel von dem Redoxmediator stammen, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode hin- und herbewegt. Das Hin- und Herbewegen bezieht sich auf Redoxmediator, der bei der Arbeitselektrode elektrooxidiert (oder elektroreduziert) wird, und dann bei der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode elektroreduziert (oder elektrooxidiert) wird, wodurch der Redoxmediator bereitgemacht wird, wieder bei der Arbeitselektrode elektrooxidiert (oder elektroreduziert) zu werden, so dass der Redoxmediator sich nicht zyklisch zwischen Elektrooxidation und Elektroreduktion bewegt.
Die Menge an Hin- und Herbewegen des Redoxmediators und daher die gleichbleibende Komponente des Hintergrundsignals variiert mit zum Beispiel dem effektiven Diffusionskoeffizienten des Redoxmediators, der Viskosität der Probe, der Temperatur der Probe, den Abmessungen der elektrochemischen Zelle, dem Abstand zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- und/oder Gegen-/Bezugselektrode und dem Winkel zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- und/oder Gegen-/Bezugselektrode.
In einigen Fällen kann die gleichbleibende Komponente des Hintergrundsignals ein Rauschen enthalten, das mit (a) einer Variabilität bei zum Beispiel der Temperatur der Probe, der Probenviskosität oder irgendeinem anderen Parameter, von dem das Hintergrundsignal während der Dauer der Untersuchung abhängt, oder (b) Defekten in der elektrochemischen Zelle, wie zum Beispiel einer ungleichförmigen Trennung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- und/oder Gegen-/Bezugselektrode, Änderungen in der Elektrodengeometrie oder Vorsprüngen von der Arbeitselektrode, der Gegenelektrode und/oder der Gegen-/Bezugselektrode einhergehen.
Obwohl die gleichbleibende Komponente des Hintergrundsignals reproduzierbar sein kann, ist jedes Rauschen inhärent nicht reproduzierbar. Als eine Folge beeinflusst das Rauschen schädlicherweise die Genauigkeit. In einigen Fällen stehen das Hintergrundsignal und das Rauschen miteinander in Beziehung. Als eine Folge kann das Rauschen, und der Fehler, den es einführt, reduziert werden, indem das Hintergrundsignal reduziert wird. Zum Beispiel wird das Reduzieren des Hin- und Herbewegens des Mediators zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode wahrscheinlich das Rauschen reduzieren, das mit Änderungen in der Probentemperatur und der Viskosität verbunden ist, was die Diffusion des Redoxmediators beeinflusst.
Um somit die Genauigkeit der Messungen zu verbessern und um den Fehler bei den Messungen in solchen Fällen kleiner zu machen, wenn das Vermindern eines Hintergrundsignals auch das Rauschen vermindert, ist ein Hintergrundsignal mit einem nicht allzugroßen Wert bis zu einem Wert von nahezu Null wünschenswert. Bei zumindest einigen Fällen ist der Sensor derart aufgebaut, dass das Hintergrundsignal maximal das Fünffache der Größe eines Signals ist, das durch Elektrolyse eine Menge eines Analyten erzeugt wird. Vorzugsweise ist das Hintergrundsignal maximal 200%, 100%, 50%, 25%, 10% oder 5% des Signals, des durch die Elektrolyse des Analyten erzeugt wird. In dem Fall von Amperometrie kann dieser Vergleich gemacht werden, indem das Verhältnis des Stroms von dem Hin- und Herbewegen des Redoxmediators zu dem Strom bestimmt wird, der durch die Elektrolyse des Analyten erzeugt wird. In dem Fall von Potentiometrie kann dieser Vergleich gemacht werden, indem die Potentialmessung von dem Hin- und Herbewegen des Redoxmediators und die Messung des Potentials bestimmt wird, das durch die Elektrolyse des Analyten erzeugt wird. In dem Fall von Coulometrie kann dieser Vergleich gemacht werden, indem die Ladung, die bei der Arbeitselektrode durch das Hin- und Herbewegen des Redoxmediators betragen wird, und die Ladung bestimmt wird, die bei der Arbeitselektrode durch die Elektrolyse des Analyten übertragen wird.
Die Größe des Hintergrundsignals kann mit einer vorbestimmten Menge des Analyten verglichen werden. Die vorbestimmte Menge des Analyten in einer Probe kann z. B. eine erwartete oder mittlere molare Menge des Analyten sein. Die erwartete oder mittlere molare Menge des Analyten kann z. B. als der Mittelwert für Benutzer oder Individuen; ein Mittelwert für eine Population; ein Maximum, Minimum oder ein Mittelwert eines normalen physiologischen Bereichs; ein Maximum oder ein Minimum eines physiologischen Werts einer Population; ein Maximum oder ein Minimum eines physiologischen Werts für Benutzer oder Individuen; eine mittlere, maximale oder minimale Abweichung außerhalb eines normalen physiologischen Bereichwertes für Benutzer, Individuen oder eine Population; eine Abweichung über oder unter einem Mittelwert für eine Population; oder eine mittlere, maximale oder minimale Abweichung über oder unter einem mittleren normalen physiologischen Wert für Benutzer oder Individuen bestimmt werden. Eine Population kann zum Beispiel durch Gesundheit, Geschlecht oder Alter festgelegt werden, wie z. B. eine Population normaler Erwachsener, Kinder oder Neugeborener. Wenn eine Population durch Gesundheit festgelegt wird, kann die Population Leute enthalten, denen eine bestimmte Bedingung fehlt, oder alternativ, die einen bestimmten Zustand haben, wie z. B. Diabetes. Bezugsintervalle, die Mittel- oder Erwartungswerten entsprechen, wie z. B. solche, die in Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Appendix (S. 2175–2217) (2. Auflage, Car. A. Burtis und Edwart R. Ashwood, Hrsg., W. D. Saunders Co., Philadelphia 1994) angegeben sind, können als Richtlinien verwendet werden, aber eine physikalische Untersuchung oder eine chemische Blutbestimmung durch einen ausgebildeten Mediziner kann auch verwendet werden, um einen Mittel- oder Erwartungswert für ein Individuum zu bestimmen. Zum Beispiel kann ein Erwachsener Glucose in einer Konzentration von 65 bis 95 mg/dl in Vollblut oder L-Lactat in einer Konzentration von 8,1 bis 15,3 mg/dl in venösem Vollblut nach Fasten gemäß Tietz Textbook of Clinical Chemistry haben. Eine mittlere normale physiologische Konzentration für einen Erwachsenen kann zum Beispiel dann 80 mg/dl für Glucose oder 12,7 mg/dl für Lactat entsprechen. Andere Beispiele umfassen eine Person mit im Jugendalter anfangender Diabetes, noch guter glycämischer Kontrolle und einer Glucose-Konzentration zwischen ungefähr 50 mg/dl und 400 mg/dl, wodurch man eine mittlere molare Menge von 225 mg/dl hat. In einem anderen Fall kann ein nicht-diabetischer Erwachsener eine Glucose-Konzentration zwischen ungefähr 80 mg/dl (nach Fasten) und 140 mg/dl (nach Verbrauch von Lebensmitteln) haben, wodurch man eine mittlere molare Menge von 110 mg/dl hat.
Zusätzliche Analyten, die bestimmt werden können, umfassen zum Beispiel Acetylcholin, Amylase, Bilirubin, Cholesterin, chorionisches Gonadotropin, Kreatinkinase (z. B. CK-MB), Kreatin, DNA, Fructosamin, Glucose, Glutamin, Wachstumshormone, Hormone, Ketone, Lactat, Peroxid, prostataspezifisches Antigen, Prothrombin, RNA, Thyroid-stimulierende Hormone und Troponin. Die Konzentration von Arzneimitteln, wie z. B. Antibiotika (z. B. Gentamicin, Vancomycin und dergleichen), Digitoxin, Digoxin, Drogenmißbrauch, Theophyllin und Warfarin können auch bestimmt werden.
Um einen Sensor mit einem bestimmten Verhältnis vom Hintergrundsignal zum Analytensignal von der Elektrolyse zu konstruieren, können verschiedene Parameter betreffend den Strom und/oder die Ladung von dem Hintergrundsignal des sich hin- und herbewegenden Redoxmediators und/oder von dem Signal, das durch Elektrolyse des Analyten erzeugt wird, in Erwägung gezogen werden und gewählt werden, um ein gewünschtes Verhältnis zu erhalten. Typischerweise ist das Signal, das für eine coulometrische Untersuchung bestimmt wird, die Ladung; wohingegen das Signal, das für eine amperometrische Untersuchung bestimmt wird, der Strom zu der Zeit ist, wenn die Messung gemacht wird. Weil der Strom und die Ladung von verschiedenen Parametern abhängen, kann das gewünschte Verhältnis für das Hintergrundsignal, das durch das sich Hin- und Herbewegen des Redoxmediators erzeugt wird, zu dem Signal, das durch die Elektrolyse des Analyten erzeugt wird, durch eine Vielfalt von Sensorkonfigurationen und Verfahren zum Betrieben eines Sensors erreicht werden.
Regeln des Hintergrundsignals
ein Verfahren, das Hintergrundsignal zu regeln, umfaßt das Verwenden eines Redoxmediators, der a) die Analyten bei dem Halbwellenpotential oxidiert, wenn es durch cyclische Voltametrie in 0,1 M Natriumchlorid bei pH 7 gemessen wird, das nicht mehr als ungefähr +100 mV relativ zu dem Potential einer Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode beträgt, oder b) den Analyten bei einem Halbwellenpotential reduziert, wie es durch cyclische Voltametrie in 0,1 M Natriumchlorid bei pH gemessen wird, das nicht weniger als ungefähr –100 mV relativ zu dem Potential einer Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode beträgt. Eine geeignete Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode (z. B. eine Silber/Silberchlorid-Elektrode) kann gewählt werden. Vorzugsweise a) oxidiert der Redoxmediator den Analyten bei dem Halbwellenpotential, wie es durch cyclische Voltametrie in 0,1 M Natriumchlorid bei pH 7 gemessen wird, das nicht mehr als ungefähr +50 mV, +25 mV, 0 mV –25 mV, –50 mV, –100 mV oder –150 mV relativ zu dem Potential der Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode beträgt, oder b) reduziert der Redoxmediator den Analyten bei einem Halbwellenpotential, wie es durch cyclische Voltametrie in 0,1 M Natriumchlorid bei pH 7 gemessen wird, das nicht weniger als ungefähr –50 mV, –25 mV, 0 mV, +25 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV oder +200 mV relativ zu dem Potential der Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode beträgt. Alternativ wird in dem Fall der Reduktion des Redoxmediators durch die Gegenelektrode der Sensor bei einem anliegenden Potential von nicht mehr als ungefähr +100 mV, +50 mV, +25 mV, 0 mV, –25 mV, –50 mV, –100 mV oder –150 mV zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode betrieben. In dem Fall der Oxidation des Redoxmediators bei der Gegenelektrode wird der Sensor bei einem anliegenden Potential von nicht weniger als ungefähr –100 mV, –50 mV, –25 mV, 0 mV, +25 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV oder +200 mV zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode betrieben.
Ein weiteres Verfahren umfaßt das Regeln des anliegenden Potentials derart, dass für eine elektrooxidative Untersuchung der Redoxmediator nicht ohne weiteres an der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode reduziert oder für eine elektroreduzierende Untersuchung der Redoxmediator nicht ohne weiteres an der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode oxidiert. Das kann zum Beispiel bei einer elektrooxidativen Untersuchung erreicht werden, indem ein Sensor mit einem diffundierbaren Redoxmediator mit einem Potential relativ zu einer Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode verwendet wird, die bezüglich dem Potential der Gegenelektrode negativ ist (relativ zu einer Bezugselektrode) oder der Gegen-/Bezugselektrode. Das Potential (relativ zu einer Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode) der Arbeitselektrode wird so gewählt, dass es positiv bezüglich des Redoxmediators ist und negativ bezüglich der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode sein kann, so dass der Redoxmediator an der Arbeitselektrode oxidiert wird. Wenn zum Beispiel die Elektrooxidation eines Analyten durch einen diffundierbaren Redoxmediator mit einem Potential von –200 mV gegenüber der Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode vermittelt wird, und das Potential, bei dem die Arbeitselektrode .... gebracht wird, –150 mV relativ zu der Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode beträgt, dann wird der Redoxmediator bei der Arbeitselektrode im wesentlichen oxidiert und wird den Analyten oxidieren. Wenn ferner etwas von dem oxidierten Redoxmediator die Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode erreicht, wird der Redoxmediator nicht ohne weiteres an der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode reduziert werden, weil der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode gut positiv (d. h. 150 mV) gegenüber dem Potential des Redoxmediators gehalten wird.
Bei einer elektroreduktiven Untersuchung wird ein Sensor mit einem diffundierbaren Redoxmediator mit einem formellen Potential relativ zu einer Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode bereitgestellt, das bezüglich des Potentials der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode positiv ist. Das Potential der Arbeitselektrode relativ zu der Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode wird als negativ bezüglich des Redoxmediators gewählt, und kann positiv bezüglich der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode im Gleichgewicht gehalten werden, so dass der Redoxmediator bei der Arbeitselektrode reduziert wird.
Noch eine weitere Methode des Begrenzens des Hintergrundstroms umfasst, den Redoxmediator zu immobilisieren, wenn er auf die Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode durch zum Beispiel Ausfällung oder Polymerisation reagiert. Zum Beispiel kann der Mediator in dem oxidierten Zustand kationisch sein, aber neutral und weniger in dem reduziertem Zustand löslich sein. Die Reduktion an der Gegen-/Bezugselektrode führt zu der Ausfällung des reduzierten neutralen Mediators an der Gegen-/Bezugselektrode.
Eine weitere Sensorkonfiguration, die zum Regeln des Hintergrundsignals geeignet ist, umfaßt einen Sensor mit einer molaren Menge an Redoxmediator, die stöchiometrisch die gleiche wie oder weniger als eine erwartete oder mittlere molare Menge des Analyten ist. Die erwartete oder mittlere molare Menge des Analyten kann wie bereits oben erläutert bestimmt werden. Die erwartete oder mittlere molare Menge des Analyten kann z. B. als der Mittelwert für Benutzer oder Individuen; ein Mittelwert für eine Population; ein Maximum, Minimum oder ein Mittelwert eines normalen physiologischen Bereichs; ein Maximum oder ein Minimum eines physiologischen Werts einer Population; ein Maximum oder ein Minimum eines physiologischen Werts für Benutzer oder Individuen; eine mittlere, maximale oder minimale Abweichung außerhalb eines normalen physiologischen Bereichwertes für Benutzer, Individuen oder eine Population; eine Abweichung über oder unter einem Mittelwert für eine Population; oder eine mittlere, maximale oder minimale Abweichung über oder unter einem mittleren normalen physiologischen Wert für Benutzer oder Individuen bestimmt werden. Eine Population kann zum Beispiel durch Gesundheit, Geschlecht oder Alter festgelegt werden, wie z. B. eine Population normaler Erwachsener, Kinder oder Neugeborener. Wenn eine Population durch Gesundheit festgelegt wird, kann die Population Leute enthalten, denen eine bestimmte Bedingung fehlt oder alternativ, die einen bestimmten Zustand haben, wie z. B. Diabetes. Bezugsintervalle, die Mittel- oder Erwartungswerte entsprechen, wie z. B. solche, die in Tietz Textbook of Clinical Chemistry, supra angegeben sind, können als Richtlinien verwendet werden, aber eine physikalische Untersuchung oder eine chemische Blutbestimmung kann auch einen Mittel- oder Erwartungswert bestimmen. Zum Beispiel kann die physiologische mittlere molare Menge des Analyten von der Gesundheit oder dem Alter der Person abhängen, von der die Probe erhalten wird. Die Bestimmung liegt in dem Fachwissen eines Durchschnittsfachmanns.
Durch Vermindern der Konzentration des Redoxmediators relativ zu der Konzentration des Analyten wird das Signal, das dem Analyten zuzurechnen ist, relativ zu dem Signal, das dem Hin- und Herbewegen des Redoxmediators zuzurechnen ist, verstärkt. Bei der Implementierung dieses Verfahrens kann die molare Menge des Redoxmediators nicht mehr als 50%, 20%, 10% oder 5% auf einer stöchiometrischen Basis der erwarteten oder mittleren molaren Menge des Analyten sein.
Die Menge an Redoxmediator, die bei einer derartigen Sensorkonfiguration verwendet wird, sollte in einen Bereich fallen. Die obere Grenze des Bereichs kann auf der Basis von zum Beispiel dem akzeptierbaren maximalen Signal aufgrund des Hin- und Herbewegen der Redoxmediators; der Konstruktion der elektrochemischen Zelle einschließlich zum Beispiel den Abmessungen der Zelle und der Position der Elektroden; dem effektiven Diffusionskoeffizienten des Redoxmediators; und der Zeitdauer bestimmt werden, die für die Untersuchung gebraucht wird. Überdies kann das akzeptierbare maximale Signal aufgrund des Hin- und Herbewegens des Redoxmediators von Untersuchung zu Untersuchung als eine Folge von einem oder mehreren Untersuchungsparametern variieren, wie zum Beispiel, ob die Untersuchung dazu gedacht ist, qualitativ, halbqualitativ oder quantitativ zu sein, ob kleine Unterschiede in der Analytenkonzentration als eine Basis zum Modifizieren einer Therapie dienen; und der erwarteten Konzentration des Analyten.
Obwohl es vorteilhaft ist, die Menge an verwendeten Redoxmediator zu minimieren, hat der Bereich der akzeptierbaren Menge an Redoxmediator typischerweise eine untere Grenze. Die minimale Menge an Redoxmediator, die verwendet werden kann, ist die Konzentration an Redoxmediator, die notwendig ist, um die Untersuchung in einer wünschenswerten Messzeitdauer zu erhalten, zum Beispiel nicht mehr als ungefähr 5 Minuten oder nicht mehr als ungefähr 1 Minute. Die für die Durchführung einer Untersuchung erforderliche Zeit hängt zum Beispiel von der Abstand zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode, dem effektiven Diffusionskoeffizienten des Redoxmediators und der Konzentration des Analyten ab. In einigen Fällen, z. B. wenn keine kinetischen Grenzen vorhanden sind, d. h. dass das Hin- und Herbewegen des Redoxmediators nur von der Diffusion abhängt, kann die minimale Konzentration des Redoxmediators durch die folgende Formel bestimmt werden: Cm = (d2CA)/Dmt,wobei C_m die minimale Konzentration des erforderlichen Mediators ist; d der Abstand zwischen einer Arbeitselektrode und einer Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode in einer gegenüberliegenden Anordnung ist; C_A die mittlere Analytenkonzentration in der Probe ist; D_m der effektive Diffusionskoeffizient des Mediators in der Probe ist; und t die gewünschte Messzeit ist.
Wenn zum Beispiel der Abstand zwischen dem sich gegenüberliegenden Elektrodepaar 50 μm beträgt, der zu messende Analyt 5 mM Glucose ist, der effektive Diffusionskoeffizient des Redoxmediators 10^–6 cm²/s beträgt und die wünschenswerte Antwortzeit nicht mehr als ungefähr 1 Minute beträgt, dann beträgt die minimale Konzentration des Redoxmediators 2,08 mM. Unter diesen Bedingungen wird das Hintergrundsignal geringer als das Signal von der Elektrooxidation des Analyten sein.
Noch eine weitere Sensorkonfiguration zum Begrenzen des Hintergrundstroms, der von einem diffundierbaren Redoxmediator erzeugt wird, umfaßt das Vorsehen einer Barriere gegenüber dem Fluss des diffundierbaren Mediators zu der Gegenelektrode. Die Barriere kann zum Beispiel ein Film sein, durch den der Redoxmediator nicht diffundieren kann, oder durch den Redoxmediator langsam diffundiert. Beispiele geeigneter Filme umfassen Polycarbonat, Polyvinylalkohol und regenerierte Cellulose oder Celluloseester-Membranen. Alternativ kann die Barriere geladene oder polare Partikel, Verbindungen oder funktionale Gruppen umfassen, um den Fluss eines geladenen Redoxmediators zu verhindern oder relativ zu dem Fluss eines ladungsneutralen oder weniger geladen Analyten zu vermindern. Wenn der Redoxmediator positiv geladen ist, wie es viele der Osmium-Redoxmediatoren sind, die unten beschrieben sind, kann die Barriere ein positiv geladener oder polarer Film sein, wie z. B. ein methylisiertes Poly(1-vinylimidazol). Wenn der Redoxmediator negativ geladen ist, kann die Barriere eine negativ geladener oder polarer Film sein, wie z. B. Nafion^®. Beispiele geeigneter polarer Matrizes umfassen eine bipolare Membran, eine Membran mit einem kationischen Polymer, das mit einem anionischen Polymer vernetzt ist, und dergleichen. In einigen Fällen reduziert die Barriere die Oxidation oder Reduktion des diffundierbaren Redoxmediators an der Gegenelektrode um zumindest 25%, 50% oder 90%.
Noch eine weitere Sensorkonfiguration zum Begrenzen des Hintergrundstroms umfaßt einen Sensor mit einem Redoxmediator, der leichter an der Arbeitselektrode oxidiert oder reduziert wird, als er an der Gegenelektrode reduziert oder oxidiert wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Redoxmediators an einer Elektrode kann eine Funktion des Materials der Elektrode sein. Zum Beispiel können einige Redoxmediatoren an einer Kohlenstoff-Elektrode schneller reagieren als an einer Ag/AgCl-Elektrode. Eine passende Wahl der Elektroden kann eine Reaktionsgeschwindigkeit an einer Elektrode schaffen, die erheblich langsamer als die Geschwindigkeit an der anderen Elektrode ist. In einigen Fällen ist die Oxidations- oder Reduktionsgeschwindigkeit des diffundierbaren Redoxmediators an der Gegenelektrode im Vergleich zu der Arbeitselektrode um zumindest 25%, 50% oder 90% reduziert. In einigen Fällen wird die Reaktionsgeschwindigkeit für den Redoxmediator an der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode geregelt, indem zum Beispiel ein Material für die Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode gewählt wird, das ein Überpotential oder ein Potential von mehr als das anliegende Potential erfordern würde, um die Reaktionsgeschwindigkeit an der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode zu vergrößern.
Eine weitere Sensorkonfiguration zum Begrenzen des Hintergrundstroms umfaßt Elemente, die zum Reduzieren der Diffusion des Redoxmediators geeignet sind. Die Diffusion kann zum Beispiel vermindert werden, indem ein Redoxmediator mit einem relativ niedrigen Diffusionskoeffizienten verwendet wird, oder indem die Viskosität der Probe in der Messzone vergrößert wird. Bei einer anderen Ausführung kann die Diffusion des Redoxmediators vermindert werden, indem ein Redoxmediator mit einem hohen Molekulargewicht gewählt wird, wie z. B. größer als 5000 Dalton, vorzugsweise größer als 25000 Dalton und weiter vorzugsweise größer als 100000 Dalton.
Redoxmediatoren
Obwohl beliebige organische oder organometallische Redoxspezies als ein Redoxmediator verwendet werden können, ist eine Art eines geeigneten Redoxmediators eine Übergangsmetall-Verbindung oder ein Übergangsmetall-Komplex. Beispiele geeignete Übergangsmetall-Verbindungen oder -Komplexe umfassen Osmium-, Ruthenium-, Eisen- und Cobald-Verbindungen oder -Komplexe. Bei diesen Komplexen wird das Übergangsmetall koordinativ an einen oder mehrere Liganden gebunden. Die Liganden sind typischerweise ein-, zwei-, drei- oder vierzahnig. Die bevorzugtesten Liganden sind heterocycle Stickstoff-Verbindungen, wie z. B. Pyridin- und/oder Imidazol-Derivate. Mehrzahnige Liganden können mehrere Pyridin- und/oder Imidazol-Ringe umfassen. Alternativ können Metallocen-Derivate, wie z. B. Ferrocen verwendet werden.
Geeignete Redoxmediatoren umfassen Osmium- oder Ruthenium-Übergangsmetallkomplexe mit einem oder mehreren Liganden, wobei jeder Ligand einen oder mehrer Stickstoff-haltige Heterocyclen enthält. Beispiele derartiger Liganden umfassen Pyridin- und Imidazol-Ringe und Liganden mit zwei oder mehr Pyridin- und/oder Imidazol-Ringen, wie z. B. 2,2'-Bipyridin; 2,2',6',2''-Terpyridin; 1,10-Phenanthrolin; und Liganden mit den folgenden Strukturen:
und Derivate davon, wobei R₁ und R₂ jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Vinyl, Allyl, Amido, Amino, Vinylketon, Keto oder Schwefel-haltige Gruppen sind.
Der Begriff "Alkyl" umfaßt eine gerade oder verzweigte gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoff-Kette mit zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyisopropyl (1-Methylethyl), Butyl, tert-Butyl (1,1-Dimethylethyl) und dergleichen. Vorzugsweise hat die Kohlenstoff-Kette zwischen 1 und 3 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Alkoxy" umfaßt ein Alkyl, wie oben definiert, das mit dem Rest der Struktur durch ein Sauerstoffatom verbunden ist, wie z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropropoxy (1-Methylethoxy), Butoxy, tert-Butoxy, und dergleichen.
Der Begriff "Alkenyl" umfaßt eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoff-Kette mit zwischen 2 und 6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl und dergleichen. Vorzugsweise hat die Kohlenwasserstoff-Kette zwischen 2 und 3 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Amido" umfaßt Gruppen mit einem Stickstoffatom, das an das Kohlenstoffatom der Carbonyl-Gruppe gebunden ist und Gruppen mit den folgenden Formel aufweist:
wobei R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Alkenyl sind.
Der Begriff "Amino", wie hier verwendet, umfaßt Alkylamino, wie zum Beispiel Methylamino, Diethylamino, N,N-Methylethylamino und dergleichen; Alkoxyalkylamino, wie z. B. N-(Ethoxyethyl)amino, N,N-Di(methoxyethyl)amino, N,N-(Methoxyethyl)-(ethoxyethyl)amino und dergleichen; und Stickstoffhaltige Ringe, wie zum Beispiel Piperidino, Piperazino, Morpholino und dergleichen.
Der Begriff "Vinylketon" umfaßt eine Gruppe mit der Formel:
wobei R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Alkenyl sind.
Der Begriff "Keto" umfaßt eine Gruppe mit der Formel:
wobei R₈ Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Alkenyl ist.
Der Begriff "Schwefel-haltige Gruppe" umfaßt Mercapto, Alkylmercapto (wie zum Beispiel Methylmercapto, Ethylmercapto und dergleichen), Alkoxyalkylmercapto (wie z. B. Methoxyethylmercapto und dergleichen), Alkylsulfoxid (wie z. B. Methylsulfoxid und Propylsulfoxid und dergleichen), Alkoxyalkylsulfoxid (wie z. B. Ethoxyethylsulfoxid und dergleichen), Alkylsulfon (wie zum Beispiel Methylsulfon und Propylsulfon und dergleichen) und Alkoxyalkylsulfon (wie zum Beispiel Methoxyethylsulfon und dergleichen). Vorzugsweise ist die Schwefel-haltige Gruppe eine Mercapto-Gruppe.
Andere geeignete Redoxmediatoren umfassen Osmium- oder Ruthenium-Übergangsmetallkomplexe mit einem oder mehreren Liganden, wobei jeder Ligand einen oder mehrere Stickstoff-haltige Heterocyclen enthält, und jeder schwefelhaltige Heterocyclus ein zweites Heteroatom enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Selen besteht.
Beispiele von Liganden mit einem oder mehreren Stickstoff-haltigen Heterocyclen, bei denen jeder Heterocyclus ein zweites Heteroatom aufweist, umfassen Liganden mit den folgenden Strukturen:
wobei Y₁, Y₂, Y₃ und Y₄ jeweils unabhängig ein Sauerstoff, ein Schwefelatom, ein Selenatom oder ein substituiertes Stickstoffatom mit der Formel NR₉ sind, wobei R₉ Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Amido, Amino, Vinylketon, Keto oder eine Schwefel-haltige Gruppe ist. Die Begriffe "Alkyl", "Alkoxy", "Alkenyl", "Amido", "Amino", "Vinylketon", "Keto", und "Schwefel-haltige Gruppe" sind wie oben definiert.
Geeignete Derivate dieser Liganden umfassen zum Beispiel die Zugabe von funktionalen Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Vinylester- und Amido-Gruppen an eine beliebige der verfügbaren Stellen an dem heterocyclen Ring, einschließlich zum Beispiel an der 4-Position (d. h. para zu Stickstoff) des Pyridin-Rings oder an einem der Stickstoffatome des Imidazol-Rings.
Geeignete Derivate von 2,2'-Bipyridin zur Komplexierung mit dem Osmium-Kation umfassen zum Beispiel Mono-, Di- und Polyalkyl-2,2'-bipyridine, wie z. B. 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin; Mono-, Di- und Polyalkoxy-2,2'-bipyridine wie z. B. 4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin und 2,6'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin; Mono-, Di- und Polyacetamido-2,2'-bipyridine, wie z. B. 4,4'-Di(acetamido)-2,2'-bipyridin; Mono-, Di- und Polyalkylaminoalkoxy-2,2'-bipyridine wie z. B. 4,4'-Di-(N,N-dimethylaminoethoxy)-2,2'-bipyridin und substituierte Mono-, Di- und Polypyrazolyl-2,2'-bipyridine, wie z. B. 4,4'-Dimethoxy-6-(N-pyrazolyl)-2,2'-bipyridin und 4,4'-Dimethoxy-6-(N-pyrazolylmethyl)-2,2'-bipyridin.
Geeignete Derivate von 1,10-Phenanthrolin zur Komplexierung mit dem Osmium-Kation umfassen zum Beispiel Mono-, Di- und Polyalkyl-1,10-phenanthroline, wie z. B. 4,7-Dimethyl-1,10-phenanthrolin und Mono-, Di- und Polyalkoxy-1,10-phenanthroline, wie z. B. 4,7-Dimethoxy-1,10-phenanthrolin und 5-Methoxy-1,10-phenanthrolin.
Geeignete Derivate für 2,2':6',2''-Terpyridin umfassen zum Beispiel Mono-, Di-, Tri- und Polyalkyl-2,2':6',2''-terpyridine, wie z. B. 4,4',4''-Trimethyl-2,2':6',2''-terpyridin, 4,4',4''-Triethyl-2,2':6',2''-terpyridin, und Mono-, Di-, Tri- und Polyalkoxy-2,2':6',2''-terpyridine wie z. B. 4,4',4''-Trimethyl-2,2':6',2''-terpyridin und 4'-Methoxy-2,2':6',2''-terpyridin und Mono-, Di-, Tri- und Polyamino-2,2':6',2''-terpyridin, wie z. B. 4'-Amino-2,2':6',2''-terpyridin und Mono-, Di-, Tri- und Polyalkylamino-2,2':6',2''-terpyridin, wie z. B. 4'-Dimethylamino-2,2':6',2''-terpyridin und Mono-, Di-, Tri- und Polyalkylthio-2,2':6',2''-terpyridin, wie z. B. 4'-Methyl-2,2':6',2''-terpyridin und 4-Methylthio-4'-ethylthio-2,2':6',2''-terpyridin.
Geeignete Derivate für Pyridin umfassen zum Beispiel mono-, di-, tri- und polysubstituierte Pyridine, wie z. B. 2,6-Bis(N-pyrazolyl)pyridin, 2,6-Bis(3-methyl-N-pyrazolyl)pyridin, 2,6-Bis(2-imidazolyl)pyridin, 2,6-Bis(1-methyl-2-imidazolyl)pyridin und 2,6-Bis(1-vinyl-2-imidazolyl)pyridin und Mono-, Di-, Tri- und Polyaminopyridine, wie z. B. 4-Aminopyridin, 4,4'-Diaminobipyridin, 4,4'-Di(dimethylamino)bipyridin und 4,4',4''-Triaminoterpyridin.
Weitere geeignete Derivate umfassen Verbindungen mit drei heterocyclen Ringen. Zum Beispiel umfaßt ein geeignetes Derivat eine Verbindung mit der folgenden Formel:
wobei R₁₀, R₁₁ und R₁₂ jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Vinyl, Allyl, Amido, Amino, Vinylketon, Keto oder eine Schwefel-haltige Gruppe sind.
Die Begriffe "Alkyl", "Alkoxy", "Alkenyl", "Amido", "Amino", "Vinylketon", "Keto" und "Schwefel-haltige Gruppe" sind wie oben definiert.
Andere geeignete Redoxmediator-Derivate umfassen Verbindungen mit der folgenden Formel:
wobei R₁₃ Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Vinyl, Allyl, Vinylketon, Keto, Amido, Amino oder eine Schwefel-haltige Gruppe ist, und Y₅ und Y₆ jeweils unabhängig ein Stickstoff- oder Kohlenstoffatom sind.
Die Begriffe "Alkyl", "Alkoxy", "Alkenyl", "Amido", "Amino", "Vinylketon", "Keto" und "Schwefel-haltige Gruppe" sind wie oben definiert.
Noch weitere geeignete Derivate umfassen Verbindungen mit der folgenden Formel:
wobei R₁₄ wie oben definiert und Y₇ und Y₈ jeweils unabhängig ein Schwefel- oder Sauerstoffatom sind.
Beispiele geeigneter Redoxmediatoren umfassen auch zum Beispiel Osmium-Kationen, die mit (a) zwei zweizahnigen Liganden, wie z. B. 2,2'-Bipyridin, 1,10-Phenanthrolin oder Derivaten davon (die beiden Liganden sind nicht notwendigerweise die gleichen), (b) einem dreizahnigen Liganden, wie z. B. 2,2',2''-Terpyridin und 2,6-Di(imidazol-2-yl)-pyridin, oder (c) einem zweizahnigen Liganden und einem dreizahnigen Liganden komplexiert. Geeignete Osmium-Übergangsmetallkomplexe umfassen zum Beispiel [(bpy)₂OsLX]^+/2+, [(dimet)₂OsLX]^+/2+, [(dmo)₂OsLX]^+/2+, [terOsLX₂]^0/+, [trimetOsLX₂]^0/+ und [(ter)(bpy)LOs]^2+/3+, wobei bpy 2,2'-Bipyridin ist, dimet 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin ist, dmo 4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin ist, ter 2,2':6',2''-Terpyridin ist, trimet 4,4',4''-Trimethyl-2,2':6',2''-Terpyridin ist, L ein Stickstoff-haltiger heterocycler Ligand ist, X ein Halogen ist, wie z. B. Fluor, Chlor oder Brom.
Die Redoxmediatoren tauschen oft Elektronen schnell miteinander und mit der Elektrode aus, so dass der Komplex schnell oxidiert und/oder reduziert werden kann. Im allgemeinen sind Eisen-Komplexe stärker oxidierend als Ruthenium-Komplexe, die wiederum stärker oxidierend sind, als Osmium-Komplexe. Außerdem nimmt das Redoxpotential im allgemeinen mit der Anzahl an koordinierenden heterocyclen Ringen zu; heterocycle Ringe mit sechs Mitgliedern vergrößern das Potential stärker als Ringe mit fünf Mitgliedern, außer wenn der das Metall koordinierende Stickstoff formal ein Anion ist. Das ist nur der Fall, wenn der Stickstoff in dem Ring an beide seiner Nachbarkohlenstoffatome durch Einzelbindungen gebunden ist. Wenn der Stickstoff formal ein Anion ist, dann nimmt das Redoxpotential im allgemeinen mehr bei der Koordination des Metallions zu.
Zumindest einige diffundierbare Redoxmediatoren umfassen eine oder mehrere funktionale Pyridin- oder Imidazol-Gruppen. Die funktionale Imidazol-Gruppe kann auch andere Substituenten umfassen und kann zum Beispiel Vinylimidazol sein, zum Beispiel 1-Vinylimidazol oder Methylimidazol, z. B. 1-Methylimidazol. Beispiele geeigneter diffundierbarer Mediatoren können [Os(dmo)₂(1-Vinylimidazol)X]X, [Os(dmo)₂(1-Vinylimidazol)X]X₂, [Os(dmo)₂(Imidazol)X]X, [Os(dmo)₂(Imidazol)X]X₂, [Os(dmo)₂(1-Methylimidazol)X]X₂ und [Os(dmo)₂(1-Methylimidazol)X]X₂ umfassen, wobei dmo 4,4-Dimethoxy-2,2'-bipyridin ist, und X ein Halogen wie oben beschrieben ist.
Andere Osmium-haltige Redoxmediatoren umfassen [Os((Methoxy)₂)phenanthrolin)₂(N-methylimidazol)X]^+/2+, [Os((Acetamido)₂bipyridin)₂(L) X]^+/2+, wobei L eine einzahnige Stickstoff-haltige Verbindung ist (einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Imidazol-Derivat), die ausgewählt ist, um das Potential zu veredeln; und Os(Terpyridin)(L)₂Cl, wobei L ein Aminopyridin ist, wie z. B. Dialkylaminopyridin; ein N-substituiertes Imidazol, wie z. B. N-Methylimidazol; ein Oxazol; ein Thiazol; oder ein Alkoxypyridin, wie z. B. Methoxypyridin. X ist ein Halogenatom, wie oben beschrieben.
Osmium-freie diffundierbare Redoxmediatoren umfassen z. B. Phenoxypyrazine, wie z. B. 7-Dimethylamino-1,2-benzophenoxazin (Meldola Blue), 1,2-Benzophenoxazin und Nilblau; 3-β-Naphthoyl (Brilliant-Cresylblau); Tetramethyphenylendiamin (TMPD); Dichlorphenolindophenol (DCIP); N-Methylphenazoniumsalze, zum Beispiel Phenazinmethosulfat (PMS), N-Methylphenazinmethosulofat und Methoxyphenazinmethosulfat; Tetrazoliumsalze, zum Beispiel Tetrazoliumblau oder Nitrotetrazoliumblau; und Phenothiazine, zum Beispiel Toluidinblau O.
Beispiele weiterer Redoxspezien umfassen stabile Chinone und Spezien, die in ihrem oxidierten Zustand chinonartige Strukturen haben, wie z. B. Nilblau und Indophenol. Beispiele geeigneter Chinone umfassen zum Beispiel Derivate von Naphthochinon, Phenochinon, Benzochinon, Naphthenchinon und dergleichen. Beispiele von Naphthochinon-Derivaten umfassen Juglon (z. B. 5-Hydroxy-1,4-naphthochinon) und Derivate davon, wie z. B. 2,3-Dichlor-5,8-dihydroxy-1,4-naphthochinon, 2,3-Dimethyl-5,8-dihydroxy-1,4-naphthochinon, 2-Chlor-5,8-dihydroxy-1,4-naphthochinon, 2,3-Methoxy-5-hydroxy-1,4-naphthochinon und dergleichen. Andere Beispiele umfassen Aminonaphthochinone wie z. B. Morpholino-naphthochinone wie 2-Chlor-3-morpholino-1,4-naphthochinon, Piperidino-naphthochinone, wie z. B. 2-Methyl-3-piperidino-1,4-naphthochinone; Piperazino-naphthochinone, wie z. B. 2-Ethoxy-3-piperazino-1,4-naphthochinon und dergleichen.
Geeignete Phenochinon-Derivate umfassen zum Beispiel Coerulignon (d. h. 3,3',5,5'-Tetramethoxydiphenochinon) und Derivate davon, wie z. B. 3,3',5,5'-Tetramethyldiphenochinon, 3,3',5,5'-Tetrahydroxydiphenochinon und dergleichen.
Geeignete Benzochinon-Derivate umfassen zum Beispiel Coenzym Q₀ (d. h. 2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzochinon) und Derivate davon, wie zum Beispiel 2,3,5-Trimethyl-1,4-benzochinon, 2,3-Dimethyl-5-methoxy-1,4-benzochinon, 2,3-Dimethyl-5-hydroxy-1,4-benzochinon und dergleichen.
Andere geeignete Chinon-Derivate umfassen zum Beispiel Acenaphthenchinon und Ubichinone, wie zum Beispiel Coenzym Q, einschließlich Q₁, Q₂, Q₆, Q₇, Q₉ und Q₁₀.
Noch andere geeignete Osmium-freie diffundierbare Redoxmediatoren umfassen zum Beispiel Taylor's blue (d. h. 1,9-Dimethylmethylenblau), N,N'-Diethylthiacyaniniodid und Thionin.
Bei einem weiteren Verfahren enthält eine Messschicht 32 einen nicht-auslaugbaren (d. h. nicht-freisetzbaren) Redoxmediator und ist auf einem Abschnitt der Arbeitselektrode 22 angeordnet. Der nicht-auslaugbare Redoxmediator kann zum Beispiel ein Redox-Polymer sein (d. h. ein Polymer mit einer oder mehreren Redoxspezies). Vorzugsweise gibt es wenig oder kein Auslaugen des nicht-auslaugbaren Redoxmediators weg von der Arbeitselektrode 22 in die Probe während der Messdauer, die typischerweise kürzer als ungefähr 5 Minuten ist. Die Redoxmediatoren dieser Ausführung können an die Arbeitselektrode 22 gebunden oder anderweitig immobilisiert sein, um das Auslaugen des Mediators in die Probe zu verhindern. Der Redoxmediator kann durch bekannte Verfahren an die Arbeitselektrode gebunden oder anderweitig immobilisiert sein, zum Beispiel durch Bilden von Mehrfachionenbrücken mit einem entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyt, kovalenter Befestigung des Redoxmediators an ein Polymer an der Arbeitselektrode, Einfangen des Redoxmediators in einer Matrix, die eine hohe Affinität für den Redoxmediator hat, oder Biokonjugation des Redoxmediators mit einer Verbindung, die an die Arbeitselektrode gebunden ist. Bei einer Ausführung kann eine kationische Austauschmembran verwendet werden, um eine anionische Redox-Verbindung einzufangen. Ähnlich kann bei einer anderen Ausführung eine anionische Austauschmembran verwendet werden, um eine kationische Redox-Verbindung einzufangen. Bei noch einer weiteren Ausführung, die Biokonjugation einsetzt, kann ein Biotin-gebundener Redoxmediator mit Avidin oder Straptavidin in einer Matrix neben der Arbeitselektrode konjugiert werden oder an der Arbeitselektrode immobilisiert werden. Noch eine weitere Ausführung umfaßt das Vorsehen eines Digoxin- oder Digoxigenin-Redoxmediators, der mit Antidioxin in einer Matrix neben einer Arbeitselektrode reagiert oder daran immobilisiert ist.
Bevorzugte nicht-auslaugbare Redoxmediatoren sind Redox-Polymere, wie zum Beispiel polymere Übergangsmetall-Verbindungen oder -Komplexe. Typischerweisen haben die Polymere, die verwendet werden, um ein Redox-Polymer zu bilden, Stickstoff-haltige Heterocyclen, wie z. B. Pyridin, Imidazol oder Derivate davon, um als Liganden an die Redoxspezies zu binden. Geeignete Polymere zur Komplexierung mit Redoxspezies, wie z. B. die Übergangsmetall-Komplexe, die oben beschrieben sind, umfassen zum Beispiel Polymere und Copolymere von Poly(1-vinylimidazol) (bezeichnet als "PVI") und Poly(4-vinylpyridin) (bezeichnet als "PVP") sowie die Polymere und Copolymere von Poly(acrylsäure) oder Polyacrylamid, die durch die Hinzufügung von angehängten Stickstoff-haltigen Heterocyclen, wie Pyridin und Imidazol, modifiziert wurden. Die Modifikation von Poly(acrylsäure) kann durch Reaktion von zumindest einem Abschnitt Carbonsäure-Funktionsgruppen mit einem Aminoalkylpyridin oder Aminoalkylimidazol durchgeführt werden, wie z. B. 4-Ethylaminopyridin, um Amide zu bilden. Geeignete Copolymer-Substituenten von PVI, PVP und Poly(acrylsäure) umfassen Acrylonitril, Acrylamid, Acrylhydrazid und substituierte oder quaternisiertes 1-Vinylimidazol. Die Copolymere können beliebige oder Blockcopolymere sein.
Die Übergangsmetall-Komplexe von nicht-auslaugbaren Redox-Polymeren sind typischerweise kovalent oder koordiniert mit den Stickstoff-haltigen Heterocyclen (z. B. Imidazol- und/oder Pyridin-Ringe) des Copolymers gebunden. Die Übergangsmetall-Komplexe können funktionale Vinyl-Gruppen haben, durch die Komplexe copolymerisiert werden können. Geeignete funktionale Vinyl-Gruppen umfassen zum Beispiel Vinyl-Heterocyclen, Amide, Nitrile, Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder andere polare Vinyl-Verbindungen. Ein Beispiel eines Redox-Polymers dieser Art ist Poly(vinylferrocen) oder ein Derivat von Poly(vinylferrocen), das funktionalisiert ist, um das Quellen des Redox-Polymers in Wasser zu verstärken.
Eine weitere Art an Redox-Polymer enthält eine ionisch gebundene Redoxspezies, durch Ausbilden mehrere Ionenbrücken. Typischerweise umfaßt diese Art an Mediator ein geladenes Polymer, das an eine entgegengesetzt geladene Redoxspezies gekoppelt ist. Beispiele für diesen Typ von Redox-Polymer umfassen ein negativ geladenes Polymer wie Nafion^® (DuPont), das an mehrfach positiv geladene Redoxspezies gekoppelt ist, wie ein Osmium- oder Rutheniumpolypyridyl-Kation. Ein weiteres Beispiel für einen ionisch gebundenen Mediator ist ein positiv geladenes Polymer, wie quaternäres Poly(4-vinylpyridin) oder Poly(1-vinylimidazol), das an eine negativ geladene Redoxspezies wie Ferricyanid oder Ferrocyanid, gekoppelt ist. Die bevorzugte ionisch gebundene Redoxspezies ist eine mehrfach geladene oft polyanionische Redoxspezies, die in einem entgegengesetzt geladenen Polymer gebunden ist.
Ein weiteres geeignetes Redox-Polymer umfaßt eine Redoxspezies, die koordinativ an ein Polymer gebunden ist. Beispielsweise kann der Mediator durch Koordination eines Osmium-, Ruthenium- oder Cobalt-2,2'-bipyridiyl-Komplexes an Poly(1-vinylimidazol) oder Poly(4-vinylpyridin) oder durch Copolymerisation von zum Beispiel einer 4-Vinyl-2,2'-bipyridylosmium, -ruthenium oder -kobalt-Komplexes mit 1-Vinylimidazol oder 4-Vinylpyridin gebildet werden.
Typischerweise bewegt sich das Verhältnis von Osmium- oder Ruthenium-Übergangsmetallkomplexen zu Imidazol- und/oder Pyridin-Gruppen von den nicht-auslaugbaren Redox-Polymeren in Bereichen von 1 : 20 zu 1 : 1, vorzugsweise von 1 : 15 zu 1 : 2 und insbesondere vorzugsweise von 1 : 10 bis 1 : 4. Im allgemeinen hängen die Redoxpotentiale zumindest zum Teil von dem Polymer ab, wobei die Reihenfolge der Redoxpotentiale Poly(acrylsäure) < PVE < PVP ist.
Eine Vielfalt von Verfahren kann verwendet werden, um ein Redox-Polymer an einer Elektrodenoberfläche zu immobilisieren. Ein Verfahren ist Adsorbierende Immobilisierung. Dieses Verfahren ist insbesondere für Redox-Polymere mit relativ hohen Molekulargewichten verwendbar. Das Molekulargewicht eines Polymers kann vergrößert werden, zum Beispiel durch Vernetzen. Das Polymer des Redox-Polymers kann funktionale Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Hydrazid-, Amin-, Alkohol-, heterocyclen Stickstoff-, Vinyl-, Allyl- und Carbonsäure-Gruppen, die unter Verwendung eines Vernetzungsmittels vernetzt werden können. Diese funktionalen Gruppen können an dem Polymer oder einem oder mehreren der Copolymere vorgesehen werden. Alternativ oder zusätzlich können die funktionalen Gruppen durch eine Reaktion zugefügt werden, wie z. B. Quaternisierung. Ein Beispiel ist die Quaternisierung von PVP mit Bromethylamin-Gruppen.
Geeignete Vernetzungsmittel umfassen zum Beispiel Moleküle mit zwei oder mehr Epoxiden (z. B. Poly(ethylenglykol)diglycidylether (PEGDGE)), Aldehyd, Aziridin, Alkylhalogenid und funktionale Azid-Gruppen oder Kombinationen davon. Wenn ein Polymer mehrere Acrylat-Funktionen hat, kann es mit einem Di- oder Polythiol vernetzt werden; wenn es mehrere Thiol-Funktionen hat, kann es mit einem Di- oder Polyacrylat vernetzt werden. Andere Beispiele von Vernetzungsmitteln umfassen Verbindungen, die Carbonsäure oder andere funktionale Säuregruppen zur Kondensation mit Aminen oder anderen Stickstoff-Verbindungen aktivieren. Diese Vernetzungsmittel umfassen Carbodiimide oder Verbindungen mit aktivem N-Hydroxysuccinimid oder funktionalen Imidat-Gruppen. Noch weitere Beispiele von Vernetzungsmitteln sind Chinone (z. B. Tetrachlorbenzochinon und Tetracyanochinodimethan) und Cyanurchlorid. Andere Vernetzungsmittel können auch verwendet werden. Bei einigen Ausführungen ist ein zusätzliches Vernetzungsmittel nicht erforderlich. Weitere Diskussionen und Beispiele zum Vernetzen und für Vernetzungsmittel findet man in den US-Patenten Nr. 5,262,035; 5,262,305; 5,320,725; 5,264,104; 5,264,105; 5,356,786 und 5,593,852.
Bei einer weiteren Ausführung ist das Redox-Polymer durch die Funktionalisierung der Elektrodenoberfläche und dann das chemische Binden, oft kovalent, des Redox-Polymers an die funktionalen Gruppen der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Ein Beispiel dieser Art vom Immobilisierung beginnt mit einem Poly(4-vinylpyridin). Die Pyridin-Ringe des Polymers sind zum Teil mit reduzierbaren/oxidierbaren Spezies komplexiert, wie z. B. [Os(bpy)₂Cl]^+/2+, wobei bpy 2,2-Bipyridin ist. Ein Teil der Pyridin-Ringe wird quaternisiert durch die Reaktion mit 2-Bromethylamin. Das Polymer wird dann zum Beispiel unter Verwendung eines Diepoxids vernetzt, wie Poly(ethylenglykol)diglycidylether.
Kohlenstoff-Oberflächen können zum Befestigen eines Redox-Polymers modifiziert werden, zum Beispiel durch Elektroreduktion eines Diazoniumsalzes. Als eine Erläuterung modifiziert die Reduktion eines Diazoniumsalz, das aufgrund einer Diazotisation von p-Aminobenzoesäure gebildet ist, eine Kohlenstoff-Oberfläche mit funktionalen Phenylcarbonsäure-Gruppen. Die funktionalen Gruppen können durch Carbodiimid aktiviert werden, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC). Die aktivierten funktionalen Gruppen werden mit einem funktionalisiertem Amin-Redoxpaar gebunden, wie zum Beispiel das quaternisierte Osmium-haltige Redox-Polymer, das oben beschrieben wurde, oder 2-Aminoethylferrocen, um das Redoxpaar zu bilden.
Ähnlich können Gold oder andere Metalloberflächen durch zum Beispiel ein Amin wie Cystamin oder durch eine Carbonsäure, wie z. B. Thiocinsäure funktionalisiert werden. Eine Redoxpaar, wie z. B. [Os(byp)₂(Pyridin-4-carboxylat)Cl]^0/+ wird durch 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) aktiviert, um einen reaktiven O-Acylisoharnstoff zu bilden, der mit dem goldgebundenen Amin reagiert, um ein Amid zu bilden. Die funktionale Carbonsäure-Gruppe von Thiocinsäure kann mit EDC aktiviert werden, um ein Polymer oder Proteinamin zu binden, um ein Amid zu bilden.
Wenn das verwendete Enzym PQQ-Glucosedehydrogenase oder Glucoseoxidase ist, haben die bevorzugten nicht-auslaugbaren Redoxmediatoren ein Redoxpotential zwischen ungefähr –300 mV bis ungefähr +400 mV gegenüber der Standard-Calomel-Elektrode (SCE). Die bevorzugtesten nicht-ausgleichbaren Redoxmediatoren haben Osmium-Redoxzentren und ein Redoxpotential, das negativer als +100 mV gegenüber der SCE ist, bevorzugter ist das Redoxpotential negativer als 0 mV gegenüber der SCE, und am bevorzugtesten liegt es in der Nähe von –150 mV gegenüber der SCE.
Bei zumindest einigen Fällen sind die Redoxmediatoren der Sensoren luftoxidierbar. Das bedeutet, dass der Redoxmediator durch Luft oxidiert wird, vorzugsweise derart, dass zumindest 90% des Mediators in einem oxidierten Zustand vor der Einführung der Probe in den Sensor ist. Luftoxidierbare Redoxmediatoren umfassen Osmium-Kationen, die mit zwei Mono-, Di- oder Polyalkoxy-2,2'-bipyridin- oder Mono-, Di- oder Polyalkoxy-1,10-phenanthrolin-Liganden komplexiert sind, wobei die beiden Liganden nicht notwendigerweise die gleichen sind, und des weiteren mit Polymeren oder anderen Liganden mit funktionalen Pyridin- und Imidazol-Gruppen komplexiert sind. Insbesondere erreicht Os[4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin]₂Cl^+/+2 komplexiert mit Poly(4-vinylpyridin) oder Poly(1-vinylimidazol) ungefähr 90% oder mehr Oxidation in Luft. Die Luftoxidation des Redoxmediators kann stattfinden, während der Redoxmediator ein Feststoff ist, wie z. B., wenn er auf den Sensor in einem trockenen Zustand beschichtet und gelagert wird. Alternativ kann die Luftoxidation des Redoxmediators stattfinden, während der Redoxmediator in einer Lösung ist, wie z. B. bevor die Lösung auf den Sensor angewendet und getrocknet wird. In dem Fall, bei dem Redoxmediator in Lösung luftoxidiert wird, kann die den Redoxmediator enthaltende Lösung für eine Zeitdauer aufbewahrt werden, die hinreichend ist, um den Mediator vor der Verwendung der Lösung in dem Herstellungsprozeß in Luft zu oxidieren.
Zweites Elektronenübertragungsmittel
Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfaßt der Sensor einen Redoxmediator und ein zweites Elektronenübertragungsmittel, das fähig ist, Elektronen zu oder von dem Redoxmediator und dem Analyten zu übertragen. Das zweite Elektronenübertragungsmittel kann diffundierbar oder nicht-auslaugbar (z. B. in einem Redox-Polymer eingefangen sein oder koordiniert, kovalent oder ionisch an das Redox-Polymer gebunden sein). Ein Beispiel eines geeigneten zweiten Elektronenübertragungsmittel ist ein Enzym, das eine Reaktion des Analyten katalysiert. Zum Beispiel wird Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase, wie Pyrrolochinolinchinonglucosedehydrogenase (PQQ) verwendet, wenn der Analyt Glucose ist. Eine Lactatoxidase erfüllt diese Rolle, wenn der Analyt Lactat ist. Andere Enzyme können für andere Analyten verwendet werden. Diese Enzyme katalysieren die Elektrolyse eines Analyten, indem sie Elektronen zwischen dem Analyten und der Elektrode über den Redoxmediator übertragen. Bei einigen Ausführungen ist das zweite Elektronenübertragungsmittel nicht-auslaugbar, und insbesondere vorzugsweise auf der Arbeitselektrode immobilisiert, um ungewolltes Auslaugen des Mittels in die Probe zu verhindern. Das wird z. B. erreicht, indem das nicht-auslaugbare zweite Elektronenübertragungsmittel mit dem nicht-auslaugbaren Redoxmediator vernetzt wird, um dadurch eine Messschicht mit nicht-auslaugbaren Komponenten auf der Arbeitselektrode zu schaffen. Bei anderen Ausführungen ist das zweite Elektronenübertragungsmittel diffundierbar (und kann auf einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet oder in der Probe plaziert sein).
Gegenelektrode
Die Gegenelektrode 24, wie in den 1–4 dargestellt, kann ähnlich wie die Arbeitselektrode 22 konstruiert sein. Die Gegenelektrode 24 kann auch eine Gegen-/Bezugselektrode sein. Alternativ kann eine eigene Bezugselektrode in Kontakt mit der Probenkammer bereit gestellt werden. Geeignete Materialien für die Gegen-/Bezugs- oder die Bezugselektrode umfassen Ag/AgCl oder Ag/AgBr, die auf ein nicht-leitendes Basismaterial gedruckt sind, oder Silberchlorid auf einer Basis aus Silbermetall. Die gleichen Materialien und Verfahren können zur Herstellung der Gegenelektrode verwendet werden, wie sie für die Konstruktion der Arbeitselektrode 22 zur Verfügung stehen, obwohl andere Materialien und Verfahren auch verwendet werden können. Es kann ein Flachstecker 25 an der Elektrode für eine einfache Verbindung mit einem externen elektronischen Gerät (nicht gezeigt), beispielsweise einem Coulometer, einem Potentiostaten oder einer anderen Messvorrichtung, bereit gestellt werden.
Elektrodenkonfiguration
Bei einer Ausführungsform der Erfindung sind die Arbeitselektrode 22 und die Gegenelektrode 24 einander gegenüber liegend angeordnet, so dass sie ein sich gegenüber liegendes Elektrodenpaar bilden, wie es in den 1 und 3 dargestellt ist. Bei dieser bevorzugten Konfiguration ist die Probenkammer 26 typischerweise zwischen den beiden Elektroden angeordnet. Für diese Konfiguration mit den sich gegenüber liegenden Elektroden wird es bevorzugt, dass die Elektroden durch eine Distanz von weniger als ungefähr 0,2 mm (d. h. zumindest ein Abschnitt der Arbeitselektrode ist von einem Abschnitt der Gegenelektrode um nicht mehr als 200 μm getrennt), vorzugsweise von weniger als 100 μm und am bevorzugtesten von weniger als 50 μm voneinander getrennt sind.
Die Elektroden müssen nicht sich direkt gegenüber liegen, sondern sie können leicht versetzt sein. Außerdem müssen die beiden Elektroden nicht die gleiche Größe haben. Vorzugsweise ist die Gegenelektrode 24 wenigstens so groß wie die Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode 22. Die Gegenelektrode 22 kann auch mit Zähnen kammförmig ausgebildet sein. Andere Konfigurationen sowohl der Gegenelektrode als auch der Arbeitselektrode sind im Bereich der Erfindung eingeschlossen. Allerdings überschreitet für diese bestimmte Ausführung die Trenndistanz zwischen zumindest einem Teil der Arbeitselektrode und einem Teil der Gegenelektrode vorzugsweise nicht die hier oben angegebenen Grenzen.
Die 11A, 11B und 11C illustrieren unterschiedliche Ausführungsformen von Paaren sich gegenüber liegender Elektroden 22, 24, wie sie oben beschrieben wurden. Ein Bereich 21 mit einer Überlappung zwischen den beiden Elektroden 22, 24 entspricht typischerweise der Messzone, in welcher die Probe vermessen wird. Jede der Elektroden 22, 24 stellt eine leitende Oberfläche dar und wirkt als eine Platte eines Kondensators. Die Messzone zwischen den Elektroden 22, 24 wirkt als eine dielektrische Schicht zwischen den Platten. Somit gibt es eine Kapazitanz zwischen den beiden Elektroden 22, 24. Diese Kapazitanz ist eine Funktion der Größe der überlappenden Elektroden 22, 24, der Distanz zwischen den Elektroden 22, 24 und der Dielektrizitätskonstanten des Materials zwischen den Elektroden 22, 24. Somit kann, wenn die Größe des Bereiches 21 der überlappenden Elektroden 22, 24 und die Dielektrizitätskonstante des Materials zwischen den Elektroden (beispielsweise Luft oder eines Sorbensmaterials) bekannt sind, die Distanz zwischen den Elektroden berechnet werden, um das Volumen der Messzone zu bestimmen.
Die 11A illustriert eine Ausführungsform der Erfindung, bei der die Elektroden 22, 24 einander gegenüber liegend angeordnet sind. Damit die Kapazitanz bei ähnlich konstruierten Analytensensoren, die diese bestimmte Sensorkonfiguration aufweisen, einheitlich ist, sollte die Registrierung (d. h. die Anordnung der beiden Elektroden relativ zueinander) einheitlich sein. Wenn die Position von einer der beiden Elektroden in der x-y-Ebene aus der Position, die in der 11A gezeigt ist, verschoben wird, ändert sich die Größe der Überlappung und somit die Kapazitanz. Das gleiche Prinzip gilt für das Volumen der Messzone.
Die 11B und 11C illustrieren andere Ausführungsformen der Erfindung mit Elektroden 22, 24 in einer Anordnung, bei der sie sich gegenüber liegen. Bei diesen speziellen Anordnungen kann die Position jeder der beiden Elektroden um mindestens eine gewisse minimale Distanz in der x-y-Ebene relativ zur anderen Elektrode verschoben werden, ohne dass es zu einer Veränderung der Kapazitanz oder des Volumens der Messzone kommt. Bei diesen Anordnungen der Elektroden weist jede Elektrode 22, 24 einen Arm 122 bzw. 124 auf, der mit dem entsprechenden Arm der anderen Elektrode überlappt. Die beiden Arme 122, 124 liegen nicht parallel zueinander (wie es beispielsweise in der 11A illustriert ist). Statt dessen sind die Arme 122, 124 in einem Winkel 123, der größer als Null ist, relativ zueinander angeordnet. Außerdem erstrecken sich die beiden Arme 122, 124 über den Bereich 21 der Überlappung hinaus (d. h. jeder Arm hat eine zusätzliche Länge, die dem Unterschied zwischen der Länge des Armes 222 bzw. 224 und der Breite 121 der Überlappung 21 entspricht). Bei diesen Elektrodenanordnungen kann bei der Registrierung der Elektroden 22, 24 eine bestimmte Ungenauigkeit zugelassen sein, die die Kapazitanz der Elektrodenanordnung nicht verändert. Ein gewünschter Umfang der zugelassenen Ungenauigkeit bei der Registrierung kann in die Konstruktion der Elektrodenanordnung aufgenommen werden, indem der Winkel 123, mit dem die Arme 122, 124 überlappen, und die Größe der zusätzlichen Länge eines jeden Armes 122, 124 bezüglich der Breite 121 des Bereiches 21 der Überlappung variiert werden. Typischerweise ist die zugelassene Ungenauigkeit um so größer, je mehr sich die Arme 122, 124 in der Nähe eines rechten Winkels (d. h. der Winkel 123 ist 90°) befinden. Auch ist die zulässige Ungenauigkeit um so größer, je größer die zusätzliche Länge von jedem Arm 122, 124 (wobei die beiden gleich oder unterschiedlich sein können) im Verhältnis zur Breite 121 des Bereiches 21 der Überlappung ist. Umgekehrt ist die Größe der Elektroden (für eine vorgegebene Elektrodenbreite, -dicke und einen Winkel 123 der Schnittebene mit der anderen Elektrode) um so größer, je größer die zugelassene Ungenauigkeit ist. Somit wird die minimale Distanz, um die eine Elektrode gegenüber der anderen verschoben werden kann, gegen die Materialmenge abgewogen, die für die Elektroden benötigt wird. Typischerweise liegt der Winkel 123 der Schnittebene bei 5 bis 90 Grad, vorzugsweise bei 30 bis 90 Grad, und noch bevorzugter bei 60 bis 90 Grad. Typischerweise liegt das Verhältnis zwischen der zusätzlichen Länge eines Armes 122, 124 (entsprechend dem Unterschied zwischen der Armlänge 222, 224 und der Breite 121 des Bereiches 21 der Überlappung) und der Breite 121 des Bereiches 21 der Überlappung bei 0,1 : 1 bis 50 : 1, vorzugsweise bei 1 : 1 bis 15 : 1 und noch bevorzugter bei 4 : 1 bis 10 : 1.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen die beiden Elektroden 22, 24 in derselben Ebene, wie es in der 2 gezeigt ist. In diesem Falle befindet sich die Probenkammer 26 in Kontakt mit beiden Elektroden und wird an der Seite, die den Elektroden gegenüber liegt, von einer nicht-leitenden inerten Basis 30 begrenzt. Zu geeigneten Materialien für die inerte Basis gehören nicht-leitende Materialien wie Polyester.
Es sind auch andere Konfigurationen der erfindungsgemäßen Sensoren möglich. Beispielsweise können die beiden Elektroden auf Oberflächen ausgebildet sein, die in einem Winkel zueinander stehen. Eine derartige Konfiguration würde die Elektroden auf Oberflächen enthalten, die einen rechten Winkel bilden. Eine andere mögliche Konfiguration enthält die Elektroden auf einer gebogenen Oberfläche wie dem Inneren einer Röhre. Die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode können so angeordnet sein, dass sie sich auf entgegengesetzten Seiten der Röhre gegenüber liegen. Das stellt ein weiteres Beispiel eines sich gegenüber liegenden Elektrodenpaares dar. Alternativ können die Elektroden nahe beieinander an der Wand der Röhre angeordnet sein (z. B. eine oben und die andere daneben).
Bei jeder beliebigen Konfiguration müssen die beiden Elektroden so konfiguriert sein, dass sie nicht in direktem elektrischem Kontakt miteinander stehen, damit ein Kurzschluss des elektrochemischen Sensors vermieden wird. Das kann schwierig zu vermeiden sein, wenn die sich gegenüber liegenden Elektroden im Mittel um nicht mehr als ungefähr 100 μm voneinander getrennt sind.
Es kann ein Abstandshalter 28 verwendet werden, um die Elektroden voneinander entfernt zu halten, wenn die Elektroden einander gegenüber liegen, wie es in den 1 und 3 dargestellt ist. Der Abstandshalter besteht üblicherweise aus einem inerten nicht-leitenden Material, wie einem drucksensitiven Klebstoff, Polyester, Mylar^TM, Kevlar^TM oder einem beliebigen anderen stabilen, dünnen Polymerfilm oder, alternativ, einem dünnen Polymerfilm wie einem Teflon^TM-Film, der aufgrund seiner chemischen Inertheit ausgewählt wird. Zusätzlich dazu, dass er den Kontakt zwischen den Elektroden verhindert, fungiert der Abstandshalter 28 oft als ein Teil der Begrenzung der Probenkammer 26, wie es in den 1–4 gezeigt ist. Andere Abstandshalter umfassen Schichten von Klebstoff oder doppel seitige Klebebänder (z. B. einen Trägerfilm mit Klebstoff auf gegenüberliegenden Seiten des Films).
Probenkammer
Die Probenkammer 26 ist typischerweise durch eine Kombination aus den Elektroden 22, 24, einer inerten Basis 30 und einem Abstandshalter 28 definiert, wie es in den 1–4 gezeigt ist. Eine Messzone ist in dieser Probenkammer enthalten und stellt den Bereich der Probenkammer dar, der nur denjenigen Teil der Probe enthält, der bei der Bestimmung des Analyten untersucht wird. Bei der Ausführungsform der Erfindung, die in den 1 und 2 dargestellt ist, stellt die Probenkammer 26 den Raum zwischen den beiden Elektroden 22, 24 und/oder der inerten Basis 30 dar. Bei dieser Ausführungsform hat die Probenkammer ein Volumen, das vorzugsweise kleiner als ungefähr 1 μL ist, bevorzugter kleiner als ungefähr 0,5 μL und am bevorzugtesten kleiner als 0,25 μL ist. Bei der Ausführungsform der Erfindung, die in den 1 und 2 dargestellt ist, hat die Messzone ein Volumen, das ungefähr gleich dem Volumen der Probenkammer ist. Bei einer bevorzugten Ausführung umfaßt die Messzone 80% der Probenkammer, 90% bei einer mehr bevorzugten Ausführung und etwa 100% bei einer bevorzugtesten Ausführung.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, die in der 3 gezeigt ist, schließt die Probenkammer 26 viel mehr Raum als den Bereich in der Nähe der Elektroden 22, 24 ein. Diese Konfiguration macht es möglich, mehrere Elektroden bereit zu stellen, die sich in Kontakt mit einer oder mehreren Probenkammer(n) befinden, wie es in der 5 gezeigt ist. Bei dieser Ausführungsform hat die Probenkammer 26 vorzugsweise eine solche Größe, dass sie ein Volumen von weniger als ungefähr 1 μL enthalten kann, bevorzugter von weniger als ungefähr 0,5 μL und am bevorzugtesten von weniger als ungefähr 0,25 μL. Die Messzone (d. h. der Bereich, der das Volumen der Probe enthält, das analysiert werden soll) hat im allgemeinen eine solche Größe, dass sie ein Probenvolumen von weniger als ungefähr 1 μL, vorzugsweise von weniger als ungefähr 0,5 μL, bevorzugter von weniger als ungefähr 0,25 μL und am bevorzugtesten von weniger als ungefähr 0,1 μL enthält. Eine besonders nützliche Konfiguration dieser Ausführungsform ordnet die Arbeitselektrode 22 und die Gegenelektrode 24 so an, dass sie einander gegenüber liegen, wie es in der 3 gezeigt ist. Bei dieser Ausführungsform ist die Messzone, die dem Bereich entspricht, der den Teil der Probe enthält, der analysiert wird, derjenige Teil der Probenkammer 26, der von der Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode begrenzt wird und zwischen den beiden sich gegenüber liegenden Elektroden liegt.
Bei beiden der oben diskutierten Ausführungsformen entspricht die Dicke der Probenkammer und der Messzone typischerweise der Dicke des Abstandshalters 28 (z. B. der Distanz zwischen den Elektroden in den 1 und 3 oder der Distanz zwischen den Elektroden und der inerten Basis in der 2). Der Abstandshalter kann zum Beispiel ein Klebstoff oder ein doppelseitiges Klebeband oder ein doppelseitiger Klebefilm sein. Vorzugsweise ist diese Dicke gering, um eine schnelle Elektrolyse des Analyten zu fördern, da sich für ein vorgegebenes Probenvolumen ein größerer Teil der Probe in Kontakt mit der Elektrodenoberfläche befindet. Außerdem hilft eine dünne Probenkammer dabei, Fehler aus der Diffusion des Analyten in die Messzone aus anderen Bereichen der Probenkammer während der Bestimmung des Analyten zu verringern, da die Diffusionszeit im Vergleich zur Messzeit lang ist. Typischerweise ist die Dicke der Probenkammer kleiner als ungefähr 0,2 mm. Vorzugsweise ist die Dicke der Probenkammer kleiner als ungefähr 0,1 mm, und bevorzugter ist die Dicke der Probenkammer kleiner als ungefähr 0,05 mm oder weniger.
Die Probenkammer kann mittels anderer Verfahren gebildet werden. Zu beispielhaften Verfahren gehören ein Prägen, ein Einkerben oder eine andere Art der Erzeugung einer Ausnehmung in einem Träger, in der entweder die Arbeitselektrode 22 oder die Gegenelektrode 24 gebildet ist. Die 12A und 12B illustrieren eine Ausführungsform dieser Struktur. Zuerst wird eine Leiterschicht 100 auf einem inerten, nicht-leitenden Basismaterial 102 gebildet. Wie oben beschrieben wurde, kann die Leiterschicht 100 Gold, Kohlenstoff, Platin, Rutheniumdioxid, Palladium oder andere nicht-korrodierende Materialien einschließen. Das inerte, nicht-leitende Basismaterial 102 kann unter Verwendung eines Polyesters, anderer Polymere oder anderer, nicht-leitender deformierbarer Materialien hergestellt werden. Es wird dann eine Ausnehmung 104 in einem Bereich des nichtleitenden Basismaterials 102 auf eine Weise gebildet, dass wenigstens ein Teil der Leiterschicht 100 in der Ausnehmung 104 enthalten ist. Die Ausnehmung 104 kann mittels verschiedener Techniken gebildet werden, zu denen ein Prägen, ein Deformieren oder ein anderweitiges Schieben in das Basismaterial 102 gehören. Ein weiteres beispielhaftes Verfahren zur Bildung der Ausnehmung umfasst das Prägen des Basismaterials 102. Beispielsweise kann das Basismaterial 102 in Kontakt mit einer Prägewalze oder einem Stempel gebracht werden, der erhöhte Teile aufweist, beispielsweise Stanzelemente oder Kanäle, um die Ausnehmung 104 zu erzeugen. Bei einigen Ausführungsformen kann das Basismaterial 102 zur Erweichung des Materials erhitzt werden.
Die Ausnehmung 104 kann rund, oval oder rechteckig sein oder jede beliebige andere regelmäßige oder unregelmäßige Form aufweisen. Alternativ kann die Ausnehmung 104 als ein Kanal ausgebildet sein, der sich längs eines Teiles des Basismaterials 102 erstreckt. Die Leiterschicht 100 kann sich über die gesamte Länge des Kanals oder nur über einen Teil des Kanals erstrecken. Die Messzone kann auf einen bestimmten Bereich im Kanal beschränkt sein, indem beispielsweise die Messschicht 32 nur auf denjenigen Teil der Leiterschicht 100 abgelagert wird, die sich in dem bestimmten Bereich des Kanals befindet. Alternativ kann die Messzone dadurch definiert werden, dass eine zweite Elektrode 107 nur über dem gewünschten Bereich der ersten Elektrode 105 angeordnet wird.
Zumindest ein Teil der Leiterschicht 100, und in einigen Fällen die gesamte Leiterschicht, ist in der Ausnehmung 104 angeordnet. Dieser Teil der Leiterschicht 100 kann als erste Elektrode 105 fungieren (eine Gegenelektrode oder vorzugsweise eine Arbeitselektrode). Wenn die Leiterschicht 100 die Arbeitselektrode bildet, dann kann eine Messschicht 32 über einem Teil der Leiterschicht 100 ausgebildet werden, indem der nicht-auslaugbare Redox-Mediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel in der Ausnehmung 104 abgelagert werden, wie es in der 12B gezeigt ist. Wenn ein diffundierbarer Redoxmediator oder ein zweites Elektronenübertragungsmittel verwendet wird, dann kann das diffundierbare Material auf einer beliebigen Oberfläche in der Probenkammer oder in der Probe angeordnet sein.
Es wird dann eine zweite Elektrode 107 gebildet, indem eine zweite Leiterschicht auf einem zweiten Basismaterial 106 abgelagert wird. Diese zweite Elektrode 107 wird dann über der ersten Elektrode 105 so angeordnet, dass sie ihr gegenüber liegt. Obwohl es nicht dargestellt ist, wenn der Redox-Mediator nicht-auslaugbar ist, wird es aber klar sein, dass, wenn die erste Elektrode 105 als eine Gegenelektrode wirken würde, die Messschicht 32 auf der zweiten Elektrode 107 abgelagert werden würde, die dann als Arbeitselektrode funktionieren würde. Wenn der Redoxmediator diffundierbar ist, kann der Redoxmediator jedoch an einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet sein, oder er kann in der Probe plaziert sein.
Bei einer Ausführungsform ruht das zweite Basismaterial 106 auf einem Teil des ersten Basismaterials 102 und/oder der Leiterschicht 100, die nicht abgesenkt ist, so dass sich die zweite Elektrode 107 in die Ausnehmung erstreckt. Bei einer weiteren Ausführungsform gibt es einen Abstandshalter (nicht gezeigt) zwischen dem ersten und dem zweiten Basismaterial 102, 106. Bei dieser Ausführungsform kann sich die zweite Elektrode 107 in die Ausnehmung erstrecken, muss aber nicht. Auf jeden Fall besteht zwischen der ersten und der zweiten Elektrode 105, 107 kein Kontakt, weil ansonsten die beiden Elektroden kurz geschlossen sein würden.
Die Tiefe der Ausnehmung 104 und das Volumen der Leiterschicht 100, der Messschicht 32 und des Teils der zweiten Elektrode 107 in der Ausnehmung 104, wenn ein solcher vorhanden ist, bestimmen das Volumen der Messzone. Somit hängt die Vorhersagbarkeit des Volumens der Messzone davon ab, in welchem Umfang die Bildung der Ausnehmung 104 gleichmäßig ist.
Zusätzlich zur Leiterschicht 100 kann eine Sorbensschicht 103, die im Detail unten beschrieben wird, vor der Bildung der Ausnehmung 104 auf dem Basismaterial 102 abgelagert werden, wie es in der 14A gezeigt ist. Das Sorbensmaterial 103 kann in die Leiterschicht 100 und das Basismaterial 102 eingekerbt, geprägt oder auf andere Weise aufgetragen werden, wie es in der 14B gezeigt ist. Alternativ kann das Sorbensmaterial 103 abgelagert werden, nachdem die Leiterschicht 100 und das Basismaterial 102 eingesenkt, geprägt oder auf andere Weise zur Bildung der Ausnehmung 104 deformiert wurden.
Bei einem weiteren exemplarischen Verfahren zur Bildung des Analytensensors wird eine Ausnehmung 114 in einem ersten Basismaterial 112 gebildet, wie es in den 13A und 13B gezeigt ist. Die Ausnehmung kann durch Einkerben, Prägen, Ätzen (beispielsweise durch Verwendung photolithographischer Verfahren oder die Entfernung eines Teils des Basismaterials mittels eines Lasers) oder auf eine sonstige Weise zur Deformierung oder Entfernung eines Teils des Basismaterials 112 gebildet werden. Dann wird eine erste Leiterschicht 110 in der Ausnehmung 114 gebildet. Es kann jedes beliebige der oben diskutierten leitfähigen Materialien verwendet werden. Ein bevorzugtes Material ist eine leitfähige Tinte, beispielsweise eine leitfähige Kohlenstoff-Tinte, wie sie von Ercon Inc. (Wareham, Massachusetts) bezogen werden kann. Die leitfähige Tinte enthält typischerweise Metall oder Kohlenstoff, das bzw. der in einem Lösemittel oder Dispersionsmittel gelöst oder dispergiert ist. Wenn das Lösemittel oder Dispersionsmittel entfernt wird, bildet das Metall oder der Kohlenstoff eine Leiterschicht 110, die dann als erste Elektrode 115 verwendet werden kann. Eine zweite Elektrode 117 kann auf einem zweiten Basismaterial 116 gebildet und über der Ausnehmung 114 angeordnet werden, wie es oben beschrieben wurde. Bei Ausführungen mit einem nicht-auslaugbaren Redoxmediator ist eine Messschicht 32 auf der ersten Elektrode 115 gebildet, um eine Arbeitselektrode auszubilden, wie in 13B gezeigt. Bei anderen Ausführungen mit einem nicht-auslaugbaren Redoxmediator kann die Messschicht 32 auf der zweiten Elektrode 117 gebildet werden, um eine Arbeitselektrode auszubilden. Alternativ, wenn ein diffundierbarer Redoxmediator verwendet wird, dann muß die Arbeitselektrode nicht die Messschicht darauf angeordnet haben. In der Tat ist keine Messschicht erforderlich, weil der Redoxmediator in der Probe plaziert werden kann, und ebenso bei einem diffundierbaren zweiten Elektronenübertragungsmittel, wenn eines vorhanden ist. Alle diffundierbaren Komponenten können unabhängig an einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer angeordnet oder in der Probe plaziert sein. Überdies kann ein Sorbensmaterial (nicht gezeigt) in der Aussparung, zum Beispiel auf der ersten Elektrode 115, ausgebildet werden.
Es kann auch ein Bindemittel, beispielsweise ein Polyurethanharz, ein Cellulose-Derivat, ein Elastomer (beispielsweise Silicone, polymere Diene oder Acrylnitril-Butadien-Styrol-Harze (ABS-Harze)), hochfluorierte Polymere oder dergleichen in der leitfähigen Tinte enthalten sein. Das Härten des Bindemittels kann die Leitfähigkeit der Leiterschicht 110 erhöhen, jedoch ist das Härten nicht erforderlich. Das Verfahren der Härtung des Binders kann von der Art des jeweiligen Binders, der verwendet wird, abhängen. Einige Bindemittel werden durch Wärme und/oder ultraviolettes Licht gehärtet.
Diese Strukturen ermöglichen die Bildung von elektrochemischen Sensoren, bei denen das Volumen der Messzone wenigstens teilweise von der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ausnehmung 104 abhängt. Es können ein Prägen, eine Laserätzung, eine photolithographische Ätzung und andere Verfahren zur Herstellung reproduzierbarer Ausnehmungen 104 verwendet werden, sogar im Bereich von 200 μm oder darunter.
Sorbensmaterial
Die Probenkammer kann leer sein, bevor die Probe in die Kammer gegeben wird. Alternativ kann die Probenkammer ein Sorbensmaterial 34 einschließen, um eine flüssige Probe zu adsorbieren und während des Messvorganges in der Probenkammer zu halten. Zu geeigneten Probenmaterialien gehören Polyester, Nylon, Cellulose und Cellulose-Derivate wie Nitrocellulose. Das Sorbensmaterial erleichtert die Aufnahme kleinvolumiger Proben über eine Dochtwirkung, die eine Kapillarwirkung der Probenkammer komplementieren oder vorzugsweise ersetzen kann. Zusätzlich oder alternativ kann ein Abschnitt oder die gesamte Wand der Probenkammer mit einem Tensid bedeckt sein, wie z. B. Zonyl FSO.
Bei einigen Ausführungsformen wird das Sorbensmaterial unter Verwendung einer Flüssigkeit oder einer Aufschlämmung abgelagert, in der das Sorbensmaterial gelöst oder dispergiert ist. Das Lösemittel oder das Dispersionsmittel in der Flüssigkeit oder der Aufschlämmung kann dann durch ein Erhitzen oder ein Verdampfen entfernt werden. Zu geeigneten Sorbensmaterialien gehören beispielsweise Cellulose oder Nylonpulver, die in einem geeigneten Lösemittel oder Dispersionsmittel gelöst oder dispergiert sind, beispielsweise in Wasser. Das spezielle Lösemittel oder Dispersionsmittel sollte auch mit dem Material der Arbeitselektrode 22 kompatibel sein (z. B. sollte das Lösemittel oder Dispersionsmittel die Elektrode nicht auflösen).
Eine der wichtigsten Funktionen des Sorbensmaterials besteht darin, das Volumen der Flüssigkeit zu reduzieren, das benötigt wird, um die Probenkammer sowie die entsprechende Messzone des Sensors zu füllen. Das tatsächliche Volumen der Probe innerhalb der Messzone wird teilweise durch die Größe des Hohlraums im Inneren des Sorbensmaterials bestimmt. Typischerweise bestehen geeignete Sorbentien zu ungefähr 5% bis ungefähr 50% aus Hohlraum. Vorzugsweise besteht das Sorbensmaterial zu ungefähr 10% bis ungefähr 25% aus Hohlraum.
Die Verdrängung von Flüssigkeit durch das Sorbensmaterial ist vorteilhaft. Durch den Zusatz eines Sorbens wird weniger Probe benötigt, um die Probenkammer 26 zu füllen. Das vermindert das Probenvolumen, das benötigt wird, um eine Messung zu erhalten, und es verkürzt auch die Zeit, die für die Elektrolyse der Probe benötigt wird.
Das Sorbensmaterial 34 kann einen Flachstecker 33 einschließen, der aus dem gleichen Material wie das Sorbens hergestellt ist und der sich vom Sensor oder von einer Öffnung im Sensor erstreckt, so dass eine Probe in Kontakt mit dem Flachstecker 33 gebracht werden kann, vom Flachstecker adsorbiert werden kann und über die Dochtwirkung des Sorbensmaterials 34 in die Probenkammer 26 transportiert werden kann. Das stellt ein bevorzugtes Verfahren für das Dirigieren der Probe in die Probenkammer 26 bereit. Beispielsweise kann der Sensor in Kontakt mit einem Bereich eines Tieres (einschließlich des Menschen) gebracht werden, das mit einer Lanzette für die Abnahme von Blut punktiert wurde. Das Blut wird mit dem Flachstecker 33 in Kontakt gebracht und über die Dochtwirkung des Sorbens 34 in die Probenkammer 26 gezogen. Der direkte Transfer der Probe zum Sensor ist dann besonders wichtig, wenn die Probe sehr klein ist, beispielsweise wenn die Lanzette verwendet wird, um einen Teil des Tieres zu punktieren, der nicht gut mit Kapillargefäßen, die nahe der Oberfläche liegen, versorgt ist und nur ein Volumen der Blutprobe von weniger als 1 μL liefert.
Es können andere Verfahren als die Dochtwirkung eines Sorbens eingesetzt werden, um die Probe in die Probenkammer oder in die Messzone zu transportieren. Beispiele für derartige Transportverfahren sind die Anwendung von Druck auf eine Probe, um sie in die Probenkammer zu drücken, die Erzeugung eines Vakuums in der Probenkammer über eine Pumpe oder ein anderes Vakuum-erzeugendes Mittel, um die Probe in die Kammer zu ziehen, eine Kapillarwirkung aufgrund der Grenzflächenspannung zwischen der Probe und den Wänden einer dünnen Probenkammer sowie die Dochtwirkung eines Sorbensmaterials.
Der Sensor kann auch zusammen mit einem fließenden Probenstrom verwendet werden. Bei dieser Konfiguration wird der Strom der Probe dazu gebracht, durch eine Probenkammer zu fließen. Der Fluss wird periodisch gestoppt, und die Konzentration des Analyten wird mittels eines elektrochemischen Verfahrens, beispielsweise Coulometrie, bestimmt. Nach der Messung wird der Fluss wieder frei gegeben, wodurch die Probe vom Sensor entfernt wird. Alternativ kann die Probe mit sehr geringer Geschwindigkeit durch die Kammer fließen, so dass der gesamte Analyt beim Durchgang elektrolysiert wird, was zu einem Strom führt, der nur von der Konzentration des Analyten und der Flussgeschwindigkeit abhängt.
Es können andere Füllstoffmaterialien verwendet werden, um die Messzone zu füllen und das Probenvolumen zu reduzieren. Beispielsweise können Glaskügelchen in der Messzone angeordnet werden, damit sie Platz besetzen. Vorzugsweise sind diese Füllstoffmaterialien hydrophil, so dass die Körperflüssigkeit leicht in die Messzone fließen kann. In einigen Fällen, beispielsweise bei Glaskügelchen mit einer großen Oberfläche, können diese Füllstoffmaterialien auch aufgrund ihrer großen Oberfläche und Hydrophilie die Körperflüssigkeit in die Messzone ziehen.
Die gesamte Sensoranordnung wird fest zusammengehalten, um sicher zu stellen, dass die Probe in Kontakt mit den Elektroden bleibt, und dass die Probenkammer und die Messzone das gleiche Volumen beibehalten. Das ist eine wichtige Überlegung für die Analyse einer Probe mittels Coulometrie, bei der die Messung eines definierten Probenvolumens erforderlich ist. Ein Verfahren, wie der Sensor zusammengehalten werden kann, ist in den 1 und 2 dargestellt. Es werden zwei Platten 38 an gegenüber liegenden Enden des Sensors bereit gestellt. Diese Platten bestehen typischerweise aus nicht-leitenden Materialien wie Kunststoff. Die Platten sind so konstruiert, dass sie mit dem Sensor zwischen den beiden Platten zusammengehalten werden können. Zu geeigneten Haltevorrichtungen gehören Klebstoffe, Klammern, Nieten und Bolzen, Schrauben und dergleichen.
Alternative Sensorkonstruktionen
Die 18A bis 18C zeigen eine alternative Sensorkonstruktion zur Bildung von dünnen Filmsensoren. Der Sensor umfaßt ein erstes Substrat 500, auf dem auf eine Arbeitselektrode 502 ausgebildet wird. Die Arbeitselektrode 502 umfaßt einen Kontaktbereich 503 zur Verbindung mit externer Elektronik. Ein Abstandshalter 504 (18B), wie z. B. eine Kleberschicht oder ein doppelseitiges Band definiert einen Kanal 506, um eine Probenkammer für den Sensor zu erzeugen. Zwei Gegen- (oder Gegen-/Bezugs)-elektroden 510, 512 sind auf einem zweiten Substrat 508 ausgebildet, wie in 18C gezeigt (invertiert mit Bezug auf die 18A und 18B, um die Elektrode andersrum zu zeigen). Diese mehrfache Gegenelektrodenanordnung kann eine Füllanzeigefunktion schaffen, wie unten beschrieben. Jede Gegenelektrode 510, 512 hat einen Kontaktbereich 511, 513 zur Verbindung mit externer Elektronik. Das zweite Substrat 508 ist invertiert und über dem ersten Substrat 500 angeordnet, wobei der Abstandshalter 504 dazwischen liegt, so dass die Arbeitselektrode 502 und die beiden Gegenelektroden 510, 512 sich in dem Bereich des Kanals 506 gegenüberliegen.
In einigen Fällen hat die Gegenelektrode 510, die einem Eingang 514 des Kanals 506 am nächsten liegt ein Oberflächengebiet in der Probenkammer, das zumindest zweimal größer als die andere Gegenelektrode 512 ist, und kann zumindest 5- oder 10-mal größer sein. Der nicht-auslaugbare oder diffundierbare Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel kann an entweder dem ersten oder zweiten Substrat 500, 508 in einem Bereich vorgesehen sein, der den Kanal 506 entspricht, wie oben beschrieben.
Die Arbeitselektrode und die Gegenelektroden können ausgebildet sein, um den gesamten Kanalbereich abzudecken (außer einem kleinen Raum zwischen den beiden Gegenelektroden). Bei dieser Ausführung sind die Probenkammer und die Messzone effektiv die gleichen und haben das gleiche Volumen. Bei anderen Ausführungen hat die Messzone z. B. 80% oder 90% des Volumens der Probenkammer. Es ist klar, dass ähnliche Sensoren gemacht werden können unter Verwendung einer Gegenelektrode oder drei oder mehr Gegenelektroden. Es ist auch klar, dass auch mehrere Arbeitselektroden auf dem Sensor vorgesehen werden können.
Ein Beispiel eines Verfahrens zum Herstellen der Dünnfilmsensoren ist mit Bezug auf die Sensoranordnung beschrieben, die in den 18A bis 18C gezeigt ist, und kann verwendet werden, um eine Vielfalt von anderen Sensoranordnungen herzustellen, einschließlich den vorher beschriebenen. Ein Substrat, wie z. B. ein Kunststoffsubstrat wird vorgesehen. Das Substrat kann ein einzelnes Blatt oder eine Endlosrolle auf einer Bahn sein. Dieses Substrat kann verwendet werden, um einen einzelnen Sensor herzustellen, oder um mehrere Sensoren herzustellen. Die mehreren Sensoren können auf einem Substrat 1000 als Arbeitselektroden 1010 und Gegenelektrode(n) 1020 ausgebildet werden. Bei einigen Ausführungen kann das Substrat eingekerbt und gefaltet werden, um die Arbeitselektroden 1010 und Gegenelektroden 1020 zusammenzubringen, um den Sensor zu bilden. Bei einigen Ausführungen, wie in 31A dargestellt, können die einzelnen Arbeitselektroden 1010 (und in einem separaten Schnitt die Gegenelektrode(n) 1020) nebeneinander auf dem Substrat 1000 ausgebildet werden, um Verschnittmaterial zu reduzieren, wie in 31A dargestellt. Bei anderen Ausführungen können die einzelnen Arbeitselektroden 1010 (und in einem separaten Schnitt die Gegenelektrode(n) 1020) voneinander beabstandet sein, wie in 31B dargestellt. Der Rest des Verfahrens für die Herstellung mehrerer Sensoren wird beschrieben, aber kann ohne weiteres modifiziert werden, um einzelne Sensoren auszubilden.
Kohlenstoff oder anderes Elektrodenmaterial (z. B. Metall, wie Gold oder Platin) wird auf dem Substrat ausgebildet, um eine Arbeitselektrode für jeden Sensor zu schaffen. Der Kohlenstoff oder anderes Elektrodenmaterial kann durch eine Vielfalt von Verfahren abgelagert werden, einschließlich Drucken einer Kohlenstoff- oder Metalltinte, Dampfabscheidung und anderen Verfahren.
Optional kann ein nicht-leitfähiges Material, wie z. B. eine nichtleitfähige Tinte, neben der Arbeitselektrode ausgebildet werden, um eine ebene Oberfläche entlang des Bewegungswegs der Probenflüssigkeit zu schaffen. Das nicht-leitfähige Material ist geeignet, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen, um das Befüllen durch die Kapillarwirkung zu erleichtern, und/oder um die Wahrscheinlichkeit zu reduzieren, dass Luftblasen neben der Arbeitselektrode eingefangen werden. Dieses nicht leitfähige Material kann farbig oder farblos sein, und kann auf dem Substrat durch Drucken oder andere Techniken ausgebildet werden. Das nichtleitfähige Material kann vor oder nach der Ausbildung der Arbeitselektrode abgelagert werden.
Die Gegenelektrode oder Gegenelektroden werden auf dem Substrat ausgebildet. Die Gegenelektrode(n) werden ausgebildet, indem Kohlenstoff oder anderes Elektrodenmaterial auf das Substrat abgelagert werden. Bei einer Ausführung ist das Material der Gegenelektrode(n) eine Ag/AgCl-Tinte. Das Material der Gegenelektrode(n) kann durch eine Vielfalt von Verfahren einschließlich Drucken oder Dampfabscheidung abgelagert werden. Bei einigen Ausführungen werden die Gegenelektroden ausgebildet unter Verwendung verschiedener Materialien und/oder eine Elektrode wird eine Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode und die andere Elektrode wird eine Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektrode. Bei einer Ausführung werden die Arbeitselektroden auf einer ersten Hälfte eines Polymerblatts oder einer Polymerbahn ausgebildet, und die Gegenelektroden werden auf einer zweiten Hälfte des Polymerblatts oder der Polymerbahn derart ausgebildet, dass das Blatt oder die Bahn gefaltet werden können, um die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode in einer gegenüberliegenden Anordnung übereinanderzulegen.
Ein zweites nicht-leitfähiges Material kann neben und/oder zwischen der (den) Gegenelektrode(n) aufgetragen werden, um eine ebene Oberfläche des Bewegungswegs entlang der Probenflüssigkeit zu schaffen. Das kann insbesondere in dem Bereich zwischen den Gegenelektroden wünschenswert sein, die Teil der Probenkammer sein werden, um die Oberfläche der Probenkammer einzuebnen. Das nicht-leitfähige Material ist geeignet, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen, damit das Einfüllen durch Kapillarwirkung erleichtert wird, und/oder um die Wahrscheinlichkeit zu reduzieren, dass Luftblasen zwischen oder neben der (den) Gegenelektrode(n) gefangen werden. Das nicht-leitfähige Material kann farbig oder farblos sein, und kann durch Drucken oder andere Techniken darauf ausgebildet werden. Das nicht-leitfähige Material kann vor oder nach der Bildung der Gegenelektrode(n) abgelagert werden.
Ein Klebstoffabstandshalter ist über zumindest einem von dem Substrat/der Arbeitselektrode und dem Substrat/der (den) Gegenelektrode(n) ausgebildet. Der Klebstoffabstandshalter kann eine einzelne Klebstoffschicht oder ein doppelseitiges Klebeband sein (z. B. ein Polymerträgerfilm mit Klebstoff, der auf gegenüberliegenden Oberflächen angeordnet ist). Um den Kanal zu bilden, kann der Abstandshalter, der optional mit einem oder mehreren Lösezwischenlagen versehen ist, geschnitten werden (z. B. druckgeschnitten), um den Abschnitt des Klebstoffs zu entfernen, der dem Kanal entspricht, vor dem Anordnen des Abstandshalter auf dem Substrat. Alternativ kann der Klebstoff gedruckt oder anderweitig auf dem Substrat gemäß einem Muster angeordnet werden, das den Kanalbereich definiert. Die Dicke des Abstandshalters bestimmt typischerweise den Abstand zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode. Wenn die Gleichförmigkeit dieses Abstands unter Sensoren notwendig ist (z. B. für coulometrische Messungen), ist die Gleichförmigkeit in der Dicke des Abstandshalters wichtig. Vorzugsweise variiert die Dicke nicht mehr als ±5% über den einzelnen Sensor und/oder unter einzelnen Sensoren in einer Charge.
Der nicht-auslaugbare oder diffundierbare Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel werden auf dem Substrat in zumindest dem Bereich der Probenkammer angeordnet. Wenn eine dieser Komponenten oder beide nicht auslaugbar sind, müssen diese Komponente oder diese Komponenten an der Arbeitselektrode angeordnet werden. Wenn eine dieser Komponenten oder beide diffundierbar sind, können die Komponente oder die Komponenten an einer beliebigen Oberfläche des Substrats in dem Kanalbereich angeordnet werden. Der Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel können unabhängig voneinander oder zusammen auf dem Substrat vor oder nach der Anordnung des Abstandshalters angeordnet werden. Der Redoxmediator und/oder die zweiten Elektronenübertragungsmittel können auf eine Vielfalt von Verfahren angeordnet werden, einschließlich zum Beispiel Musterdrucken, Tintenstrahldrucken, Sprühen, Mahlen, Abstreifen entlang einer Reihe oder Zeile ausgerichteter und/oder benachbarter Elektroden und dergleichen. Weitere Komponenten können getrennt oder mit dem Redoxmediator und/oder dem zweiten Elektronenübertragungsmittel aufgetragen werden, einschließlich Tensiden, Polymeren, Polymerfilmen, Konservierungsmittel, Binder, Puffer und Vernetzer.
Nach dem Anordnen des Abstandshalters, des Redoxmediators und der zweiten Elektronenübertragungsmittel kann das Substrat gefaltet werden, um den Sensor zu bilden. Die Flächen des Substrats werden durch den Klebstoff des Abstandshalters verbunden. Nachdem die Flächen zusammengebracht wurden, kann der Sensor unter Verwendung einer Vielfalt von Verfahren geschnitten werden, einschließlich zum Beispiel Druckschneiden, Schlitzen oder anderweitiges Wegschneiden des Überschußsubstratmaterials und Trennen der einzelnen Sensoren. Bei einigen Ausführungen kann zum Beispiel eine Kombination der Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können einige Merkmale druckgeschnitten werden, während der Rest des Sensors durch Schlitzen geschnitten wird. Als eine weitere Alternative können die Sensorkomponenten (z. B. die in 18A und 18C gezeigten Komponenten) zuerst aus dem Substrat ausgeschnitten werden, und dann zusammengebracht werden, um den Sensor durch Klebeverbinden der beiden Komponenten unter Verwendung des Abstandshalterklebstoff zu bilden.
Die Ausführung eines in den 18A bis 18C dargestellten Sensors ist ein Beispiel eines Spitzenfüllsensors. Eine alternative Sensorkonstruktion ist in den 19A bis 19C dargestellt. Dieses ist ein Seitenfüllsensor. 19A zeigt ein erstes Substrat 520 mit einer Arbeitselektrode 522. 19B zeigt einen Abstandshalter 524, der einen Kanal 526 definiert. 19C (invertiert bezüglich der 19A und 19B, um die Elektroden darzustellen) zeigt ein zweites Substrat 528 mit drei Gegen- (oder Gegen-/Bezugs) -elektroden 530, 532, 534.
Dieser Sensor kann wie oben beschrieben hergestellt werden. Die symmetrische Anordnung der Gegenelektroden erlauben es, den Sensor von entweder der linken oder der rechten Seite zur Bequemlichkeit von links- oder rechtshändigen Personen zu befüllen. Es ist jedoch klar, dass ähnliche Sensoranordnungen unter Verwendung von einer, zwei oder vier oder mehr Gegenelektrode(n) und/oder zwei oder mehr Arbeitselektroden ausgebildet werden können. Die verjüngten Bereiche 536, 538 können zum Beispiel durch Druckschneiden ausgebildet werden, und können zumindest in einigen Fällen genau gesteuert werden, um eine reproduzierbare Kanallänge zu schaffen. Als eine alternative Anordnung können die Seiten des Sensors gerade sein, um es dem Sensor zu ermöglichen, aus dem Rest des Substrats und/oder aus anderen Sensoren ausgeschnitten zu werden, indem das Substrat in parallele Richtungen unter Verwendung zum Beispiel eines Baumschneidesystems zu schlitzen. Wie in den 19A, 19B und 19C dargestellt, können die Ränder des Sensors Ränder der Probenkammer und/oder der Messzone definieren. Durch genaues Regeln des Abstands zwischen Schnitten, kann die Variabilität in dem Probenkammervolumen oft reduziert werden. In einigen Fällen werden diese Schnitte vorzugsweise parallel zueinander sein, weil parallele Schnitte das einfachste sein kann, um eine Reproduzierbarkeit herzustellen.
Die 20A, 20B und 20C zeigen ein weiteres Beispiel einer von der Seite zu befüllenden Sensoranordnung. 20A zeigt ein erstes Substrat 540 mit einer Arbeitselektrode 542. 20B zeigt einen Abstandshalter 544, der einen Kanal 546 definiert. 20C (invertiert bezüglich der 20A und 20B) zeigt ein zweites Substrat 548 mit drei Gegen- (oder Gegen-/Bezugs) -elektroden 550, 552, 554.
Die 21A, 21B und 21C zeigen ein weiteres Beispiel einer von der Spitze zu befüllenden Sensoranordnung. 21A zeigt ein erstes Substrat 560 mit einer Arbeitselektrode 562. 21B zeigt einen Abstandshalter 564, der einen Kanal 566 definiert. 21C (invertiert bezüglich der 21A und 21B) zeigt ein zweites Dünnfilmsubstrat 568 mit zwei Gegen- (oder Gegen-/Bezugs) -elektroden 570, 572. Ein Belüftungsloch 574 (angezeigt als ein schattierter Bereich in 21C) ist durch das zweite Substrat vorgesehen. Bei der dargestellten Ausführung ist dieses Belüftungsloch 574 nur durch das Substrat 568 ausgebildet, das die Gegenelektrode(n) trägt, und optional dem Abstandshalter 564. Bei dieser Ausführung kann das Belüftungsloch z. B. durch Druckschneiden eines Abschnitts des Substrat ausgebildet werden. Dieses Druckschneiden kann einen Abschnitt von zumindest einer Gegenelektrode entfernen, aber eine hinreichende Menge der Gegenelektrode sollte zum Kontakt mit der Probe in dem Kanal und für den elektrischen Anschluss an einen Kontakt an dem anderen Ende des Sensors verbleiben. Bei einer weiteren Ausführung kann das Belüftungsloch 579 durch alle Schichten gemacht werden, oder durch das erste Substrat und nicht durch das zweite Substrat.
Eine weitere Ausführung ist in den 22A, 22B und 22C mit einer anderen Form gezeigt. Dieser Sensor umfaßt ein erstes Substrat 579 mit zumindest einer Arbeitselektrode 580, wie in 22A gezeigt. Der Sensor umfaßt auch einen Abstandshalter 581 mit einem Kanal 582, der in dem Abstandshalter 581 ausgebildet ist, wie in 22B gezeigt. Der Sensor umfaßt des weiteren ein zweites Substrat 583 mit zwei Gegenelektroden 584, 585, wie in 22C gezeigt (invertiert bezüglich der 22A und 22B). Eine Belüftungsöffnung 586 ist typischerweise durch alle Schichten geschnitten und erstreckt sich von einer Seite des Sensors. Bei einigen Ausführungen werden die Belüftungsöffnung und der Vorderabschnitt 587 des Sensors gleichzeitig mit einem reproduzierbaren Abstand zwischen der Belüftungsöffnung und dem Vorderabschnitt 587 des Sensors geschnitten, um eine reproduzierbare Länge für den Kanal 582 und die Arbeitselektrode 580 zu schaffen. Die 22A, 22B und 22C zeigen auch ein weiteres Merkmal, das mit einer beliebigen Sensoranordnung verwendet werden kann. Eine Einprägung 588 kann an der Befüllöffnung des Kanals 582 ausgebildet werden, um das Einsaugen von Flüssigkeit in den Sensor zu erleichtern. Bei dieser Konfiguration wird die Flüssigkeit nicht mit einer flachen Seite versehen, sondern eher eine eingeprägte Fläche, die beim Befüllen des Kanals (d. h. der Probenkammer) mit der Docht- oder Kapillarwirkung helfen kann. Diese Konfiguration kann auch die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass der Benutzer des Sensors den Kanal während des Sammelns der Probe blockieren wird. Ein flachseitiger Sensor kann blockiert werden, indem die Spitze des Sensors mit dem Rand gegen die Haut gepreßt wird.
23A, 23B und 23C zeigen ein weiteres Beispiel einer von der Seite zu befüllenden Sensoranordnung. 23A zeigt ein erstes Substrat 640 mit einer Arbeitselektrode 642. 23B zeigt einen Abstandshalter 644, der einen Kanal 646 definiert. 23C (invertiert bezüglich der 23A und 23B) zeigt ein zweites Substrat 648 mit drei Gegen-(oder Gegen-/Bezugs)-elektroden 650, 652, 654. Dieser Sensor kann ausgebildet werden, indem gerade Schnitte der Substrate gemacht werden. Die Sensoren können benachbart zueinander gemacht werden, wie in 31A gezeigt, was weniger Abfallmaterial erzeugen kann. Die Länge des Kanals 646 ist typischerweise durch die zwei parallelen Schnitte entlang der Seiten 656, 658 der Sensoren definiert. Ein anderer optionaler Verarbeitungsvorteil, insbesondere wenn die Sensoren benachbart zueinander ausgebildet werden, besteht darin, dass der Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel in dem Kanal angeordnet werden können, indem ein ununterbrochener Strom dieser Komponenten entlang einer Reihe oder Zeile benachbarter Sensoren ausgebildet wird. Das kann zu einer besseren Effizienz und weniger Abfall von dem Redoxmediator und/oder dem zweiten Elektronenübertragungsmittel führen, im Vergleich zu anderen Techniken, wie zum Beispiel einzelnes Anordnen dieser Komponenten in den einzelnen Kanälen.
Die 24A, 24B und 24C zeigen eine weitere Sensorkonfiguration. Dieser Sensor umfaßt ein erstes Substrat 600 mit zumindest einer Arbeitselektrode 602, wie in 24A gezeigt. Der Sensor umfaßt auch einen Abstandshalter 604 mit einem Kanal 606, der in dem Abstandshalter 604 ausgebildet ist, wie in 24B gezeigt. Der Sensor umfaßt ferner ein zweites Substrat 608 mit zwei Gegenelektroden 610, 612, wie in 24C gezeigt (invertiert bezüglich der 24A und 24B). Der Sensor kann auch zum Beispiel eine Anzeige umfassen, wie einen Schlitz 614 oder einen Fortsatz 616 aus dem Körper des Sensors, der dem Benutzer anzeigt, welche Seite benachbart zu der Probe angeordnet werden sollte. Das kann insbesondere wichtig sein, wenn der Sensor nur richtig ausgelesen wird, wenn die Probe von einer bestimmten Seite eintritt.
24B zeigt auch ein weiteres optionales Merkmal, das bei jeder der Sensorkonfiguration verwendet werden kann. Bei dieser Darstellung ist die Probenkammer 606 nicht unter Verwendung von geraden Linien ausgebildet, sondern es gibt einen erweiterten Bereich 618 in der Probenkammer. Das erlaubt größere Probenkammern ohne das Ausbilden größerer Öffnungen. Dieser erweiterte Bereich kann in einer beliebigen Form einschließlich kreisförmigen, quadratischen, rechteckigen und anderen regulären und irregulären Formen ausgebildet sein.
25 zeigt ein Beispiel eines zusammengesetzten Sensors, das eine weitere alternative Sensoranordnung für einen von der Seite zu befüllenden Sensor 620 darstellt. Dieser Sensor umfaßt Fortsätze 622 von dem Sensorkörper 624, um einem Benutzer anzuzeigen, wo die Öffnungen der Probenkammer 626 vorgesehen sind.
Ein optionales Merkmal ist in 32 dargestellt, die eine Seitenansicht des Sensors von der Innenseite des Messgeräts zeigt. 32 zeigt ein erstes Substrat 1120 und ein zweites Substrat 1130, die sich in das Messgerät von dem Rest des Sensors 1100 erstrecken (d. h. Abschnitt 1140 ist bezüglich der Substrat 1120 und 1130 in 32 zurückgesetzt). Beispiele dieser Konfiguration sind in den 18A bis 18C und 24A bis 24C dargestellt. Typischerweise ist der Sensor 1100 an ein Messgerät 1110 angekoppelt, das Kontaktflächen (nicht gezeigt) umfaßt, die die Kontaktbereiche (z. B. die Bereiche 503, 511 und 513 in den 18A und 18C) der Elektroden des Sensors 1100 kontaktieren. Das Ende des Sensors 1100, das die Kontaktbereiche enthält, kann in das Messgerät 1110 geschoben werden. Es ist typischerweise wichtig, dass die Kontaktflächen des Messgeräts 1110 Kontakt mit den richtigen Kontaktbereichen des Sensors machen, so dass die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode(n) richtig an das Messgerät angeschlossen sind. In einigen Fällen ist der Sensor derart konfiguriert, dass der Kontaktbereich für die Arbeitselektrode auf dem ersten Substrat 1120 eine andere Breite w1 als die Breite w2 für den Kontaktbereich des zweiten Substrats 1130 hat, der die Gegenelektrode(n) trägt. Beispiele von Elektrodenkonfigurationen mit dieser Struktur sind in 18A bis 18C und 24A bis 24C angegeben. Um dieses richtige Einsetzen des Sensor 1100 in das Messgerät 1110 zu gewährleisten, kann das Messgerät 1110 ein erhabenes Gebiet 1140 umfassen, das das Einsetzen des Sensors in einer nicht richtigen Ausrichtung verhindert oder behindert. Zum Beispiel kann die Breite w2 des Kontaktbereiches des zweiten Substrats 1130 breiter als die Breite w1 des Kontaktbereichs des ersten Substrats 1120 sein, wie in 32 dargestellt. In diesem Fall ist das erhabene Gebiet 1140 angeordnet, damit der Sensor 1100 in das Messgerät derart geschoben werden kann, dass das erste Substrat 1120 neben der Oberfläche 1150 liegt, von der der erhabene Bereich 1140 vorsteht, aber verhindern oder behindern würde, dass das zweite Substrat 1130 neben der Oberfläche 1150 sein würde, von der das erhabene Gebiet 1140 vorsteht. Andere Objekte als ein erhabenes Gebiet können auch verwendet werden, um den Benutzer bei dem richtigen Einführen des Sensor für das Messgerät zu leiten.
Integrierte Vorrichtung zur Probenahme und Bestimmung des Analyten
Viele Ansätze sind im Stand der Technik bekannt, um eine kleine Probe aus einem Körper zu einem Sensor zu entnehmen und/oder zu transportieren. Diese umfassen zum Beispiele die US-Patente Nr. 5,746,217; 5,820,570; 5,857,983 und 5,879,311. Jedes dieser Verfahren zur Probennahme und/oder Transportieren der Probe kann mit dem Sensor der vorliegenden Erfinder eingesetzt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt eine Vorrichtung 52 zur Messung des Analyten gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung einen Sensor 20 ein, wie er weiter oben beschrieben wurde, in Kombination mit einer Vorrichtung 50 für die Probenahme, um so eine integrierte Vorrichtung für die Probenahme und Messung bereit zu stellen. Die Vorrichtung 50 zur Probenahme, die in der 6 dargestellt ist, schließt beispielsweise ein Bauteil 54 für das Punktieren der Haut ein, beispielsweise eine Lanzette, die an einem elastischen, biegsamen Streifen 56 (oder einer ähnlichen Vorrichtung, wie einer Feder) angebracht ist, der angestoßen werden kann, um die Lanzette in die Haut des Patienten zu stechen und einen Blutfluss zu verursachen.
Der elastische Streifen 56 wird dann freigegeben, und das Bauteil 54 zum Anstechen der Haut zieht sich zurück. Das Blut, das aus dem durch das Element 59 angestochenen Bereich der Haut fließt, kann dann beispielsweise über die Dochtwirkung des Sorbensmaterials 34 für die Analyse des Analyten in den Sensor 20 transportiert werden. Die Vorrichtung 52 zur Messung des Analyten kann dann in ein Lesegerät gegeben werden, das nicht gezeigt ist, und das ein Coulometer oder eine andere Ausrüstung zur elektrochemischen Analyse mit den Elektrodensteckern 23, 25 verbindet, um die Konzentration des Analyten durch elektroanalytische Verfahren zu bestimmen. Vorzugsweise ist die Analytenmessvorrichtung in dem Leser aufgenommen, wenn er an das Coulometer oder weitere elektrochemische Analyseausrüstung angeschlossen ist.
Bei einer bevorzugten Ausführung umfaßt die integrierte Vorrichtung zur Probennahme und Bestimmung des Analyten ein Lanzetteninstrument, das eine Lanzette und einen Messstreifen enthält. Das Lanzetteninstrument erfordert vorzugsweise ein aktives Spannen. Wenn der Benutzer die Vorrichtung vor der Verwendung spannen muss, ist das Risiko einer unabsichtlichen Auslösung der Lanzette minimiert.
Vorzugsweise wird das Lanzetteninstrument automatisch ausgelöst, wenn das Lanzetteninstrument fest gegen die Haut mit einer angemessenen Druckmenge gepreßt wird. Wie es bereits im Stand der Technik bekannt ist, wird eine große Probe an Körperflüssigkeit, wie z. B. Blut oder Lymphflüssigkeit ausgedrückt, wenn Druck um ein Gebiet ausgeübt wird, wo ein Loch in der Haut erzeugt wurde. Siehe zum Beispiel die oben erwähnten US-Patente für Integ und Amira ebenso wie die Spitzenkonstruktion der Lanzetteninstrumente, die von Becton Dickenson verkauft werden. Alle diese Lanzettenvorrichtungen haben einen vorspringenden Ring, der das angestochene Gebiet umgibt, um Druck zu erzeugen, der die Probe aus der Wunde treibt. Jedoch erfordern alle diese Vorrichtungen, dass der Benutzer einen angemessenen Druck auf das Wundengebiet ausübt, um die Probe herauszudrücken, und alle Lanzetteninstrumente werden durch einen Knopfdruck von dem Benutzer ausgelöst. Die Konstruktion eines geeigneten Druckauslösers ist einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Vorzugsweise wird das Lanzetteninstrument es dem Benutzer auch erlauben, die Eindringtiefe der Lanzette in die Haut einzustellen. Derartige Vorrichtungen sind bereits kommerziell von Firmen erhältlich, wie z. B. Böhringer Mannheim und Palco. Dieses Merkmal erlaubt es Benutzern, die Lanzettenvorrichtung für Unterschiede bei der Hautdicke, Hauthärte und Schmerzempfindlichkeit über verschiedene Gegenden an den Körper und über verschiedene Benutzer einzustellen.
Bei einer bevorzugteren Ausführung sind das Lanzetteninstrument und der Testausleser in einer einzigen Vorrichtung integriert. Um die Vorrichtung zu betreiben, muß der Benutzer nur eine Einwegkartusche in die integrierte Vorrichtung einsetzen, die einen Messstreifen und eine Lanzetteninstrument enthält, das lanzierende Instrument spannen, es gegen die Haut drücken, um es zu aktivieren, und das Ergebnis der Messung ablesen. Ein derartiges integriertes Lanzetten- und Testausleseinstrument vereinfacht das Testverfahren für den Benutzer und minimiert die Handhabung von Körperflüssigkeiten.
26 zeigt ein weiteres Beispiel einer integrierten Probennahme- und Sensorvorrichtung 700. Die integrierte Probennahme- und Sensorvorrichtung umfaßt ein Gehäuse 702, ein Hautpunktierglied (z. B. eine Lanzette) 704, eine Punktier-/Sammelöffnung 706, einen optional entfernbaren Sensor 708, eine Sensorführung 710 und einen Zurückziehmechanismus 714 für das Hautpunktierglied. Diese Vorrichtung 700 kann für eine Wiederverwendung (z. B., indem das Hautpunktierglied 704 und der Sensor 708 entfernbar gemacht werden) oder für eine einzige Verwendung aufgelegt werden.
Das Gehäuse 702 kann aus einer Vielfalt von Materialien, einschließlich Metall und Kunststoff ausgebildet werden. Das Gehäuse 702 kann ein Scharnier 716 oder eine andere Konfiguration enthalten (z. B. Klebstoff oder Verbindungsteile), um Abschnitte des Gehäuses zusammenzuhalten.
Die Punktier-/Sammelöffnung 706 ist in dem Gehäuse 702 vorgesehen, um es dem Hautpunktierglied 704 zu erlauben, sich durch die Öffnung 706 zu erstrecken und die Haut eines Benutzers zu punktieren, um dadurch eine Strömung von Blut (oder einer anderen Körperflüssigkeit) zu bewirken. Der Sensor 708 erstreckt sich auch zu dem Rand oder über die Öffnung 706, um das Blut (oder eine andere Körperflüssigkeit) durch eine Öffnung (nicht gezeigt) in der Spitze des Sensors zu sammeln. Das kann es dem Benutzer erlauben, die Haut zu punktieren und die Flüssigkeitsprobe ohne die Vorrichtung 700 zu bewegen zu sammeln. Alternativ können getrennte Öffnungen für das Hautpunktierglied 704 und den Sensor 708 vorgesehen werden. Die Sensorführung kann in dem Gehäuse 702 ausgebildet oder zu dem Gehäuse hinzugefügt werden, um den Sensor 708 an seinen Platz zu führen, wenn der Sensor in und durch das Gehäuse eingesetzt wird und/oder um den Sensor in dem Gehäuse und während der Probenahme zu halten.
Das Hauptpunktierglied 704 kann ein Betätigungsglied (nicht gezeigt) umfassen, der einen Mechanismus enthält, der das Spannen und Freigeben des Hautpunktierglieds 704 ermöglicht, oder das Hautpunktierglied kann extern betätigt werden. Zum Beispiel kann der Sensorleser (nicht gezeigt) oder eine andere Vorrichtung an die Probennahme und Sensorvorrichtung gekoppelt sein, wobei der Sensorleser oder die weitere Vorrichtung einen Mechanismus enthält, der das Hautpunktierglied 704 spannt und/oder freigibt.
Der Zurückziehmechanismus 714 der Vorrichtung 700 kann zum Beispiel eine Feder oder ein elastischer Metallstreifen sein, der das Hautpunktierglied 704 zurück in das Gehäuse zieht, nachdem die Haut des Benutzers punktiert wurde. Das kann die unbehinderte Probennahme ermöglichen und/oder ein weiteres Punktieren der Haut des Benutzers oder anderer verhindern, um die Verunreinigung oder Infektion zu verhindern, die durch die Übertragung von Körperflüssigkeiten oder anderer schädlicher Mittel verursacht wird. Alternativ kann das Zurückziehen des Hautpunktierglieds erreicht werden, indem eine externe Vorrichtung oder ein externer Apparat verwendet wird.
Ein Betriebsbeispiel umfaßt das Spannen des Hautpunktierglieds 704 und dann das Freigeben des Hautpunktierglieds 704, so dass es sich aus dem Gehäuse 702 durch die Punktier-/Sammelöffnung 706 erstreckt und die Haut des Benutzers punktiert. Das Hautpunktierglied 704 schiebt optional den Sensor aus dem Weg, während es sich aus dem Gehäuse erstreckt. Das Hautpunktierelement 704 wird in das Gehäuse 702 unter Verwendung des Zurückziehmechanismus 714 zurückgezogen. Beim Zurückziehen des Hautpunktierelements sammelt der Sensor eine Probenflüssigkeit aus der punktierten Haut durch eine Öffnung in dem Sensor 708.
Wenn ein Sensorleser verwendet wird, kann der Sensorleser auch ausgelegt sein, um mit einem Kontaktende des Sensors gekoppelt zu sein. Der Sensorleser kann einen Potentiostaten oder eine andere Komponente umfassen, um ein Potential und/oder einen Strom für die Elektroden des Sensors bereitzustellen. Der Sensorleser kann auch einen Prozessor umfassen (z. B. einen Mikroprozessor oder Hardware), um die Konzentration des Analyten aus den Sensorsignalen zu bestimmen. Der Sensorleser kann eine Anzeige oder einen Anschluss umfassen, um eine Anzeige an den Sensor anzuschließen. Die Anzeige kann die Sensorsignale und/oder Ergebnisse anzeigen, die aus den Sensorsignalen bestimmt wurden, einschließlich zum Beispiel der Konzentration des Analyten, der Änderungsgeschwindigkeit der Konzentrationen des Analyten und/oder das Überschreiten eines Schwellwerts der Konzentration des Analyten (die z. B. Unter- oder Überzuckerung anzeigt). Der Sensorleser kann in Verbindung mit der integrierten Probennahme und Sensorvorrichtung verwendet werden, oder der Sensorleser kann mit dem Sensor alleine verwendet werden, wobei die Kontakte des Sensors eine Verbindung mit Kontakten in dem Sensorleser herstellen.
Betrieb des Sensors
Ein elektrochemischer Sensor der Erfindung kann mit oder ohne Anlegen eines Potentials betrieben werden. Bei einer Ausführung tritt die elektrochemische Reaktion spontan auf, und ein Potential muß nicht zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angelegt werden.
Bei einer weiteren Ausführung wird ein Potential zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angelegt. Dennoch muß das Potential nicht konstant bleiben. Die Größe des erforderlichen Potentials hängt von dem Redoxmediator ab. Das Potential, bei dem sich die Elektrode selbst im Gleichgewicht hält, oder wo sie im Gleichgewicht gehalten wird, indem eine externe Vorspannung angelegt wird, und bei der der Analyt elektrolysiert wird, ist typischerweise derart, dass die elektrochemische Reaktion vollständig oder nahezu vollständig abgelaufen gelassen wird, aber es ist vorzugsweise nicht oxidierend genug, um eine nennenswerte elektrochemische Reaktion störender Agenzien, beispielsweise von Urat, Ascorbat und Acetaminophen zu induzieren, die das gemessene Signal beeinflussen können. Für nicht-auslaugbare Redoxmediatoren liegt das Potential typischerweise zwischen ungefähr –350 mV und ungefähr +400 mV gegenüber der Standard-Calomel-Elektrode (SCE). Vorzugsweise ist das Potential des Redoxmediators negativer als +100 mV, bevorzugter ist das Potential negativer als 0 mV und am bevorzugtesten ist das Potential ungefähr –150 mV gegenüber SCE.
Wenn ein externes Potential angelegt wird, kann es, entweder bevor oder nachdem die Probe in der Probenkammer angeordnet wurde, angelegt werden. Wenn die Messzone nur einen Abschnitt der Probenkammer umfaßt, dann wird das Potential vorzugsweise angelegt, nachdem die Probe in der Probenkammer zur Ruhe gekommen ist, um eine Elektrolyse der Probe zu verhindern, die durch die Messzone tritt, wenn die Probenkammer gefüllt wird. Alternativ, in dem Fall, wo die Messzone das Meiste der oder die gesamte Probenkammer umfaßt, kann das Potential optional vor oder während des Befüllens der Probenkammer angelegt werden, ohne die Genauigkeit der Untersuchung zu beeinflussen. Wenn das Potential angelegt wird und sich die Probe in der Messzone befindet, dann fließt ein elektrischer Strom zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode. Der Strom ist zumindest zum Teil ein Ergebnis der Elektrolyse des Analyten in der Probe. Diese elektrochemische Reaktion erfolgt über den Redoxmediator und das optionale zweite Elektronenübertragungsmittel. Für viele Biomoleküle B wird der Prozess durch die folgende Reaktionsgleichung beschrieben:
nA(red) → nA(ox) + ne^– (2)
Die biochemische Substanz B wird durch die Redoxmediatorspezies A in Gegenwart eines geeigneten Enzyms zu C oxidiert. Dann wird der Redoxmediator A an der Elektrode oxidiert. Die Elektronen werden durch die Elektrode gesammelt, und der resultierende Strom wird gemessen. Der gemessene Strom kann auch einen Hintergrundstrom umfassen, der zu einer gemessenen Hintergrundladung führt, aufgrund zumindest zum Teil des Hin- und Herbewegens eines diffundierbaren Redoxmediators zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode. Dieser Hintergrundstrom kann minimiert oder wie unten beschrieben berücksichtigt werden.
Es basiert, um ein Beispiel zu nennen, ein Sensor der vorliegenden Erfindung auf der Reaktion eines Glucose-Moleküls mit zwei [Os(dmo-phen)₂(NMI)Cl]²⁺-Kationen, wobei dmo-phen 4,8-Dimethoxyphenanthrolin ist und NMI N-Methyl-imidazol ist, in der Gegenwart von Glucoseoxidase, um zwei [Os(dmo-phen)₂(NMI)Cl]⁺-Kationen, zwei Protonen und ein Oxidationsprodukt von Glucose, zum Beispiel Gluconolacton oder ein anderes Keton, zu erzeugen. Die Menge der vorhandenen Glucose wird durch die Elektrooxidation der [Os(dmo-phen)₂(NMI)Cl]⁺-Kationen zu [Os(dmo-phen)₂(NMI)Cl]²+-Kationen und die Messung der gesamten übergetretenen Ladung bestimmt.
Fachleuten auf diesem Gebiet wird klar sein, dass es viele verschiedene Reaktionsmechanismen gibt, die zum gleichen Ergebnis führen, nämlich die Elektrolyse eines Analyten über einen Reaktionsweg, der einen Redoxmediator enthält. Die Gleichungen (1) und (2) sind ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine derartige Reaktion.
Coulometrie
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Coulometrie eingesetzt, um die Konzentration des Analyten zu bestimmen. Diese Messtechnik setzt Strommessungen ein, die in gewissen Abständen während des Verlaufes des Tests erhalten werden, um die Konzentration des Analyten zu bestimmen. Diese Strommessungen werden über die Zeit integriert, um die Ladungsmenge Q zu erhalten, die auf die Elektrode übergegangen oder aus ihr ausgetreten ist. Q wird dann dazu verwendet, die Konzentration (C_A) des Analyten mittels der folgenden Gleichung zu berechnen (wenn der Redox-Mediator nicht-auslaugbar ist): CA = Q/nFV (3a)wobei n die Zahl der Elektronen-Äquivalente ist, die für die Elektrolyse des Analyten benötigt werden, F die Faraday-Konstante (ungefähr 96500 Coulomb pro Äquivalent) ist, und V das Volumen der Probe in der Messzone ist. Wenn ein diffundierbarer Mediator verwendet wird, kann die Konzentration des Analyten aus der folgenden Gleichung erhalten werden: CA = (Qtot – Qback)/nFV (3b)wobei Q_tot die Gesamtladung ist, die während der Messung übertragen wurde, und Q_back die Menge der übertragenen Ladung ist, die nicht aufgrund des Analyten erfolgte, z. B. Ladung, die durch das Hin- und Herbewegen des diffundierbaren Mediators zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode übertragen wurde. Bei zumindest einigen Fällen ist der Sensor derart aufgebaut, dass die Hintergrundladung höchstens 5-mal die Größe der Ladung ist, die durch Elektrolyse einer Analytenmenge erzeugt wird. Vorzugsweise ist das Hintergrundsignal höchstens 200%, 100%, 50%, 25%, 10% oder 5% der Ladung, die durch Elektrolyse des Analyten erzeugt wird.
Ein Beispiel eines Verfahrens zum Bestimmen des Verhältnisses von dem Hintergrundsignal zu dem Signal, das durch Elektrolyse des Analyten erzeugt wird, wird wie folgt für die gegenüberliegenden Elektrodenpaare beschrieben. Wenn das Hin- und Herbewegen des Redoxmediators nicht durch das anliegende Potential unterbunden wird, kann die Ladung, die aus dem Hin- und Herbewegen des Redoxmediators folgt, durch die folgende Gleichung dargestellt werden: Qback – (AFDMCM/d)(tnM)wobei A die Fläche der Arbeitselektrode ist; F die Faraday-Konstante (96500 Coulombs/Äquivalent) ist; D_M der effektive Diffusionskoeffizient des Redoxmediators ist; C_M die Konzentration des Redoxmediators in der Messzone ist; d der Abstand ist, durch den die gegenüberliegenden Elektroden getrennt sind; t die Zeitdauer für die Messung ist; und n_M die Anzahl von Elektronen ist, die auf den Redoxmediator übertragen wurden oder ihm verlorengingen.
Zusätzlich kann die Ladung des Analyten, z. B. Glucose, wenn der Analyt bis ungefähr 90% Abschluss der Messdauer elektrooxidiert wird, durch die folgende Gleichung dargestellt werden. QG = Ad(0,90)CGnGFwobei A die Fläche der Arbeitselektrode ist; d der Abstand ist, der die gegenüberliegenden Elektroden trennt; C_G die Konzentration von Glucose ist; n die Anzahl von Elektronen ist, die benötigt werden, um den Analyten zu elektrolysieren (z. B. 2 Elektronen pro Molekül Glucose); und F die Faraday-Konstante ist. Wenn C_G 5 mM (oder 5 × 10^–6 mol/cm³) ist, t 60 Sekunden ist, n_G 2 ist und nM 1 ist, kann das Verhältnis von Ladung von dem Redoxmediator zu der Ladung aus der Elektrooxidation des Analyten durch die folgende Gleichung dargestellt werden: QBack/QG = (DMCM/d2)(tnM/(0,9 nGCG)) = (DMCM/d2) × (6,7 × 106)
Wenn zum Beispiel das Verhältnis von Q_Back/Q_G 5 ist, dann ist (D_MC_M)/d₂ 7,5 × 10^–7 mol/(cm³/s). Wenn auch zum Beispiel das Verhältnis von Q_Back/Q_G 1 ist, dann ist (D_MC_M)/d² 1,5 × 10^–7 mol/(cm³/s). Wenn gemäß einem noch weiterem Beispiel das Verhältnis 0,1 ist, dann ist (D_MC_M)/d² 1,5 × 10^–8 mol(cm³/s). Somit kann in Abhängigkeit von dem gewünschten Verhältnis ein Sensor konfiguriert werden, um das gewünschte Verhältnis aufzuweisen, indem D_M, C_M und d entsprechend gewählt werden. Zum Beispiel kann die Konzentration des Redoxmediators reduziert werden (d. h. C_M kann reduziert werden). Alternativ oder zusätzlich kann die Diffusion des Redoxmediators reduziert werden, indem zum Beispiel eine Schwelle für den Fluss des diffundierbaren Mediators zu der Gegenelektrode geschaffen wird (d. h., dass der effektive Diffusionskoeffizient des Redoxmediators D_M reduziert wird). Weitere Sensorkonfigurationen sind auch geeignet, um das Verhältnis von dem Hintergrundsignal zu dem Signal zu regeln, das durch den Analyten erzeugt wird, und unten beschrieben wird.
Die Hintergrundladung Q_back kann auf verschiedene Weisen berücksichtigt werden. Q_back kann klein gemacht werden, zum Beispiel durch Verwenden nur einer begrenzten Menge an diffundierbaren Redoxmediator; durch Bereitstellen einer Membran über der Gegenelektrode, die die Diffusion des Redoxmediators zu der Gegenelektrode begrenzt; oder durch Vorsehen eines relativ kleinen Potentialunterschieds zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode. Andere Beispiele von Sensorkonfigurationen und Verfahren, die geeignet sind, um Q_back zu vermindern, umfassen die bereits beschriebenen, wie Sensoren mit einer Redoxmediator-Reaktionsgeschwindigkeit an der Arbeitselektrode, die erheblich schneller als die an der Gegenelektrode ist; Immobilisieren des Redoxmediators auf der Arbeitselektrode; Vorsehen, dass der Redoxmediator auf der Gegen- oder Gegen-/Bezugseleketorde bei seiner Reaktion an der Gegen- oder Gegen-/Bezugs elektrode immobilisiert wird; oder Verlangsamen der Diffusion des Redox-Mediators.
Alternativ kann der Sensor individuell oder pro Charge kalibriert werden, um eine Kalibrationskurve oder einen Wert für Q_back zu bestimmen. Eine andere Option ist es, ein zweites Elektrodenpaar aufzunehmen, dem ein Gegenstand fehlt, der für Elektrolyse des Analyten notwendig ist, wie z. B. das zweite Elektronenübertragungsmittel, so dass das gesamte Signal von diesem zweiten Elektrodenpaar Q_back entspricht.
Für coulometrische Messungen wird zumindest 20% des Analyten elektrolysiert. Vorzugsweise werden mindestens 50%, bevorzugter mindestens 80% und noch bevorzugter mindestens 90% des Analyten elektrolysiert. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird der Analyt vollständig oder nahezu vollständig elektrolysiert. Die Ladung wird dann aus Strommessungen berechnet, die während der elektrochemischen Reaktion durchgeführt werden, und die Konzentration des Analyten wird mittels der Gleichung (3a) oder (3b) bestimmt. Der vollständige Ablauf der elektrochemischen Reaktion wird typischerweise dadurch angezeigt, dass der Strom einen Steady-State-Wert erreicht. Das zeigt an, dass der gesamte oder nahezu der gesamte Analyt elektrolysiert worden ist. Bei dieser Art von Messung werden typischerweise wenigstens 90% des Analyten elektrolysiert, vorzugsweise werden wenigstens 95% des Analyten elektrolysiert, und noch bevorzugter werden wenigstens 99% des Analyten elektrolysiert.
Für Coulometrie ist es typischerweise erwünscht, dass der Analyt schnell elektrolysiert wird. Die Geschwindigkeit der elektrochemischen Reaktion hängt von verschiedenen Faktoren ab, zu denen das Potential gehört, das zwischen den Elektroden angelegt wird, sowie die Kinetik der Reaktionen (1) und (2). (Zu anderen wichtigen Faktoren gehören die Größe der Messzone und die Anwesenheit eines Sorbens in der Messzone.) Im allgemeinen gilt, dass je größer das Potential ist, desto größer ist auch der Strom durch die Zelle (bis zu einem durch den Transport begrenzten Maximalwert), und um so schneller wird typischerweise die Reaktion ablaufen. Wenn jedoch das Potential zu hoch ist, dann können andere elektrochemische Reaktionen zu einem beträchtlichen Fehler der Messung führen. Typischerweise werden das Potential zwischen den Elektronen sowie der spezifische Redoxmediator und gegebenenfalls das zweite Elektronenübertragungsmittel so gewählt, dass der Analyt in weniger als 5 Minuten nahezu vollständig elektrolysiert wird, und zwar basierend auf der erwarteten Konzentration des Analyten in der Probe. Vorzugsweise wird der Analyt innerhalb von ungefähr 2 Minuten nahezu vollständig elektrolysiert, und noch bevorzugter innerhalb von ungefähr 1 Minute.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird der Analyt nur teilweise elektrolysiert. Der Strom wird während der partiellen Reaktion gemessen und dann mittels mathematischer Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, extrapoliert, um die Stromkurve für die vollständige oder nahezu vollständige Elektrolyse des Analyten zu bestimmen. Die Integration dieser Kurve ergibt die Ladungsmenge, die übertreten würde, wenn der Analyt vollständig oder nahezu vollständig elektrolysiert würde, und mittels der Gleichung (3a) oder (3b) wird die Konzentration des Analyten berechnet.
Obwohl Coulometrie den Nachteil hat, zu erfordern, dass das Volumen der gemessenen Probe bekannt ist, ist Coulometrie eine bevorzugte Technik für die Analyse der kleinen Probe, weil es die Vorteile von zum Beispiel keiner Temperaturabhängigkeit für die Messung, keine Enzymaktivitätsabhängigkeit für die Messung, keine Redoxmediator-Aktivitätsabhängigkeit für die Messung und keinen Fehler in der Messung wegen des völligen Verbrauchs des Analyten in der Probe hat. Wie bereits oben beschrieben, ist Coulometrie ein Verfahren zum Bestimmen der Menge von Ladung, die während der vollständigen oder nahezu vollständigen Elektrolyse des Analyten übertritt oder hochgerechnet übertritt. Ein Coulometrieverfahren umfasst das Elektrolysieren des Analyten an einer Arbeitselektrode und das Messen des resultierenden Stroms zwischen der Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode zu zwei oder mehr Zeiten während der Elektrolyse. Die Elektrolyse ist abgeschlossen, wenn der Strom einen gleichbleibenden Zustand erreicht. Die Ladung, die verwendet wird, um die Probe zu elektrolysieren, wird dann berechnet, indem die gemessenen Ströme über die Zeit integriert werden, und jedes Hintergrundsignal berücksichtigt wird. Da die Ladung direkt in Beziehung mit der Menge an Analyt in der Probe steht, gibt es keine Temperaturabhängigkeit der Messung. Außerdem beeinflusst die Aktivität des Enzyms nicht den Messwert, sondern nur die Zeit, die erforderlich ist, um die Messung zu erhalten (d. h. ein weniger aktives Enzym erfordert eine längere Zeit, um eine vollständige Elektrolyse der Probe zu erreichen), so dass der Abfall des Enzyms über die Zeit nicht die Bestimmung der Konzentration des Analyten ungenau machen wird. Und schließlich ist der vollständige Verbrauch des Analyten in der Probe durch die Elektrolyse keine Fehlerquelle, sondern vielmehr das Ziel der Technik. (Jedoch muß der Analyt nicht vollständig elektrolysiert werden, wenn die Elektrolysekurve aus der Kurve teilweiser Elektrolyse aufgrund bekannter elektrochemischer Prinzipien extrapoliert wird.)
Nicht-coulometrische Untersuchungen
Obwohl coulometrische Untersuchung nützlich sind, wird es den Fachleuten auf diesem Gebiet jedoch klar sein, dass ein erfindungsgemäßer Sensor auf potentiometrische, amperometrische, voltametrische sowie andere elektrochemische Techniken zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe einsetzen kann. Die Messwerte, die mittels dieser nicht-coulometrischen Verfahren erhalten werden, können nicht temperaturunabhängig sein, wie es coulometrische Messungen sind.
Außerdem sind die Messwerte, die mittels dieser nicht-coulometrischen elektrochemischen Techniken erhalten werden, empfindlich gegenüber der Menge des aktiven Enzyms, das im Sensor bereit gestellt wird. Wenn das Enzym mit der Zeit inaktiviert wird oder zerfällt, dann wird die resultierende Messung beeinflusst. Das beschränkt die Lagerfähigkeit derartiger Sensoren, es sei denn, das Enzym ist sehr stabil.
Schließlich können die Messungen, die mittels der nicht-coulometrischen elektrochemischen Techniken, wie der Steady-State-Amperometrie, erhalten werden, negativ beeinflusst werden, wenn ein beträchtlicher Teil des Analyten und/oder des Redox-Mediators während der Messdauer elektrolysiert wird. Es kann keine genaue Steady-State-Messung erhalten werden, es sei denn, es liegt genügend Analyt und/oder Redox-Mediator vor, so dass nur ein relativ kleiner Teil des Analyten und/oder des Redox-Mediators während des Messvorganges elektrolysiert wird. Dies kann eine Herausforderung für eine Probengröße von nicht mehr als 1 μl sein.
Es kann in einigen Fällen wünschenswert sein, nicht-coulometrische Untersuchungen einzusetzen, wie amperometrische oder potentiometrische Messtechniken. Zum Beispiel erfordert Coulometrie, dass das Volumen der gemessenen Probe bekannt ist. Auch kann das Volumen der Probe in der Messzone von einem kleinen Volumensensor (d. h. nicht mehr als ein Mikroliter) schwierig sein, genau reproduziert zu werden, wenn die Herstellungstoleranzen von einer oder mehrerer Dimensionen der Messzone erhebliche Varianzen haben.
Wie für Coulometriemessungen beschrieben, kann das Hintergrundsignal, das von dem Hin- und Herbewegen des Redoxmediators zwischen den Elektroden stammt, eine Quelle für einen Messfehler bei amperometrischen und potentiometrischen Untersuchen von Proben von nicht mehr als 1 μl in elektrochemischen Dünnschichtzellen sein. Im großen und ganzen ist es wünschenswert, dass der Mediator nicht zwischen einem Elektrodenpaar mehr als 10-mal in der Zeitdauer der Messung sich hin- und her bewegt, vorzugsweise nicht mehr als einmal, und insbesondere vorzugsweise nicht mehr als 0,1-mal im Mittel. Um den Fehler zu verringern, der von dem Hintergrundsignal stammt, können Verfahren und Sensorkonfigurationen verwendet werden, die ähnlich zu und in einigen Fällen identisch zu solchen sind, die für coulometirsche Messungen verwendet werden. Beispiele umfassen alle die oben beschriebenen Verfahren und Strukturen, wie das Durchführen der elektrochemischen Untersuchung bei einem relativ niedrigen angelegten Potential, Elektrooxidieren des Analyten bei negativen anliegenden Potentialen oder Elektroreduzieren des Analyten bei positiven anliegenden Potentialen, Verwenden einer Gegenelektrode, an der Redoxmediator relativ langsam reagiert (insbesondere im Vergleich der Reaktion des Redoxmediators an der Arbeitselektrode) und/oder Verwenden eines Redoxmediators, der eine irreversible Reaktion an der Gegenelektrode durchmacht. Weitere Beispiele werden unten diskutiert.
Wie für coulometrische Messungen beschrieben, bevorzugt man, dass der Sensor ausgelegt und betrieben wird, so dass das Hintergrundsignal höchstens 5-mal die Größe von dem Signal ist, das durch die Elektrolyse des Analyten erzeugt wird. Vorzugsweise ist das Hintergrundsignal höchstens 200%, 100%, 50%, 25%, 10% oder 5% des Signals, das durch Elektrolyse einer Analytenmenge erzeugt wird. Die Analytenmenge, mit der das Hintergrundsignal verglichen wird, wird oben in dem Abschnitt mit dem Titel "Hintergrundsignal" beschrieben. In dem Fall von Amperometrie ist das Signal, das durch die Elektrolyse einer Analytenmenge erzeugt wird, der Strom zu der Zeit oder zu den Zeiten, in der die Messung gemacht wird bzw. in denen die Messungen gemacht werden. In dem Fall von Potentiometrie ist das Signal, das durch die Elektrolyse einer Analytenmenge erzeugt wird, das Potential zu der Zeit oder zu den Zeiten, in der die Messung gemacht wird bzw. in denen die Messungen gemacht werden.
Unter einem bestimmten Satz von Betriebsbedingungen, z. B. Temperatur, Zellengeometrie und Elektrodengröße, kann die Größe des Hintergrundstroms, I_back, durch den folgenden Ausdruck angegeben werden: Iback = KCMDM/d wobei: K eine Proportionalitätskonstante ist; C_M die Konzentration des Mediators in der Messzone ist; D_m der effektive Diffusionskoeffizient des Mediators in der Messzone bei normalen Betriebsbedingungen ist; und d der Abstand zwischen den Elektroden ist.
Es ist wünschenswert, den Hintergrundstrom für nicht-coulometrische Untersuchungen zu reduzieren. Die oben beschriebenen Sensorkonfigurationen und Verfahren sind im großen und ganzen einsetzbar und umfassen zum Beispiel das Verwenden niedriger Konzentrationen des Redoxmediators und/oder der zweiten Elektronenübertragungsmittel (z. B. Enzym) relativ zu der Konzentration des Analyten und/oder Verwenden eines großen Redoxmediators mit einer relativ niedrigen effektiven Diffusionskonstanten. Andere verwendbare Verfahren, die oben beschrieben sind, umfassen Verfahren zum Reduzieren der Diffusion des Redoxmediators durch zum Beispiel Vorsehen einer Barriere (z. B. einer geladenen oder polaren Barriere) für den Strom des diffundierbaren Mediators, oder Verwenden eines Redoxmediators mit einer relativ niedrigen effektiven Diffusionskonstante.
In einigen Fällen ist der effektive Diffusionskoeffizient nicht größer als ungefähr 1 × 10^–6 cm²/s, nicht mehr als ungefähr 1 × 10^–7 cm²/s oder nicht mehr als ungefähr 1 × 10^–8 cm²/s. Überdies kann in einigen Fällen das Produkt von C_MD_M (die Konzentration des Redoxmediators mal dem effektiven Diffusionskoeffizienten) nicht mehr als ungefähr 1 × 10^–12 mol/cm·s, nicht mehr als ungefähr 1·10^–13 mol/cm·s oder nicht mehr als ungefähr 1 × 10^–14 mol/cm·s sein.
Das folgende gibt ein spezielles Beispiel für den Fall einer amperometrischen Messung von Glucose an, die für 60 Sekunden ausgeführt wurde, während welcher Zeit 10% der Glucose in einer 1 μl-Zelle mit gegenüberliegenden Elektrode elektrolysiert wurde, die durch einen Abstand von d = 0,01 cm getrennt sind. Wenn die Messung unter den folgenden Bedingungen ausgeführt wurde: eine Glucose-Konzentration von C_G = 5 mM (oder 5 × 10^–6 mol/cm³), eine Fläche von A = 0,1 cm², eine Anzahl von Elektronen aus dem Redoxmediator von n_M = 1 und einer Anzahl von Elektronen aus der Glucose n_G = 2, dann wird der Hintergrundstrom, der durch den Redoxmediator und die Glucose erzeugt wird, wie folgt bestimmt: iback = AFnMDMCM/d = (0,1)(96,500)(1)DMCM/(0,01) = 6,65 × 105 CMDM iG = nGAd(0,1)FCG/t = (2)(0,01)(0,1)(96,500)(5 × 10–6)/60 = 1,61 μA
Wenn somit i_back/i_G = 5 ist, gleicht der Wert von C_MD_M 8,34 × 10^–13 mol/cm²/s. Als weiteres Beispiel gleicht der von C_MD_M 8,34 × 10^–13 mol/cm²/s, wenn i_back/i_G = 0,5 ist. Außerdem gleicht, wenn i_back/i_G = 0,05 ist, der Wert von C_MD_M 8,34 × 10^–14 mol/cm²/s.
Bei einigen amperometrischen und potentiometrischen Ausführungen nimmt die Redoxmediatorzirkulation durch das Trennen der Arbeitselektrode von der Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode ab, derart, dass die Distanz, über den der Redoxmediator während der Messdauer diffundieren würde, nicht größer als z. B. der Abstand zwischen den Elektroden ist. Ein Redoxmediator kann eine Distanz diffundieren, die gleich (D_mt)^1/2 ist, wobei D_m der effektive Diffusionskoeffizient für das Medium zwischen den Elektroden und t die Zeit ist. Für eine Messzeitdauer von 30 Sekunden und einen Redoxmediator mit einem effektiven Diffusionskoeffizienten zwischen 10^–5 und 10^–6 cm²/s sollten die Elektroden zumindest 100 μm getrennt sein, vorzugsweise zumindest 200 μm und noch bevorzugter zumindest 400 μm.
Ein Verfahren zum Trennen der Arbeitselektrode und Gegenelektrode ist es, einen dickeren Abstandshalter zwischen den Elektroden zu verwenden. Ein alternatives Verfahren ist in 27 dargestellt. Bei dieser Ausführung ist die Arbeitselektrode 740 auf einem ersten Substrat 742 und die Gegenelektrode 744 auf einem zweiten Substrat 746 angeordnet (alternativ können die Elektroden auf dem gleichen Substrat angeordnet werden). Die Arbeitselektrode 742 und die Gegenelektrode 744 sind versetzt, so dass der effektive Abstand d zwischen den beiden Elektroden größer als die Dicke w der Abstandshalterschicht 748 ist. Bei einer Ausführung ist der Abstand zwischen den Elektroden d ausgewählt, um in dem Bereich von 25 bis 1000 μm, 50 bis 500 μm oder 100 bis 250 μm zu liegen.
Zusätzlich oder alternativ kann in dem Fall von Steady-State-Amperometrie und -Potentiometrie das Hintergrundsignal geregelt werden, um die Geschwindigkeit der Elektrolyse derart zu begrenzen, dass die Geschwindigkeit langsam genug ist, um zu verhindern, dass die Analyten-Konzentration um mehr als ungefähr 20%, 10% oder 5% oder weniger während einer Messzeitdauer, z. B. 30 Sekunden, 1 Minute, 5 Minuten oder 10 Minuten abnimmt. In einigen Fällen kann, um die Elektrolysegeschwindigkeit zu regeln, die Konzentration oder Aktivität des zweiten Elektronenübertragungsmittels reduziert werden und/oder die Arbeitselektrodenfläche reduziert werden.
Zum Beispiel kann das zweite Elektronenübertragungsmittel ein Enzym sein und die Enzymaktivität kann ein begrenzender Faktor für die Elektrolysegeschwindigkeit sein. Wenn zum Beispiel die Analytenkonzentration 5 mM Glucose (d. h. 5 × 10^–9 mol Glucose in 1 μl) ist und nicht mehr als 10% der Glucose 5 × 10^–10 mol) während einer 30 Sekunden-Messzeitdauer zu elektrolysieren ist, sollte der Strom nicht 3,3 × 10^–6 Ampere für 1 μl überschreiten. Eine Einheit eines Enzyms ist die Menge des Enzyms, das die Elektrolyse von 1 μmol an seinem Substrat in 60 Sekunden bei pH 7,4 bei 37°C in HEPES-Puffer katalysiert. Dementsprechend kann für Glucose ein Strom von bis zu 3,3 × 10^–3 Ampere in 1 cm³ (d. h. 1 ml) erzeugt werden. Daher sollte die maximale Menge an Enzym, das in einem Sensor verwendet wird, die die Menge der Elektrolyse durch Kontrollieren der Menge an Enzym begrenzt, 1 Einheiten/cm³ oder weniger sein.
Die Elektrolysegeschwindigkeit kann auch begrenzt werden, indem eine relativ kleine Arbeitselektrodenfläche verwendet wird. Wenn die Arbeitselektrodenfläche hinreichend klein ist (z. B. nicht mehr als 0,01 cm², nicht mehr als ungefähr 0,0025 cm² oder nicht mehr als ungefähr 0,001 cm²), dann kann die radiale Diffusion des Analyten zu der Elektrode bei einem konstant anliegenden Potential zu einem Steady-State-Strom führen, der für die Konzentration des Analyten repräsentativ ist. Für kreisförmige Elektroden kann das geeignete Oberflächengebiet erreicht werden, indem eine Elektrode mit einem Radius von nicht mehr als 60 μm, nicht mehr als 30 μm oder nicht mehr als 20 μm verwendet wird. Die radiale Diffusion des Analyten umfasst den Transport von Analyt aus allen Richtungen und nicht gerade von der Richtung senkrecht zu der Elektrodenoberfläche und kann daher den vollständigen Verbrauch des Analyten neben der Elektrodenoberfläche reduzieren oder verhindern. Eine kleine Elektrode auf einer ebenen Oberfläche erlaubt eine radiale Diffusion. Bei einem Sensor mit Elektroden mit einem größeren Oberflächengebiet kann der Transport des Analyten zu der Elektrode als quasi unendliche lineare Diffusion anstatt einer radialen Diffusion moduliert werden. Somit wird der Transport des Analyten zur der Elektrode durch Diffusion aus der Richtung senkrecht zu der Elektrodenoberfläche dominiert. Als eine Folge ist die reduzierte Transportgeschwindigkeit typischerweise unfähig, den vollständigen Verbrauch des Analyten neben der Elektrodenoberfläche zu überwinden, und bei einem konstant anliegenden Potential nimmt der Strom mit der Zeit t gemäß t^–1/2 ab.
Für potentiometrische Untersuchungen der von Yarnitzky und Heller, J. Phys. Chem., 102: 10057–61 (1998) vorgeschlagenen Art, bei der das Potential linear mit der Analytenkonzentration variiert, sollte die Konzentration des Analyten und/oder des Redoxmediators bei einem bestimmten Oxidationszustand nicht mehr als ungefähr 20% während der Untersuchung variieren. Wenn die Konzentration um mehr als 20% variiert, sollte die Diffusion des Analyten oder Redoxmediators durch z. B. Kontrollieren der Temperatur und/oder des Volumens der Probenkammer und/oder der Messzone kontrolliert werden.
Während diese Beschreibung die Elektrolyse eines Analyten beschrieben hat, wird ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass die gleichen Vorrichtungen und Verfahren auch für Messungen des mittleren Oxidationszustands des Mediators geeignet sein würden wie z. B. bei Cottrell-Typ-Reaktionen.
Luftoxidierbare Redoxmediatoren
Bei einem Sensor, der einen Redoxmediator aufweist, ist eine potentielle Quelle für Messfehler das Vorliegen des Redoxmediators in einem unbekannten gemischten Oxidationszustand (d. h. der Mediator befindet sich nicht reproduzierbar in einem bekannten Oxidationszustand). Die übertretene Ladung wird durch den anfänglichen Oxidationszustand des Redoxmediators beeinflusst, wenn er an der Arbeitselektrode elektrooxidiert oder elektroreduziert wird. Im Hinblick auf die Gleichungen (1) und (2), die oben unter der Überschrift "Betrieb des Sensors" diskutiert werden, fließt ein Strom, der der Oxidation der biochemischen Verbindung B nicht zugeschrieben werden kann, wegen der Elektrooxidation dieses Teils des Redoxmediators A, der sich vor der Zugabe der Probe in seiner reduzierten Form befindet. Es ist deshalb wichtig, den Oxidationszustand des Analyten vor der Zugabe der Probe in den Sensor zu kennen. Weiterhin ist es wünschenswert, dass sich nahezu der gesamte Redoxmediator oder fast der gesamte Redoxmediator in dem gleichen Oxidationszustand oder den gleichen Oxidationszuständen befindet, ehe die Probe in den Sensor gegeben wird.
Jeder Redoxmediator hat eine reduzierte Form oder einen reduzierte Zustand und eine oxidierte Form oder einen oxidierten Zustand. Es wird bevorzugt, dass die Menge des Redoxmediators in der reduzierten Form vor der Zugabe der Probe signifikant kleiner als die erwartete Menge des Analyten in der Probe ist, um einen signifikanten Beitrag zum Hintergrund des gemessenen Stroms zu vermeiden. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ist die molare Menge des Redoxmediators in der reduzierten Form vor der Zugabe des Analyten auf stöchiometrischer Basis vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 10%, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 5% und am bevorzugtesten nicht mehr als 1% der molaren Menge des Analyten für die erwarteten Konzentrationen des Analyten. (Die relativen molaren Mengen des Analyten und des Redoxmediators sollten auf der Basis der Stöchiometrie der anwendbaren Redoxreaktion verglichen werden. Wenn z. B. zwei Mol Redox-Mediator für die Elektrolyse eines Mols des Analyten benötigt werden, dann ist die molare Menge des Redoxmediators in der reduzierten Form vor der Zugabe das Analyten vorzugsweise nicht mehr als 20%, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 10% und am bevorzugtesten nicht mehr als ungefähr 2% der molaren Menge des Analyten für die erwarteten Konzentrationen des Analyten.) Verfahren zur Steuerung der Menge des reduzierten Mediators werden unten diskutiert.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung wird es bevorzugt, dass das Verhältnis der Mengen des oxidierten Redoxmediators zum reduzierten Redoxmediator vor der Zugabe der Probe in den Sensor bei ähnlich konstruierten Sensoren relativ konstant ist. Jede Abweichung davon, das Verhältnis relativ konstant zu halten, kann die Streuung der Ergebnisse, die für die gleiche Probe mit mehreren ähnlich gemachten Sensoren erhalten werden, vergrößern. Für diesen Aspekt der Erfindung variiert der prozentuale Anteil des Redoxmediators in der reduzierten Form vor der Zugabe der Probe in den Sensor zwischen ähnlich konstruierten Sensoren um nicht mehr als ungefähr 20%, und vorzugsweise um nicht mehr als ungefähr 10%.
Ein Verfahren zur Steuerung der Menge des reduzierten Redoxmediators vor der Zugabe der Probe in den Sensor besteht darin, ein Oxidationsmittel zur Oxidation der reduzierten Form des Mediators bereit zu stellen. Eines der bequemsten Oxidationsmittel ist O₂. Sauerstoff ist normalerweise für diese oxidierende Funktion leicht verfügbar. Sauerstoff kann bereit gestellt werden, indem der Sensor Luft ausgesetzt wird. Außerdem absorbieren die meisten Polymere und Flüssigkeiten O₂ aus der Luft, es sei denn, dass spezielle Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Typischerweise befinden sich wenigstens 90% eines luftoxidierbaren (d. h. durch O₂ oxidierbaren) Mediators im stabilen Zustand im oxidierten Zustand nach der Lagerung oder Exposition an Luft über einen nützlichen Zeitraum, beispielsweise einen Monat oder weniger, und vorzugsweise eine Woche oder weniger und noch bevorzugter einen Tag oder weniger. Die Luftoxidation kann in entweder dem festen Zustand oder als eine Lösung stattfinden, die für eine Zeitdauer gelagert wird, die ausreichend für die Luftoxidation des Mediators vor der Ablagerung auf dem Sensor ist. In dem Fall von luftoxidierbaren Redoxmediatoren in Lösung ist es wünschenswert, dass die Zeit, die erforderlich ist, um zumindest 80%, vorzugsweise zumindest 90% Oxidation des Redoxmediators zu erreichen zumindest 10-mal die erwartete Untersuchungsdauer, und auch geringer als die Standzeit der Lösung ist. Vorzugsweise wird zumindest 80%, bevorzugter zumindest 90% des Redoxmediators in weniger als einer Woche, vorzugsweise in weniger als einen Tag bevorzugter in weniger als 8 Stunden und noch bevorzugter in weniger 1 Stunde luftoxidiert.
Während es wünschenswert ist, die Mediatoren der Sensoren, die in einer einzelnen Charge hergestellt werden, in den gleichen Zustand oder das gleiche Ausmaß an Oxidation zu bringen, ist es nicht notwendig, dass der Mediator vollständig in den höherwertigen Zustand oxidiert wird. Außerdem ist es wünschenswert, dass die Luftoxidation des gelösten Redoxmediators nicht zu schnell sein sollte, dass Luftoxidation während der Untersuchung bei den Messungen stören, oder einen Fehler in die Messwerte einführen kann.
Geeignete Mediatoren, die einerseits durch Luft oxidiert werden können (d. h. durch O₂ oxidierbar sind) und andererseits die Fähigkeit zur Elektronenübertragung aufweisen, wurden hier weiter oben beschrieben. Eine besondere Familie von verwendbaren Mediatoren sind Osmium-Komplexe, die an Elektronen-reiche Stickstoff-haltige Heterocyclen oder eine Kombination von Elektronen-reichen Stickstoff-haltigen Heterocyclen und Halogeniden gebunden sind. Elektronen-reiche Stickstoff-reiche Heterocyclen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Imidazol-Derivate und Pyridin- oder Phenanthrolin-Derivate, die Elektronendonator-Substituenten enthalten, wie Alkyl-, Alkoxy-, Amino-, Alkylamino-, Amido- und Mercapto-Gruppen. Vorzugsweise haben die Osmium-Komplexe nicht mehr als ein Halogenid, das mit dem Metall koordiniert ist, so dass die Mediatoren überall positiv geladen sind, und somit wasserlöslich sind. Ein Beispiel ist Osmium, das mit Mono-, Di- und Polyalkoxy-2,2'-bipyridin komplexiert ist. Weitere Beispiele umfassen Mono-, Di- und Polyalkoxy-1,10-phenanthrolin, wobei die Alkoxy-Gruppen ein Verhältnis von Kohlenstoff zu Sauerstoff aufweisen, das ausreicht, ihre Löslichkeit in Wasser zu erhalten, und sind durch Luft oxidierbar. Diese Osmium-Komplexe haben typischerweise zwei substituierte Bipyridin- oder substituierte Phenanthrolinliganden, wobei die beiden Liganden nicht notwendigerweise identisch sind. Diese Osmium-Komplexe sind weiter mit einem monomeren oder polymeren Liganden mit einem oder mehreren stickstoffhaltigen Heterocyclus bzw. Heterocyclen komplexiert, beispielsweise Pyridin und Imidazol. Zu bevorzugten polymeren Liganden gehören Poly(4-vinylpyridin) und, bevorzugter, Poly(1-vinylimidazol) oder Copolymere von diesen. Für Os[4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin]₂Cl^+/+2, das mit einem Poly(1-vinylimidazol) oder Poly(4-vinylpyridin) komplexiert ist, wurde gezeigt, dass es besonders nützlich ist, da das Os⁺²-Kation durch O₂ zu Os⁺³ oxidiert werden kann. Ähnliche Ergebnisse werden für Komplexe von Os[4,7-Dimethoxy-1,10-phenanthrolin]₂Cl^+/+2 und andere Mono-, Di- und Polyalkoxybipyridine und -phenanthroline mit den gleichen Polymeren erwartet. Weitere Halogen-Gruppen, wie z. B. Brom können für Chlor substituiert werden. Ähnliche Ergebnisse werden auch für Komplexe erwartet, die folgenden Strukturen, wie oben spezifiziert, aufweisen:
Eine Komplikation, die mit luftoxidierbaren Mediatoren assoziiert ist, entsteht, wenn die Luftoxidation des Redoxmediators so schnell erfolgt, dass ein beträchtlicher Teil des durch den Analyten reduzierten Redoxmediators während der Messung des Analyten durch O₂ oxidiert wird. Das führt zu einem ungenauen Test, weil die Menge des Analyten unterschätzt wird, da der Mediator durch Luft und nicht durch die Elektrooxidation an der Elektrode oxidiert wird. Es wird bevorzugt, dass die Reaktion des Redoxmediators mit O₂ langsamer erfolgt als die Elektrooxidation des Mediators, weil, wenn die Luftoxidation des Mediators schnell wäre, dann aufgelöste Luft und die Eindiffusion von Luft den Ausgang der Messung beeinflussen könnte.
Weil die Untersuchung typischerweise ungefähr 10 Minuten oder weniger, vorzugsweise 5 Minuten oder weniger und am bevorzugtesten ungefähr 1 Minute oder weniger dauert, bevorzugt man, dass der Mediator trotz seiner Luftoxidierbarkeit bei der Lagerung nicht durch gelösten Sauerstoff während der Zeit der Untersuchung oxidiert werden wird. Somit werden Mediatoren bevorzugt, die in einer Minute, und vorzugsweise sogar nicht in 10 Minuten luftoxidiert werden, wenn sie in Plasma oder Serum gelöst sind. Typischerweise sollten sich weniger als 5%, und vorzugsweise weniger als 1%, des reduzierten Mediators während eines Tests durch das Oxidationsmittel oxidiert werden.
Die Reaktionsgeschwindigkeit der Luftoxidation des Mediators kann über die Wahl eines geeigneten komplexierenden Polymers gesteuert werden. Beispielsweise erfolgt die Oxidationsreaktion viel schneller für Os[4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin]₂Cl^+/+2, das koordinativ an Poly(1-vinylimidazol) gekoppelt ist, als für den gleichen Os-Komplex, der an Poly(4-vinylpyridin) gekoppelt ist. Die Wahl eines geeigneten Polymers hängt von der erwarteten Konzentration des Analyten und dem Potential, das zwischen den Elektroden anliegt, ab, wobei beide die Geschwindigkeit der elektrochemischen Reaktion bestimmen.
Somit hat bei einer Ausführungsform der Erfindung der bevorzugte Redoxmediator die folgenden Kennzeichen: 1) der Mediator reagiert nicht mit anderen Molekülen in der Probe oder im Sensor, sondern nur mit denen des Analyten (gegebenenfalls über ein zweites Elektronenübertragungsmittel); 2) nahezu der gesamte Redoxmediator ist durch ein Oxidationsmittel wie O₂ vor der Zugabe der Probe in den Sensor oxidiert worden; und 3) die Oxidation des Redoxmediators durch das Oxidationsmittel erfolgt langsam im Vergleich zur Elektrooxidation des Mediators durch die Elektrode.
Alternativ würde, wenn der Redoxmediator in Gegenwart des Analyten oxidiert und an der Elektrode elektroreduziert werden soll, ein Reduktionsmittel statt eines Oxidationsmittels benötigt werden. Es gelten die gleichen Überlegungen für die geeignete Wahl des Reduktionsmittels und des Mediators, wie sie oben für das Oxidationsmittel beschrieben wurden.
Die Verwendung stabiler, luftoxidierbarer Redoxmediatoren in den elektrochemischen Sensoren der Erfindung stellt einen weiteren Vorteil während der Lagerung und der Verpackung dar. Erfindungsgemäße Sensoren, die luftoxidierbare Redoxmediatoren einschließen, können in einer Atmosphäre verpackt werden, die molekularen Sauerstoff enthält, und sie können über lange Zeiträume gelagert werden, beispielsweise länger als einen Monat, wobei sie mehr als 80%, und vorzugsweise mehr als 90%, der Redoxspezies im oxidierten Zustand behalten.
Verwendung der Luft-oxidierbaren Mediatoren in optischen Sensoren
Die luftoxidierbaren Redoxspezies der vorliegenden Erfindung können in anderen Typen von Sensoren eingesetzt werden. Die oben beschriebenen Osmium-Komplexe sind für eine Verwendung in optischen Sensoren geeignet, und zwar aufgrund des Unterschiedes der Absorptionsspektren, der Lumineszenz- und der Fluoreszenzeigenschaften der komplexierten Os⁺²- und Os⁺³-Spezies. Messungen der Absorption, der Transmission, der Reflexion, der Lumineszenz oder der Fluoreszenz der Redoxspezies korrelieren mit der Menge des Analyten in der Probe (nach der Reaktion zwischen einem Analyten und der Redoxspezies, und zwar entweder direkt oder über ein zweites Elektronenübertragungsmittel, wie ein Enzym). Bei dieser Konfiguration sollte die molare Menge des Redoxmediators auf stöchiometrischer Basis größer sein als die molare Menge des Analyten, von der vernünftigerweise erwartet wird, dass sie die Messzone des Sensors ausfüllt.
Es können optische Standardsensoren, einschließlich von lichtleitenden optischen Fasersensoren, und Messtechniken für die Anwendung mit den luftoxidierbaren Mediatoren adaptiert werden. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen optischen Sensoren einen lichtleitenden oder lichtreflektierenden Träger einschließen, auf dem die luftoxidierbare Redoxspezies und vorzugsweise ein auf den Analyten ansprechendes Enzym in Form eines Films aufgetragen sind. Der Stützfilm bildet eine Begrenzung der Messzone, in die die Probe gegeben wird. Die anderen Begrenzungen der Messzone werden durch die Konfiguration der Zelle bestimmt. Nach dem Füllen der Messzone mit einer Probe, die den Analyten enthält, verursacht die Reduktion des luftoxidierbaren Mediators durch den Analyten, vorzugsweise über eine Reaktion mit einem auf den Analyten ansprechenden Enzym, eine Verschiebung des Oxidationszustandes des Mediators, die über eine Veränderung der Spektren der Lichttransmission, -absorption oder -reflexion oder in der Lumineszenz und/oder der Fluoreszenz des Mediators bei einer Lichtwellenlänge oder mehreren Lichtwellenlängen nachgewiesen wird.
Sensoren mit mehreren Elektroden und ihre Kalibrierung
Es können Sensoren mit mehreren Elektroden aus verschiedenen Gründen verwendet werden. Beispielsweise können Sensoren mit mehreren Elektroden verwendet werden, um verschiedene Analyten unter Verwendung einer einzigen Probe zu testen. Eine Ausführungsform eines Sensors mit mehreren Elektroden, die in 5 gezeigt wird, besitzt eine oder mehrere Probenkammer(n), die ihrerseits eine oder mehrere Arbeitselektroden 22 enthalten kann bzw. können, wobei jede Arbeitselektrode 22 eine andere Messzone definiert. Wenn der Redoxmediator nicht-auslaugbar ist, enthält bzw. enthalten eine oder mehrere der Arbeitselektroden die passenden chemischen Reagenzien, beispielsweise ein passendes Enzym, um einen ersten Analyten zu testen, und eine oder mehrere der restlichen Arbeitselektroden hat oder haben passende chemische Reagenzien, um einen zweiten Analyten zu testen. Die chemischen Reagenzien (z. B. der Redoxmediator und/oder das zweite Elektronenübertragungsmittel) können als eine Messschicht auf der Arbeitselektrode abgelagert werden, oder, wenn diffundierbare Reagenzien verwendet werden, können sie auf einer beliebigen Oberfläche der Probenkammer abgelagert oder in der Probe angeordnet werden. Beispielsweise könnte ein Sensor mit mehreren Elektroden einschließen 1) eine oder mehrere Arbeitselektroden, die Glucoseoxidase in der Messschicht enthält bzw. enthalten, um die Glucosekonzentration zu bestimmen, und 2) eine oder mehrere Elektroden, die Lactatoxidase in der Messschicht enthält bzw. enthalten, um die Lactatkonzentration zu bestimmen.
Sensoren mit mehreren Elektroden können auch dazu verwendet werden, die Genauigkeit der resultierenden Messungen zu verbessern. Die Messwerte von jeder der Arbeitselektroden (von allen oder von denjenigen, die den gleichen Analyten nachweisen) können gemittelt werden, um eine genauere Ablesung zu erhalten. In bestimmten Fällen können Messungen verworfen werden, wenn der Unterschied zwischen dem Wert und dem Durchschnitt einen Grenzwert überschreitet. Dieser Grenzwert kann beispielsweise auf der Basis eines statistischen Parameters bestimmt werden, beispielsweise der Standardabweichung der gemittelten Messwerte. Der Durchschnitt kann dann erneut berechnet werden, wobei die verworfenen Werte weg gelassen werden. Weiterhin können spätere Ablesungen von einer Elektrode, die einen verworfenen Wert erzeugt hat, in späteren Tests ignoriert werden, wenn angenommen wird, dass die betreffende Elektrode fehlerhaft ist. Alternativ kann eine bestimmte Elektrode nur dann abgelehnt werden, nachdem eine vorher festgelegte Zahl an Ablesungen basierend auf den Ablesungen der anderen Elektroden verworfen wurde.
Zusätzlich zur Verwendung von Sensoren mit mehreren Elektroden zur Erhöhung der Genauigkeit können mehrfache Messungen an jeder Elektrode durchgeführt und dann gemittelt werden, um die Genauigkeit zu erhöhen. Diese Technik kann auch mit einem Sensor mit einer einzigen Elektrode eingesetzt werden, um die Genauigkeit zu erhöhen.
Zu Fehlern in den Tests kann es kommen, wenn massenproduzierte Sensoren eingesetzt werden, und zwar aufgrund von Schwankungen des Volumens der Messzone der Sensoren. Zwei der drei Dimensionen der Messzone, die Länge und die Breite, sind üblicherweise relativ groß, mit Abmessungen zwischen ungefähr 1 und 5 mm. Elektroden mit solchen Abmessungen können leicht mit einer Varianz von 2% oder weniger produziert werden. Das Volumen der Messzone von unter 1 μL erfordert jedoch, dass die dritte Dimension um eine bis zwei Größenordnung(en) kleiner ist als die Länge oder die Breite. Wie oben erwähnt wurde, liegt die Dicke der Probenkammer typischerweise zwischen ungefähr 50 und ungefähr 200 μm. Die Herstellungsvarianzen bei der Dicke können in der Größenordnung von 20 bis 50 μm liegen. Deshalb kann es erwünscht sein, dass ein Verfahren zur Berücksichtigung dieser Ungewissheit bezüglich des Volumens der Probe in der Messzone bereit gestellt wird.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung, die in der 5 dargestellt ist, sind mehrere Arbeitselektroden 42, 44, 46 auf einem Basismaterial 48 bereit gestellt. Diese Elektroden werden von einer anderen Basis, nicht gezeigt bedeckt, die Gegenelektroden, nicht gezeigt, enthält, die auf ihr angeordnet sind, wodurch mehrere Paare sich gegenüber liegender Elektroden bereit gestellt werden. Die Varianz der trennenden Entfernung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode bei den Elektrodenpaaren eines gegebenen Sensors ist signifikant vermindert, da die Arbeitselektroden und die Gegenelektroden jeweils auf einer einzigen Basis mit dem gleichen Abstandshalter 28 zwischen jedem Elektrodenpaar bereit gestellt sind (siehe 3).
Ein Beispiel für einen Sensor mit mehreren Elektroden, der zur genauen Bestimmung des Volumens der Messzonen der Elektrodenpaare verwendet werden kann, und der auch nützlich zur Verminderung des Rauschens ist, wird hier dargestellt. Bei diesem Beispiel ist eine der Arbeitselektroden 42 mit einem nicht-auslaugbaren Redoxmediator und einem nicht-auslaugbaren zweiten Elektronenübertragungsmittel (beispielsweise einem Enzym) ausgestattet. Ein Sorbensmaterial kann zwischen der Arbeitselektrode 42 und ihrer entsprechenden Gegenelektrode angeordnet sein. Eine weitere Arbeitselektrode 44 weist einen nicht-auslaugbaren Redoxmediator auf, aber kein zweites Elektronenübertragungsmittel auf der Elektrode. Dieses zweite Elektrodenpaar kann wiederum ein Sorbensmaterial zwischen der Arbeitselektrode 44 und der entsprechenden Gegenelektrode aufweisen. Eine optionale dritte Arbeitselektrode 46 enthält keinen Redoxmediator und kein zweites Elektronenübertragungsmittel an der Elektrode gebunden, und es gibt auch kein Sorbensmaterial zwischen der Arbeitselektrode 46 und ihrer entsprechend Gegenelektrode. Eine ähnliche Konfiguration kann unter Verwendung eines diffundierbaren Redoxmediators und/oder einem zweiten diffundierbaren Elektronenübertragungsmittel konstruiert werden, obwohl diffundierbare Komponenten nicht darauf eingeschränkt sind, auf der Arbeitselektrode angeordnet zu werden. In einigen Fällen ist der Abstand zwischen den Elektrodenpaaren hinreichend, dass Redoxmediator und/oder Enzym nicht im wesentlichen Maß zwischen Elektrodenpaaren in der Messdauer und/oder in der Zeitdauer von der Einleitung der gleichen Probe in die Probenkammer bis zu dem Ende der Messung diffundiert.
Der Fehler des Sensors, der durch einen Redoxmediator in einem nicht-einheitlichen Oxidationszustand vor der Zugabe der Probe verursacht wird, kann gemessen werden, indem gleichzeitig die Probe in den Messzonen elektrolysiert wird, die an den Elektroden 42 und 44 anliegen. An der Elektrode 42 wird der Analyt elektrolysiert, wodurch das Signal der Probe bereit gestellt wird. An der Elektrode 44 wird der Analyt nicht elektrolysiert, und zwar aufgrund der Abwesenheit des zweiten Elektronenübertragungsmittels (unter der Annahme, dass ein zweites Elektronenübertragungsmittel erforderlich ist). Jedoch wird aufgrund der Elektrolyse des Redoxmediators, der sich vor der Zugabe der Probe in einem gemischten Oxidationszustand befand (d. h. einige Redoxzentren befanden sich im reduzierten Zustand und einige im oxidierten Zustand) und/oder des Hin- und Herbewegens des diffundierbaren Redoxmediators zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode eine Ladung übertreten (und ein kleiner Strom fließen). Die kleine Ladung, die bei diesem zweiten Elektrodenpaar zwischen den Elektroden übertrat, kann von der Ladung abgezogen werden, die zwischen dem ersten Elektrodenpaar übertrat, um den Fehler aufgrund des Oxidationszustandes des Redoxmediators im wesentlichen zu eliminieren und/oder um den Hintergrundstrom zu entfernen, der durch den diffundierbaren Redoxmediator verursacht wird. Diese Prozedur vermindert auch den Fehler, der mit anderen elektrolysierten störenden Stoffen, wie Ascorbat, Urat und Acetaminophen, assoziiert ist, sowie Fehler, die mit der kapazitiven Ladung und Faraday-Strömen assoziiert sind.
Die Dicke der Probenkammer kann bestimmt werden, indem die Kapazitanz vorzugsweise in Abwesenheit einer beliebigen Flüssigkeit zwischen der Elektrode 46 (oder einer beliebigen der anderen Elektroden 42, 44 in Abwesenheit von Sorbensmaterial) und ihrer entsprechenden Gegenelektrode bestimmt wird. Die Kapazitanz eines Elektrodenpaares hängt von der Oberfläche der Elektroden, der Entfernung der Elektroden und der Dielektrizitätskonstante des Materials zwischen den Platten ab. Die Dielektrizitätskonstante von Luft ist gleich 1, was typischerweise bedeutet, dass die Kapazitanz dieser Elektrodenkonfiguration wenige Picofarad beträgt (oder ungefähr 100–1000 Picofarad, wenn sich Flüssigkeit zwischen der Elektrode und der Gegenelektrode befindet, unter der Annahme, dass die Dielektrizitätskonstante der meisten biologischen Flüssigkeiten bei ungefähr 75 liegt). Somit erlaubt die Messung der Kapazitanz des Elektrodepaars, da die Oberflächen der Elektroden bekannt sind, die Bestimmung die Dicke der Messzone auf ungefähr 1 bis 5% genau.
Die Größe des Hohlraums im Sorbensmaterial kann durch die Messung der Kapazitanz zwischen der Elektrode 44 (die kein zweites Elektronenübertragungsmittel enthält) und ihrer assoziierten Gegenelektrode gemessen werden, und zwar sowohl vor als auch nach der Zugabe von Flüssigkeit. Nach der Zugabe von Flüssigkeit steigt die Kapazitanz beträchtlich an, da die Flüssigkeit eine viel größere Dielektrizitätskonstante hat. Das Messen der Kapazitanz sowohl mit als auch ohne Flüssigkeit ermöglicht die Bestimmung des Abstandes zwischen den Elektroden und des Volumens des Hohlraums im Sorbens und somit das Volumen der Flüssigkeit in der Reaktionszone.
Andere Elektrodenkonfigurationen können ebenfalls diese Techniken einsetzen (d. h. Kapazitanzmessungen und coulometrische Messungen in Abwesenheit einer kritischen Komponente), um das Hintergrundrauschen und den Fehler aufgrund störender Stoffe und der ungenauen Kenntnis des Volumens der untersuchten Probe zu vermindern. Protokolle, die ein oder mehrer Elektrodenpaar(e) und eine oder mehrere der oben beschriebenen Messungen beinhalten, können entwickelt werden und sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen. Beispielsweise wird nur ein Elektrodenpaar für die Messungen der Kapazitanz benötigt, allerdings können weitere Elektrodenpaare aus Gründen der Bequemlichkeit verwendet werden.
Füllstandsanzeige
Wenn eine Probenkammer verwendet wird, die mit 1 μl oder weniger Flüssigkeit gefüllt ist, ist es oft wünschenswert, die Fähigkeit zu haben, zu bestimmen, wann die Probenkammer gefüllt ist. Die 18A bis 18C zeigen einen Sensor mit einer Füllstandsanzeigekonstruktion. 18A zeigt ein erstes Substrat 500, auf den eine Arbeitselektrode 502 gedruckt ist. Ein Abstandshalter 504 (18B), wie z. B. eine Klebstoffschicht oder ein doppelseitiges Band, ist über dem ersten Substrat 500 und der Arbeitselektrode 502 mit einem Kanal 506 ausgebildet, der in der Schicht gebildet ist, um eine Probenkammer zu schaffen. Ein zweites Substrat 508 ist mit zwei Gegenelektroden 510, 512, wie in 18 gezeigt (invertiert bezüglich der 18A und 18B, um die Elektrode andersrum zu zeigen), gedruckt. In einigen Fälle hat die Gegenelektrode 510, die einem Eingang 514 des Kanals 506 am nächsten liegt, ein Oberflächengebiet in der Probenkammer, das zumindest zweimal größer als das der anderen Gegenelektrode 512, und vorzugsweise zumindest fünf- oder zehnmal größer ist.
Der Sensor kann als gefüllt angezeigt werden, indem ein Signal zwischen der zweiten Gegenelektrode 512 und der Arbeitselektrode 502 beobachtet wird, wenn sich der Sensor mit Flüssigkeit füllt. Wenn die Flüssigkeit die zweiten Gegenelektrode 512 erreicht, sollte sich das Signal von der Gegenelektrode ändern. Geeignete Signale zum Beobachten umfassen z. B. Spannung, Strom, Widerstand, Impedanz oder Kapazitanz zwischen der zweiten Gegenelektrode 512 und der Arbeitselektrode 502. Alternativ kann der Sensor nach dem Füllen beobachtet werden, um festzustellen, ob ein Wert des Signals (z. B. Spannung, Strom, Widerstand, Impedanz oder Kapazitanz) erreicht wurde, der anzeigt, dass die Probenkammer gefüllt ist.
Bei alternativen Ausführungen können die Gegenelektrode und/oder die Arbeitselektrode in zwei oder mehr Teile unterteilt werden, und die Signale von den jeweiligen Teilen beobachtet werden, um zu bestimmen, ob der Sensor gefüllt wurde. Bei einem Beispiel ist die Arbeitselektrode in einer gegenüberliegenden Beziehung zu der Gegenelektrode und der Anzeigeelektrode. Bei einem weiteren Beispiel sind die Gegenelektrode, die Arbeitselektrode und die Anzeigeelektrode in einer nicht gegenüberliegenden Beziehung, aber können zum Beispiel Seite an Seite angeordnet sein. In anderen Fällen kann ein zweites Elektrodenpaar verwendet werden, wobei Signale von dem zweiten Elektrodenpaar für Änderungen überwacht werden und/oder für Annäherungen an einen bestimmten Wert, um zu bestimmen, dass der Sensor gefüllt wurde. Typischerweise liegt die Arbeitselektrode weiter stromab von einer Probeneinlaßöffnung als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode.
Für Seitenfüllsensoren, wie z. B. denen in den 19A bis 19C und 20A und 20C dargestellten, können zwei Arbeitselektroden an jeder Seite der primären Gegenelektrode angeordnet werden. Das erlaubt es dem Benutzer, die Probenkammer von entweder der linken oder der rechten Seite zu befüllen, wobei eine Anzeigeelektrode weiter stromaufwärts angeordnet ist. Diese Dreielektroden-Konfiguration ist nicht notwendig. Seitenfüllsensoren können auch eine einzelne Anzeigeelektrode aufweisen, und vorzugsweise irgendein Hinweis darauf, welche Seite in Kontakt mit der Probenflüssigkeit gebracht werden sollte.
Bei einer Ausführung detektiert die Verwendung von drei Gegen-/Bezugselektroden und/oder Anzeigeelektroden, wann die Probenkammer sich zu füllen beginnt, und wann die Probenkammer gefüllt wurde, um ein teilweises Füllen der Probenkammer zu verhindern. Bei dieser Ausführung werden zwei Anzeigeelektroden auf einem anderen Potential als die größte Gegen-/Bezugselektrode gehalten. Der Start und der Abschluß des Füllens der Probenkammer wird durch den Stromfluss zwischen der Anzeige- und der Gegen-/Bezugselektrode angezeigt.
In anderen Fällen kann das Potential von jeder der Gegen-/Bezugselektroden das gleiche sein. Wenn das Potential an allen drei Gegen-/Bezugselektroden das gleiche ist, zum Beispiel 0 Volt, dann ermöglicht, wenn sich die Messzone zu füllen beginnt, die Flüssigkeit einen elektrischen Kontakt zwischen einer Arbeitselektrode und der ersten Gegen-/Bezugselektrode, was einen Strom an der ersten Gegen-/Bezugselektrode aufgrund der Reaktion des Analyten mit dem Enzym und dem Mediator bewirkt. Wenn die Flüssigkeit die dritte Gegen-/Bezugselektrode erreicht, kann ein weiterer Strom gemessen werden, ähnlich zu der ersten Gegen-/Bezugselektrode, was anzeigt, dass die Messzone voll ist. Wenn die Messzone voll ist, können die drei Gegen-/Bezugselektroden zusammengeschlossen werden, oder ihre Signale können addiert oder anderweitig kombiniert werden.
Die Anzeigeelektrode kann auch verwendet werden, um die Genauigkeit der Messungen des Analyten gemäß den oben für Sensoren mit mehreren Elektroden beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die Anzeigeelektrode kann als eine Arbeitselektrode oder als eine Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode betrieben werden. Bei der Ausführung der 18A bis 18C kann die Anzeigeelektrode 512 als eine zweite Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode bezüglich der Arbeitselektrode 502 funktionieren. Messungen von den Anzeigeelektrode/Arbeitselektrode-Paar können kombiniert werden (z. B. dazuaddiert und/oder gemittelt werden) mit solchen von dem ersten Gegen- oder Gegen-/Bezugselektrode/Arbeitselektrode-Paar, um genauere Messungen zu erhalten. Bei einer Ausführung kann die Anzeigeelektrode als eine zweite Arbeitselektrode mit der Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode betrieben werden. Bei einer anderen Ausführung kann die Anzeigeelektrode als eine zweite Arbeitselektrode mit einer zweiten Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode betrieben werden. Bei noch einer weiteren Ausführung kann die Anzeigeelektrode als eine zweite Gegenelektrode oder Gegen-/Bezugselektrode mit einer zweiten Arbeitselektrode betrieben werden.
Ein Sensor oder Sensorleser kann ein Zeichen umfassen, (z. B. ein visuelles Zeichen oder ein Hörsignal), das als Reaktion auf die Anzeigeelektrode aktiviert wird, um den Benutzer darauf aufmerksam zu machen, dass die Messzone gefüllt wurde. In einigen Fällen kann der Sensor oder ein Sensorleser konfiguriert werden, um ein Lesen zu beginnen, wenn die Anzeigeelektrode anzeigt, dass die Messzone gefüllt wurde, mit oder ohne den Benutzer darauf aufmerksam zu machen. Das Lesen kann begonnen werden, z. B. durch Anlegen eines Potentials zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode und Beginnen des Überwachens der an der Arbeitselektrode erzeugten Signale.
Erwärmen der Probe
Die Probe kann erwärmt werden, um die Geschwindigkeit der Diffusion, Oxidation oder Reduktion des Analyten zu erhöhen. Dieses Erwärmen kann auf eine Vielfalt von Verfahren, einschließlich des Anordnens des Sensors in einer erwärmtem Umgebung oder Anlegen einer Heizeinheit an den Sensor erreicht werden.
Andere Verfahren umfassen das Bereitstellen eines thermischen Heizelements, wie zum Beispiel einem Draht oder einer Tinte, die fähig ist, elektrische Energie an dem Sensor in Wärmeenergie zu konvertieren. Dieser Draht oder diese Tinte kann zum Beispiel auf der gegenüberliegenden Seite des Basismaterials, wie zum Beispiel einem Polymerfilm, von einer oder mehreren Arbeits-, Gegen-, Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektroden angeordnet werden, oder um die Umgebung der Arbeits-, Gegen-, Bezugs- oder Gegen-/Bezugselektroden angeordnet werden. In einigen Fällen kann die Probe auf 5 bis 20°C über einer Anfangstemperatur erwärmt werden. In anderen Fällen kann die Temperatur der Probe nicht bekannt sein, aber eine konstante Energie oder Strommenge kann an den Draht oder die Tinte angelegt werden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter charakterisiert. Diese Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, der in der voraus gegangenen Beschreibung vollständig dargelegt wurde. Variationen innerhalb der Konzepte der Erfindung sind für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich. Die Beispiele 1 bis 8 stellen Hintergrundtechnik gemäß der WO 98/35225 dar.
Beispiel 1
Herstellung eines kleinvolumigen In-vitro-Sensors für die Bestimmung der Glucosekonzentration
Es wurde ein Sensor konstruiert, der der Ausführungsform der Erfin dung, die in der 1 dargestellt ist, entspricht. Die Arbeitselektrode war auf einem Mylar^TM-Film (DuPont) aufgebaut, wobei der Mylar^TM-Film eine Dicke von 0,175 mm und einen Durchmesser von ungefähr 2,5 cm hatte. Ein ungefähr 12 μm dicker Kohlenstoff-Flicken mit einem Durchmesser von ungefähr 1 cm wurde durch Siebdruck auf den Mylar^TM-Film aufgebracht. Die Kohlenstoffelektrode wurde mit einem wasserunlöslichen dielektrischen Isolator (Insulayer) mit einer Dicke von 12 μm und einer Öffnung von 4 mm im Zentrum überschichtet.
Das Zentrum der Kohlenstoffelektrode, das nicht vom Dielektrikum bedeckt war, wurde mit einem nicht-auslaugbaren Redoxmediator beschichtet. Der Redoxmediator wurde durch das Komplexieren von Poly(1-vinylimidazol) mit Os(4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin)₂Cl₂ gebildet, gefolgt von der Vernetzung von Glucoseoxidase mit dem Osmium-Polymer unter Verwendung von Polyethylenglycol-Diglycidylether (PEGDGE), wie es bei Taylor et al., J. Electroanal. Chem. 396: 511 (1995) beschrieben wurde. Das Verhältnis des Osmiums zu den funktionellen Imidazolgruppen im Redoxmediator lag bei ungefähr 1 : 15. Der Mediator wurde auf der Arbeitselektrode in einer Schicht mit einer Dicke von 0,6 μm und einem Durchmesser von 4 mm abgelagert. Die Beschichtung des Mediators auf der Elektrode betrug ungefähr 60 μg/cm² (Trockengewicht). Es wurde ein Abstandshaltermaterial auf die Elektrode gegeben, das die mit dem Mediator bedeckte Oberfläche der Elektrode umgab. Der Abstandshalter bestand aus Polytetrafluorethylen (PTFE) und hatte eine Dicke von ungefähr 0,040 mm.
Es wurde ein Sorbensmaterial mit der vom Mediator bedeckten Oberfläche der Arbeitselektrode in Kontakt gebracht. Das Sorbens bestand aus Nylon (Tetko Nitex Nylon 3-10/2). Das Sorbens hatte einen Durchmesser von 5 mm, eine Dicke von 0,045 mm und einen Hohlraum von ungefähr 20%. Das Volumen der Probe in der Messzone wurde aus den Abmessungen und den Charakteristika des Sorbens und der Elektrode berechnet. Die Messzone hatte einen Durchmesser von 4 mm (der Durchmesser der vom Mediator bedeckten Oberfläche der Elektrode) und eine Dicke von 0,045 mm (Dicke des Nylon-Sorbens), was ein Volumen von 0,57 μL ergab. Von diesem Raum waren ungefähr 80% mit Nylon gefüllt, und die anderen 20% stellten einen Hohlraum innerhalb des Nylon-Sorbens dar. Das resultierende Volumen der Probe innerhalb der Messzone betrug ungefähr 0,11 μL.
Es wurde eine Gegen-/Bezugselektrode in Kontakt mit dem Abstandshalter und der Seite des Sorbens gebracht, die gegenüber der Arbeitselektrode lag, so dass sich die beiden Elektroden gegenüber lagen. Die Gegen-/Bezugselektrode war auf einem Mylar^TM-Film mit einer Dicke von 0,175 mm und einem Durchmesser von ungefähr 2,5 cm aufgebaut, auf den eine 12 μm dicke Schicht aus Silber/Silberchlorid mit einem Durchmesser von ungefähr 1 cm durch Siebdruck aufgebracht worden war.
Die Elektroden, das Sorbens und der Abstandshalter wurden unter Verwendung von Platten auf jeder Seite des Elektrodenzusammenbaus zusammengepresst. Die Platten wurden aus Polycarbonat-Kunststoff ausgebildet und fest zusammengeklammert, um den Sensor zusammenzuhalten. Die Elektroden wurden vor der Verwendung 48 Stunden lang an Luft gelagert.
Flachstecker ragten sowohl aus der Arbeitselektrode als auch aus der Gegen-/Bezugselektrode heraus und stellten einen elektrischen Kontakt mit der Ausrüstung für die Analyse bereit. Es wurde ein Potentiostat eingesetzt, um einen Potentialunterschied von +200 mV zwischen der Arbeitselektrode und der Gegen-/Bezugselektrode anzulegen, wobei die Arbeitselektrode die Anode war. Es erfolgte kein Stromfluss zwischen den Elektroden in Abwesenheit der Probe, was erwartet worden war, da kein leitender Weg zwischen den Elektroden vorlag.
Die Probe wurde über einen kleinen Anschluss aus dem Sorbensmaterial aus Nylon, der durch eine Verlängerung des Nylon-Sorbens in der Probenkammer gebildet wurde, eingeführt. Die Flüssigkeit wurde über eine Dochtwirkung in das Sorbens gesaugt, als ein Kontakt zwischen der Probe und dem Sorbensanschluss hergestellt wurde. Als die Probenkammer sich füllte und die Probe in Kontakt mit den Elektroden geriet, floss ein Strom zwischen den Elektroden. Wenn Glucosemoleküle in der Probe in Kontakt mit der Glucoseoxidase auf der Arbeitselektrode kamen, wurden die Glucosemoleküle zu Gluconolacton elektrooxidiert. Die Osmium-Redoxzentren im Redoxmediator reoxidierten dann die Glucoseoxidase. Die Osmiumzentren wurden ihrerseits durch die Reaktion mit der Arbeitselektrode reoxidiert. Das führte zu einem Strom, der gemessen und gleichzeitig von einem Coulometer (EG & G Princeton Applied Research Model Nr. 173) integriert wurde.
Die elektrochemische Reaktion dauerte an, bis der Strom einen Steady-State-Wert erreichte, was anzeigte, dass mehr als 95% der Glucose elektroreduziert worden waren. Die Stromkurve, die durch die Messung des Stroms zu bestimmten Zeiten erhalten wurde, wurde integriert, um die Ladungsmenge zu bestimmen, die durch die elektrochemische Reaktion geflossen war. Diese Ladungen wurden dann gegen die bekannte Glucosekonzentration aufgetragen, um eine Eichkurve zu erzeugen.
Der Sensor wurde unter Verwendung von 0,5 μL-Aliquots von Lösungen getestet, die bekannte Glucosekonzentrationen in einem Puffer aus einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit oder in einem Kontrollserum enthielten (Baxter-Dade, Monitrol Level 1, Miami, Florida), und zwar im Bereich von 3 bis 20 mM Glucose. Die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit wurde als Mischung der folgenden Salze hergestellt: 126 mM NaCl, 27,5 mM NaHCO₃, 2,4 mM KCl, 0,5 mM KH₂PO₄, 1,1 mM CaCl₂ × 2H₂O und 0,5 mM Na₂SO₄.
Die Ergebnisse der Analysen sind in der Tabelle 1 und der 7 gezeigt. In der Tabelle 1 ist Q_avg die durchschnittliche Ladung, die zur Elektrolyse der Glucose in 3–6 gleichen Testproben benötigt wurde (7 stellt die Ladung für jede der Testproben graphisch dar), und der Zeitpunkt des Anstiegs auf 90% entspricht der Zeit, die benötigt wurde, um 90% der Glucose zu elektrolysieren. Die Daten zeigen eine Genauigkeit des Sensors von 10–20%, was eine geeignete Empfindlichkeit des Sensors für niedrige Glucosekonzentrationen sowie für den physiologisch relevanten Bereich (30 μg/- bis 600 μg/dL) anzeigt.
TABELLE 1 Ergebnisse für den Sensor bei Verwendung von Glucoseoxidase
Die Mittelwerte der gemessen Glucosekonzentration wurden über eine oder mehrere Gleichungen angepasst, um eine Eichkurve zu erhalten. Die 8 zeigt die Eichkurven für die Glucose/Puffer-Daten der Tabelle 1. Eine der Messungen bei 15,0 mM Glucose wurde aus diesen Berechnungen heraus gelassen, da sie mehr als zwei Standardabweichungen vom Mittelwert der Messungen entfernt lag. Die höheren Glucosekonzentrationen (10–20 mM) wurden über eine lineare Gleichung angepasst. Die niedrigeren Glucosekonzentrationen wurden über ein Polynom zweiter Ordnung angepasst.
Die 9 zeigt die Daten der Tabelle 1, die in einem Fehlernetz aufgetragen wurden, das von Clarke et al., Diabetes Care 5: 622–27, 1987, entwickelt worden war, um die Folgen von Fehlern, die auf einer ungenauen Messung der Glucosekonzentration basieren, zu bestimmen. Die graphische Darstellung trägt die "wahre" Glucosekonzentration gegen die gemessene Glucosekonzentration auf, wobei die gemessene Glucosekonzentration durch das Berechnen einer Glucosekonzentration unter Verwendung der Eichkurven der 8 für jeden Datenpunkt der 7 bestimmt wird. Die Punkte in der Zone A sind genau, diejenigen in der Zone B sind klinisch akzeptabel, und diejenigen in den Zonen C, D und E führen zu zunehmend ungeeigneten und schließlich gefährlichen Behandlungen.
Es gab 34 Datenpunkte. Von diesen Datenpunkten fielen 91% in die Zone A, 6% in die Zone B und 3% in die Zone C. Nur von einer Ablesung wurde festgestellt, dass sie in die Zone C fiel. Diese Ablesung lag außerhalb der Messskala und ist in der 9 nicht gezeigt. Somit fielen 97% der Ablesungen in die klinisch akzeptablen Zonen A und B.
Die Gesamtzahl der Os-Atome wurde bestimmt, indem das gesamte Os reduziert und dann mit glucosefreiem Puffer in der Probenkammer elektrooxidiert wurde. Das führte zu einer Ladung von 59,6 ± 5,4 μC. Der Vergleich dieses Ergebnisses mit dem Ergebnis für den glucosefreien Puffer in der Tabelle 1 zeigt, dass weniger als 20% des Os vor der Zugabe der Probe in der reduzierten Form vorliegen. Die Variabilität der Osmium-Menge im reduzierten Zustand liegt bei weniger als 5% der Gesamtmenge des vorhandenen Osmiums.
Beispiel 2
Ansprechen des Glucose-Sensors auf störende Stoffe
Es wurde ein Sensor, der auf die gleiche Weise konstruiert wurde, wie es oben für Beispiel 1 beschrieben wurde, zur Bestimmung des Ansprechens des Sensors auf störende Stoffe verwendet. Die primären elektrochemisch störenden Stoffe für Blutglucosemessungen sind Ascorbat, Acetaminophen und Urat. Die normalen physiologischen oder therapeutischen (im Falle von Acetaminophen) Konzentrationsbereiche dieser üblichen Störstoffe sind:
Ascorbat: 0,034–0,114 mM
Acetaminophen: 0,066–0,200 mM
Urat (männlicher Erwachsener): 0,27–0,47 mM
(Tietz, in: Textbook of Clinical Chemistry, C. A. Burtis und E. R. Ashwood, Hrsg., W. B. Saunders Co., Philadelphia 1994, S. 2210–12.
Es wurden gepufferte, glucosefreie Lösungen der störenden Stoffe in Konzentrationen der störenden Stoffe am oberen Ende des physiologischen oder therapeutischen Bereiches, der oben angegeben ist, getestet. Das injizierte Probenvolumen lag in jedem Fall bei 0,5 μL. Es wurde ein Potential von +100 mV oder +200 mV zwischen den Elektroden angelegt. Die durchschnittliche Ladung (Q_avg) wurde berechnet, indem ein durchschnittlicher Hintergrundstrom, der mit einer Lösung erhalten wurde, die nur aus Puffer bestand (d. h. keinen Störstoff enthielt), von dem durchschnittlichen Signal abgezogen wurde, das mit dem vorhandenen Störstoff erhalten wurde. Die erhaltene durchschnittliche Ladung wurde mit den Signalen aus der Tabelle 1 für Glucosekonzentrationen von 4 mM und 10 mM verglichen, um den prozentualen Fehler zu bestimmen, der aus dem Störstoff resultierte.
TABELLE 2 Ansprechen der Glucose-Sensoren auf Störstoffe
Diese Ergebnisse zeigten, dass Ascorbat und Acetaminophen keine signifikanten Störstoffe für die Konfiguration des Glucose-Sensors darstellten, insbesondere für Messungen bei niedrigem Potential. Urat führte jedoch zu signifikanten Störungen. Diese Störung kann minimiert werden, indem das Ansprechen des Sensors auf eine Uratkonzentration von 0,37 mM kalibriert wird, beispielsweise durch das Subtrahieren einer geeigneten Ladungsmenge, wie sie durch die Extrapolation dieser Ergebnisse aus allen Glucosemessungen des Sensors bestimmt wird. Der Fehler der aus einer Variation der Uratkonzentration um 0,10 mM resultiert (der Bereich der Uratkonzentration beträgt bei einem erwachsenen Mann 0,27 bis 0,47) würde bei 4 mM Glucose und 100 mV ungefähr 6% betragen.
Beispiel 3
Sensor mit Glucosedehydrogenase
Es wurde ein Sensor, der dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich war, hergestellt und in diesem Beispiel eingesetzt, außer dass die Glucoseoxidase durch die Pyrrolchinolinchinon-Glucosedehydrogenase ersetzt wurde und ein Potential von nur +100 mV im Gegensatz zu dem +200 mV Potential aus Beispiel 1 angelegt wurde. Die Ergebnisse sind unten in der Tabelle 3 und graphisch in der 10 dargestellt.
TABELLE 3 Ergebnisse für einen Sensor unter Verwendung von Glucosedehydrogenase
Die Ergebnisse zeigten, dass die Ladung, die vom Glucosedehydrogenase-Sensor erhalten wurde, viel größer war als diejenige des vergleichbaren Glucoseoxidase-Sensors, insbesondere für niedrige Glucosekonzentrationen. Für 4 mM Glucosekonzentrationen unterschieden sich die erhaltenen Messwerte der beiden Sensoren um einen Faktor von fünf. Außerdem arbeitete der Glucosedehydrogenase-Sensor bei einen niedrigeren Potential, wodurch die Wirkungen von störenden Stoffen vermindert wurden.
Außerdem konnten die Ergebnisse aus der Tabelle 3 alle mit einer linearen Eichkurve angepasst werden, im Gegensatz zu den Ergebnissen aus Beispiel 1, wie in der 10 gezeigt ist. Eine einzige lineare Eichkurve wird stark bevorzugt, um die Konstruktion und den Betrieb des Sensors zu vereinfachen.
Außerdem würden unter der Annahme, dass die Ergebnisse bezüglich der störenden Stoffe aus der Tabelle 2 für diesen Sensor anwendbar sind, alle störenden Stoffe einen Fehler von weniger als 7% für eine Glucoselösung von 3 mM bei einem Potential von 100 mV bewirken.
Beispiel 4
Bestimmung der Lactatkonzentration in einem Flüssigkeitsstrom
Der Sensor für dieses Experiment wurde unter Verwendung einer Flusszelle (BioAnalytical Systems Inc., Nr. MF-1025) mit einer Elektrode aus glasförmigen Kohlenstoff konstruiert. Ein Redoxmediator wurde auf die Elektrode der Flusszelle aufgetragen, um eine Arbeitselektrode bereit zu stellen. In diesem Falle war der Redoxmediator ein Polymer, das durch das Komplexieren von Poly(1-vinylimidazol) mit Os(4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin)₂Cl₂ in einem Verhältnis von 1 Osmium auf jeweils 15 funktionelle Imidazolgruppen hergestellt wurde. Die Lactatoxidase wurde mit dem Polymer über Polyethylenglycol-Diglycidylether vernetzt. Der Mediator wurde auf die Elektrode in einer Menge von 500 μg/cm² und in einer Dicke von 5 μm aufgetragen. Der Mediator wurde mit einer spurgeätzen Membran aus Polycarbonat (Osmonics-Poretics Nr. 10550) bedeckt, um die Haftung im Flüssigkeitsstrom zu verbessern. Die Membran wurde dann mit einer einzigen, 50 μm dicken Abstandshalter-Dichtung (BioAnalytical Systems Inc., Nr. MF-1062) beschichtet, die einen Hohlraum enthielt, der die Probenkammer und die entsprechende Messzone definierte. Der Zusammenbau des Sensors wurde durch die Befestigung eines Zellblocks (BioAnalytical Systems Inc., Nr. MF-1005), der die Bezugs- und die Hilfselektrode der Flusszelle enthielt, vervollständigt.
Die Probenkammer entsprach in diesem Falle einem 50 μm dicken Zylinder (die Dicke der Abstandshalter-Dichtung), der sich in Kontakt mit einer Elektrode mit einer Oberfläche von 0,031 cm², die mit einem Mediator beschichtet war, befand. Das berechnete Probenvolumen in der Messzone dieses Sensors lag bei ungefähr 0,16 μL.
Die Flussgeschwindigkeit des Flüssigkeitsstroms lag bei 5 μL/min. Es wurde ein Standardpotentiostat mit drei Elektroden an den Anschlüssen der Zelle befestigt, und es wurde ein Potential von +200 mV zwischen der mit dem Redoxmediator beschichteten Elektrode aus glasförmigen Kohlenstoff und der Bezugselektrode angelegt. Das Potential war ausreichend, um die enzymvermittelte Oxidation von Lactat zu bewirken.
Als der Flüssigkeitsstrom durch den Sensor strömte, wurde ein Steady-State-Strom gemessen, der proportional zur Lactatkonzentration war. In regelmäßigen Abständen wurde der Flüssigkeitsstrom angehalten, und man ließ den Strom zwischen den Elektroden fließen, bis ungefähr das gesamte Lactat in der Messzone elektrooxidiert worden war, was sich durch das Erreichen eines stabilisierten Steady-State-Stroms anzeigte. Die Gesamtladung Q, die für die Elektrooxidation des Lactats benötigt wurde, wurde durch die Integration des differentiellen Stroms bestimmt, der während des Stopps des Stroms gemessen wurde, bis der Strom einen Steady-State-Zustand erreichte. Die Konzentration wurde dann mittels der folgenden Gleichung berechnet: [Lactat] = Q/2FVwobei V das Volumen der Probe in der Messzone und F die Faradaykonstante ist.
Dieser Test wurde mit Lactatlösungen mit nominalen Lactatkonzentra tionen von 1,0, 5,0 und 10,0 mM durchgeführt. Die in dem Test gemessenen Konzentrationen lagen bei 1,9, 5,4 bzw. 8,9 mM.
Beispiel 5
Bestimmung des Oxidationszustandes von Os(4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin)₂Cl^+/+2 im Komplex mit Poly(1-vinylimidazol)
Ein Sensor mit einer Konstruktion aus drei Elektroden wurde kommerziell von Ecossensors Ltd., Long Hanborough, England, unter der Modellbezeichnung "large area disposable electrode" bezogen. Der Sensor enthielt parallele und koplanare Arbeits-, Bezugs- und Gegenelektroden. Die Arbeitsfläche (0,2 cm²) und die Gegenelektroden wurden durch gedruckten Kohlenstoff gebildet, und die Bezugselektrode wurde durch gedrucktes Ag/AgCl gebildet. Ein Redoxmediator war auf der Arbeitselektrode aus Kohlenstoff aufgetragen. Der Redoxmediator wurde durch das Komplexieren von Poly(1-vinylimidazol) mit Os(4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin)₂Cl₂ in einem Verhältnis von 15 Imidazolgruppen pro Os-Kation, gefolgt von einer Vernetzung des Osmium-Polymers mit Glucoseoxidase unter Verwendung von Polyethylenglycol-Diglycidylether gebildet.
Die Elektrode wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gehärtet. Die regelmäßige Anordnung aus den koplanaren Elektroden wurde dann in eine gepufferte Elektrolytlösung eingetaucht, und es wurde ein Potential von +200 mV (ausreichend zur Umwandlung von Os(II) in Os(III)) zwischen der Arbeitselektrode und der Bezugselektrode angelegt.
Nach dem Anlegen des Potentials trat eine nicht nachweisbare Ladung von weniger als 1 μC über. Die nachfolgende Reduktion und Reoxidation des Redoxmediators führte zu einer Ladung für die Umwandlung des gesamten Os aus Os(II) in Os(III) von 65 μC. Somit befanden sich mehr als 98% der Os-Kationen im Redoxmediator im gewünschten oxidierten Os(III)-Zustand.
Beispiel 6
Bestimmung des Oxidationszustandes von Os(4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin)₂Cl^+/+2 im Komplex mit Poly(4-vinylpyridin)
Es wurde ein Experiment, das demjenigen aus Beispiel 5 ähnlich war, mit der gleichen Konfiguration aus Arbeits-/Gegen-/Bezugselektrode durchgeführt, außer dass anstelle des Redoxmediators auf der Arbeitselektrode ein Komplex von Os(4,4'-Dimethoxy-2,2'-bipyridin)₂Cl₂ mit Poly(4-vinylpyridinn) mit 12 Pyridingruppen pro Os-Kation, der mit Glucoseoxidase über Polyethylenglycol-Diglycidylether vernetzt war, verwendet wurde.
Es wurden zwei Sensoren konstruiert. Die Elektroden der beiden Sensoren wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gehärtet. Die Elektroden wurden dann in eine gepufferte Elektrolytlösung eingetaucht, und es wurde ein Potential von +200 mV zwischen der Arbeits- und der Bezugselektrode angelegt.
Beim Anlegen des Potentials an die Elektroden floss eine Ladung von 2,5 μC bzw. 3,8 μC durch die beiden Sensoren. Die nachfolgende Reduktion und Reoxidation des Redoxmediators ergab Oxidationsladungen von 27,9 μC bzw. 28,0 μC. Demnach enthielten diese Sensoren ursprünglich 91% und 86% der Os-Kationen im erwünschten oxidierten Os(III)-Zustand.
Beispiel 7
Optischer Sensor
Es wird ein optischer Sensor konstruiert, indem ein Film aus einem Redoxpolymer mit vernetztem Enzym auf einen lichtdurchlässigen Träger, wie einen Objektträger aus Glas, aufgetragen wird. Die Menge des Redoxmediators ist gleich oder größer (in stöchiometrischem Sinne) als die maximale Menge des Analyten, von der man erwartet, dass sie die Messzone füllt. Das Abstandshaltermaterial, das Sorbens und die sich gegenüber liegenden Träger werden fest zusammengeklammert. Die Probenkammer wird so abgewandelt, dass sie Licht durch den zusammengebauten Sensor zu einem Detektor für optische Dichte oder zu einem Detektor für Lumineszenz oder für Fluoreszenz zuführt. Wenn die Probe die Probenkammer füllt und der Redoxmediator oxidiert wird sind Veränderungen der Absorption, der Transmission, der Reflexion oder der Lumineszenz und/oder der Fluoreszenz des Redoxmediators in der Kammer mit der Menge der Glucose in der Probe korreliert.
Beispiel 8
Blutvolumina aus Oberarm-Lanzettenstichen
Der Unterarm eines einzelnen Individuums wurde mit einer Lanzette mehrere Male punktiert, um die Reproduzierbarkeit der mittels dieses Verfahrens erhaltenen Blutvolumina zu bestimmen. Trotz mehr als 30 Lanzettenstichen in den vorderen Teil jedes Unterarms und in den hinteren Teil des linken Unterarms gab die Person an, dass alle Stiche praktisch schmerzlos waren.
Der Unterarm wurde mit einer Payless-Color-Lanzette punktiert. Das Blut aus jedem Stich wurde mittels eines Kapillarröhrchens von 1 μL gesammelt, und das Volumen wurde über die Messung der Länge der Blutsäule bestimmt. Die aus jedem Stich erhaltenen Volumina sind unten in der Tabelle 4 gezeigt.
TABELLE 4 Volumen von Lanzettenstichen
Beispiel 9
Ein Sensor mit einem diffundierbaren Redoxmediator
Ein Sensor wurde durch Drucken von Graphittinte (Graphite #G4491, Ercon, Wareham, MA) auf ein Polyestersubstrat ausgebildet. Eine Mischung aus 5,5 μg/cm² [Os(Dimethoxybipyridin)₂(vinylimiadzol)Cl]Cl, 23,7 μg/cm² PQQ-Glucosedehydrogenase und 18,2 μg/cm² Zonyl FSO^®-Tensid (E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) wurde auf einen Abschnitt der Arbeitselektrode abgelagert. Ein 150 μm dickes druckempfindliches Klebstoffband wurde dann an der Arbeitselektrode angebracht, wobei nur ein Abschnitt der Arbeitselektrode freigelassen wurde, um eine Probenkammer zu bilden. Ein zweiter Polyesterfilm mit einer auf dem Film abgelagerten Gegenelektrode wurde über dem druckempfindlichen Klebstoffband vorgesehen. Die Gegenelektrode wurde ausgebildet, indem Ag/AgCl-Tinte (Silver/Silver Chloride #R414, Ercon, Wareham, MA) über dem zweiten Polyesterfilm angeordnet wurde. Die Ag/AgCl-Gegenelektrode wurde mit ungefähr 100 μg/cm² methylisiertem Poly(vinylimidazol) beschichtet, das unter Verwendung von PEGDGE vernetzt wurde.
Beispiel 10
Messung von Glucose unter Verwendung eines Sensors mit einem diffundierbaren Redoxmediator bei einem Potential von 0 V
Sensoren wurden wie in Beispiel 9 beschrieben ausgebildet und verwendet, um Glucose/Pufferlösungen bei 0, 90, 180, 270 und 360 mg/dl Glucose-Konzentration zu messen. Die über die Zeit für jede dieser Lösungen gemessene Ladung ist in 15 graphisch dargestellt. In der Abwesenheit von Glucose zeigt der Sensor ungefähr 3 mg/dl Glucose-Konzentration an. 16 zeigt die gemessene Ladung über der Glucose-Konzentration für drei Sensoren bei jeder Glucose-Konzentration. Die gemessene Ladung variiert linear mit der Glucose-Konzentration ähnlich zu dem, was für Sensoren unter Verwendung eines nicht-auslaugbaren Redoxmediators beobachtet wird.
Beispiel 11
Weitere Sensoren, die unter Verwendung eines diffundierbaren Redoxmediators ausgebildet sind
Sensoren A und B wurden durch Drucken von Graphittinte (Graphite #G4491, Ercon, Wareham, MA) auf ein Polyestersubstrat gedruckt. Für Sensor A wurde eine Mischung aus 8,0 μg/cm² [Os(Dimethoxybipyridin)₂(vinylimidazol)Cl]Cl, 34,7 μg/cm² PQQ-Glucose-Dehydrogenase und 26,6 μg/cm² Zonyl FSO^®-Tensid (E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) auf einen Abschnitt der Arbeitselektrode abgelagert. Für Sensor B wurde eine Mischung aus 24 μg/cm² [Os(Dimethoxybipyridin)₂(vinylimidazol)Cl]Cl, 104 μg PQQ-Glucose-Dehydrogenase und 80 μg/cm² Zonyl FSO^®-Tensid (E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) auf einen Abschnitt der Arbeitselektrode aufgetragen. Ein drucksensitives 200 μm-Klebstoffband wurde dann über der Arbeitselektrode von jedem Sensor ausgebildet, wobei nur ein Abschnitt der Arbeitselektrode freigelassen wurde, um eine Probenkammer zu bilden. Ein zweiter Polyesterfilm mit einer auf dem Film angeordneten Gegenelektrode wurde über dem druckempfindlichen Klebstoffband vorgesehen. Die Gegenelektrode von jedem Sensor wurde durch Ablagern von Ag/AgCl-Tinte (Silver/Silver Chloride #R414, Ercon, Wareham, MA) über dem zweiten Polyesterfilm ausgebildet. Die Ag/AgCl-Gegenelektrode wurde mit ungefähr 100 μg/cm² mit methylisierten Poly(vinylimidazol) beschichtet, das unter Verwendung von PEDGE vernetzt wurde.
Beispiel 12
Variieren der Menge an diffundierbaren Redoxmediator in dem Sensor
Die Sensoren A und B wurden getestet, um die Zeitmenge zu bestimmen, die für die Elektrolyse des Analyten erforderlich ist. 17 zeigt die Ergebnisse. Das Vergrößern der Menge an diffundierbaren Redoxmediator in der Probe verringert die Antwortzeit des Sensors.
Beispiel 13
Klinische Genauigkeit des kleinvolumingen Sensors
Der Sensor von diesem Beispiel wurde entsprechend der Ausführung der Erfindung konstruiert, die in den 24A, 24B und 24C gezeigt ist. Die Kohlenstoff-Arbeitselektrode wurde auf einem Melinex^TM-Polyesterfilm (DuPont, Wilmington, Delaware) gedruckt, wie in Beispiel 11 beschrieben. Die Kohlenstoffelektrode wurde mit 18 μg/cm² Os[(MeO)₂bpy]₂(1-Vinylimidazol)Cl₃, 162 μg/cm² GDH (Toyobo, Japan), 1,35 μg/cm² PQQ (Fluka, Mila, Wisconsin) und 60 μg/cm² Zonyl FSO (DuPont, Wilmington, Delaware) beschichtet. Die Beschichtungen wurde auf die Arbeitselektrode bei 18°C und in 50% relativer Feuchtigkeit aufgetragen. Ein Klebstoff (50 μm Dicke) wurde auf der Kohlenstoffelektrode angeordnet, die die beschichtete Oberfläche umgibt, und einen Kanal mit einer Breite von ungefähr 0,04 Inch bildet.
Zwei Ag/AgCl Gegen-/Bezugselektroden wurden auf einem zweiten Melinex^TM-Polymerfilm gedruckt, wie in Beispiel 11 beschrieben. Der Film wurde dann derart in Kontakt mit dem Klebstoff und dem Arbeitselektrodenfilm gebracht, dass die Arbeitselektrode und die beiden Gegenelektroden sich einander gegenüberlagen. Die Gegen-/Bezugselektroden wurden mit 142 μg/cm² methylisiertem Polyvinylimidazol, 18 μg/cm² PEGDGE (Polysciences, Warington, Pennsylvania) und 7 μg/cm² Zonyl FSO (DuPont, Wilmington, Delaware) beschichtet. Eine der Gegenelektroden, die stromaufwärts von der anderen Gegenelektrode lag, wurde als eine Anzeigeelektrode verwendet, um zu bestimmen, wann die Probenkammer voll war. Die Sensoren wurden durch drei Überfahrten mit einem Handroller laminiert und für 3 Tage bei Raumtemperatur über CaSO₄ gealtert.
Die Sensoren wurden derart konstruiert, dass wenn ein hinreichender Strom zwischen der Anzeige- und der Gegen-/Bezugselektrode floss, ein äußerer Schaltkreis ein visuelles Signal emittiert, das anzeigt, dass der Kanal, der über der Arbeitselektrode lag, voll von Blut war.
Ein paar Tage vor dem Verwenden der Sensoren wurden Trockenkapazitätsmessungen gemacht, um die Gleichförmigkeit des Probenkammervolumens zu bestimmen. Die Variation in der Kapazität reflektierte die Misanordnung der Elektroden und/oder die Variation in der Klebstoffdicke. Die mittlere gemessene Kapazität betrug 7,49 pF mit einer Standardabweichung von 0,28 pF oder 3,8%. Die maximale gemessene Kapazität betrug 8,15 pF und die minimale gemessene Kapazität betrug 6,66 pF.
Die Sensoren wurden verwendet, um die Glucose-Konzentration in Blutproben zu bestimmen, die von 23 Leuten erhalten wurden. Bei der Studie lagen die Leute im Bereich von 26 bis 76 Jahre, vierzehn waren Männer und neun waren Frauen. Sechs der Leute wurden mit Typ 1-Diabetes diagnostiziert, 16 wurden mit Typ 2-Diabetes diagnostiziert und eine Person war unbekannt hinsichtlich des Diabetes-Zustands. Die untersuchten Leute hatten einen mittleren Hämatokrit-Wert von 40,7% mit einer Standardabweichung von 3,9%. Der maximale Hämatokrit-Wert betrug 49% und der minimale Hämatokrit-Wert betrug 33,2%.
Eine Blutprobe wurde für jede Person genommen, indem in den Finger der Testperson gestochen wurde. Ein kleinvolumiger Sensor wurde mit diesem Restblut gefüllt.
Drei Blutproben für jede Person wurden dann in kleinvolumigen Sensoren unter Verwendung einer 2 mm Carelet^TM gesammelt, um den Arm anzustechen. Wenn eine geeignete Probe nicht in 10 s erhalten wurde, wurde das Gebiet um die punktierte Wunde geknetet, und dann der Sensor gefüllt. Sechzehn der Neunundsechzig Proben erforderten, dass die Wunde geknetet wurde.
Drei Blutproben pro Person wurden durch Venenpunktur entnommen. YSI-Blutglucose-Messungen und Hämatokrit-Messungen wurden an zumindest einer Probe gemacht. Sechsundvierzig kleinvolumige Sensoren wurden auch mit Blut von diesen Proben gefüllt.
Messungen von dem Sensor wurden bei einem anliegenden Potential von 0 mV durchgeführt. BAS-Potentiostaten (CV50W, West Lafayette, Indiana) wurden "an" gemacht, bevor irgendeine Probe eingebracht wurde, so dass die Elektrolyse sofort stattfand, als sich die Streifen füllten. Die Stromabnahme erfolgte 150 Sekunden (diese Ladung wird als "komplette" Elektrolyse bezeichnet) obwohl die meisten Untersuchungen im wesentlichen lange vor 150 s abgeschlossen waren. Keine Ergebnisse wurden verworfen. Drei aufeinanderfolgende Sensorblutglucosemessungen wurden gemacht.
Messungen für die Kontrollproben wurden unter Verwendung einer YSI-Blutglucosemessung (Yellow Springs Instruments, Model 2300 Chemical Glucose Analyzer) durchgeführt.
Die Daten wurden gegen venöse YSI-Ergebnisse aufgetragen, und eine lineare Funktion wurde aus den Daten bestimmt. Alle Daten wurden für "komplette" (150 Sekunden) Elektrolysen von Glucose in dem Sensor gesammelt.
28 zeigt die Daten für 69 kleinvolumige Sensoren, die an Blut getestet wurden, das von dem Arm erhalten wurde. R² betrug 0,947, wobei der mittlere CV (Variationskoeffizient) 4,8% betrug, und das RMS (Wurzel des mittleren Quadrats) CV 5,7% betrug.
29 zeigt die Daten für 23 kleinvolumige Sensoren, die an Blut getestet wurden, das von dem Finger erhalten wurde. R² betrug 0,986.
30 zeigt die Daten für 46 kleinvolumige Sensoren, die an venösem Blut getestet wurden. R² betrug 0,986. Das mittlere CV betrug 3,8%. Die RMS CV betrug 4,6%.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen in dieser Spezifikation sind auf dem Niveau des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet indikativ, den diese Erfindung betrifft.

Claims

Sensor (20) zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einem Probenfluid, wobei der Sensor umfaßt: ein Elektrodenpaar, das eine Arbeitselektrode (22, 502, 522, 542, 562, 580, 602, 642, 1010) und eine Gegenelektrode (24, 510, 530, 550, 570, 584, 610, 650, 1020) umfaßt, wobei wenigstens ein Abschnitt der Arbeitselektrode innerhalb eines wirksamen Abstands von nicht mehr als 200 μm von einem Abschnitt der Gegenelektrode liegt und die Gegenelektrode gegebenenfalls eine Gegen/Bezugs-Elektrode ist; eine fakultative Bezugselektrode (512, 532, 552, 572, 585, 612, 652); eine Probenkammer (26, 526, 546, 566, 582, 606, 646), die das Probenfluid in elektrolytischem Kontakt mit der Arbeitselektrode, der Gegenelektrode und, soweit vorhanden, der Bezugselektrode halten kann, wobei die Probenkammer eine Meßzone umfaßt, die angrenzend an die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und, soweit vorhanden, die Bezugselektrode angeordnet ist, wobei die Meßzone so dimensioniert ist, dass sie ein Volumen von nicht mehr als etwa 1 μL Probenfluid enthält und die Probenkammer gegebenenfalls so dimensioniert ist, dass sie nicht mehr als etwa 1 μL des Probenfluids enthält; und ein auf den Analyten ansprechendes Enzym und einen diffundierbaren Redox-Mediator, die in der Meßzone angeordnet sind; wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass ein Hintergrundsignal, das durch den diffundierbaren RedoxMediator erzeugt wird, nicht größer ist als entweder (a) das Fünffache eines Signals, das durch Oxidation oder Reduktion einer mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten erzeugt wird; oder (b) das Fünffache eines Signals, das durch Oxidation oder Reduktion einer solchen Menge des Analyten erzeugt wird, die einer mittleren Abweichung von einer mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten entspricht.
Sensor (20) zur Bestimmung der Konzentration des Analyten Glucose in einem Probenfluid, wobei der Sensor umfaßt: ein Elektrodenpaar, das eine Arbeitselektrode (22, 502, 522, 542, 562, 580, 602, 642, 1010) und eine Gegenelektrode (24, 510, 530, 550, 570, 584, 610, 650, 1020) umfaßt, wobei die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode durch einen wirksamen Abstand in einem Bereich von 25 bis 1000 μm voneinander getrennt sind; eine Probenkammer (26, 526, 546, 566, 582, 606, 646), die das Probenfluid hält, wobei die Probenkammer eine Meßzone umfaßt, die angrenzend an die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode angeordnet ist, wobei die Meßkammer so dimensioniert ist, dass sie ein Volumen von nicht mehr als etwa 1 μL der Probe enthält; und ein auf den Analyten ansprechendes Enzym und einen diffundierbaren Redox-Mediator, die in der Meßzone angeordnet sind; wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass ein Hintergrundsignal, das von dem diffundierbaren Redox-Mediator erzeugt wird, nicht mehr als das Fünffache eines Signals beträgt, das durch Oxidation oder Reduktion von 5 mM Glucose erzeugt wird.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass ein Hintergrundsignal, das durch den diffundierbaren Redox-Mediator erzeugt wird, gleich ist wie oder kleiner ist als das Signal, das durch Oxidation oder Reduktion der mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten erzeugt wird.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass sein Hintergrundsignal, das durch den diffundierbaren Redox- Mediator erzeugt wird, nicht mehr als 25% des Signals beträgt, das durch Oxidation oder Reduktion des Analyten erzeugt wird und vorzugsweise nicht mehr als 5% des Signals beträgt, das durch Oxidation oder Reduktion des Analyten erzeugt wird.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Sensor umfaßt: (a) ein erstes Substrat (500, 520, 540, 560, 579, 600, 640) mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende, wobei das erste Substrat eine erste Seitenkante (656) und eine zweite Seitenkante (658) des elektrochemischen Sensors definiert, die sich von dem proximalen Ende bis zum distalen Ende des ersten Substrats erstrecken, wobei das distale Ende so konfiguriert und angeordnet ist, dass es in ein Sensor-Lesegerät einschiebbar ist; (b) ein zweites Substrat (508, 528, 548, 568, 583, 608, 648), das über dem ersten Substrat angeordnet ist, wobei die Arbeitselektrode auf einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und die Gegenelektrode auf einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist; (c) einen Abstandhalter (28, 504, 524, 544, 564, 581, 604, 644), der zwischen dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und eine erste Öffnung längs der ersten Seitenkante des Sensors definiert und eine zweite Öffnung entlang der zweiten Seitenkante des Sensors, wobei die Probenkammer sich von der ersten Öffnung zu der zweiten Öffnung erstreckt; und (d) wenigstens eine Anzeigeelektrode, die auf wenigstens einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und im Hinblick auf die Meßzone oder die Probenkammer relativ so angeordnet ist, dass festgestellt wird, wenn die Meßzone oder Probenkammer Probe enthält.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Sensor umfaßt: (a) ein erstes Substrat mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende, wobei das distale Ende für einen Einschub in ein Sensor-Lesegerät konfiguriert und angeordnet ist, wobei das erste Substrat eine erste Seitenkante und eine zweite Seitenkante des elektrochemischen Sensors definiert, die sich von dem proximalen Ende zu dem distalen Ende des ersten Substrats erstrecken; (b) ein zweites Substrat, das über dem ersten Substrat angeordnet ist, wobei die Arbeitselektrode auf einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und die Gegenelektrode auf einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist; (c) einen Abstandshalter, der zwischen dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und eine erste Öffnung längs des proximalen Endes des Sensors und eine zweite Öffnung längs der ersten Seitenkante des Sensors definiert, wobei sich die Probenkammer von der ersten Öffnung bis zu der zweiten Öffnung erstreckt; und (d) wenigstens eine Anzeigeelektrode, die auf wenigstens einem von dem ersten und dem zweiten Substrat angeordnet ist und so gegenüber der Meßzone oder der Probenkammer angeordnet ist, dass festgestellt wird, wenn die Meßzone oder die Probenkammer Probe enthält.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Sensor eine Anzeigeelektrode umfaßt, die in dem Sensor angeordnet ist und anzeigt, wenn entweder die Meßzone eine Probe enthält oder wenn die Probenkammer eine Probe enthält.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Anzeigeelektrode auch eine Arbeitselektrode oder eine Gegenelektrode ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, der außerdem ein visuelles oder hörbares Zeichen umfaßt, das mit der Anzeigeelektrode gekoppelt ist und aktiviert wird, wenn die Anzeigeelektrode anzeigt, dass die Meßzone oder die Probenkammer Probe enthält.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Anzeigeelektrode gegenüber einer von der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angeordnet ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 10, wobei der Sensor wenigstens zwei Anzeigeelektroden umfaßt, die in dem Sensor angeordnet sind, wobei eine erste Anzeigeelektrode anzeigt, wenn sich die Meßzone oder die Probenkammer mit Probe zu füllen beginnt, und eine zweite Anzeigeelektrode anzeigt, wenn die Meßzone oder die Probenkammer im wesentlichen mit Probe gefüllt ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 10, wobei der Sensor wenigstens zwei Anzeigeelektroden umfaßt, die in dem Sensor angeordnet sind, wobei zwei der Anzeigeelektroden eine erste Gegen/Anzeigeelektrode und eine zweite Gegen/Anzeigeelektrode umfassen, wobei die Gegenelektrode zwischen der ersten und der zweiten Gegen/Anzeigeelektrode angeordnet ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Meßzone und die Probenkammer das gleiche Volumen aufweisen.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Analyt Glucose ist, und das auf den Analyten entsprechende Enzym ein auf Glucose ansprechendes Enzym ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Analyt eine Droge ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Meßzone an wenigstens zwei Seiten durch die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode begrenzt ist und die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode ggf. ein sich gegenüberliegendes Elektronenpaar bilden, wobei die Meßzone zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angeordnet ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass der Mediator den Analyten oxidiert und das Halbwellenpotential des Redox-Mediators, gemessen durch zyklische Voltametrie in 0,1 M NaCl bei pH 7, nicht mehr als etwa +100 Millivolt beträgt, bezogen auf das Potential der Gegen/Bezugs-Elektrode.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass der Mediator den Analyten oxidiert und das Halbwellenpotential des Redox-Mediators, gemessen durch zyklische Voltametrie in 0,1 M NaCl bei pH 7, etwa das gleiche ist, wie das Potential der Gegen/Bezugs-Elektrode.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass der Mediator den Analyten oxidiert und das Halbwellenpotential des Redox-Mediators, gemessen durch zyklische Voltametrie in 0,1 M NaCl bei pH 7, nicht mehr als etwa –150 Millivolt, bezogen auf das Potential der Gegen/Referenz-Elektrode, beträgt.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19, wobei innerhalb des Sensors der wirksame Diffusionskoeffizient des Redox-Mediators durch das Probenfluid geringer ist als der effektive Diffusionskoeffizient des Analyten durch das Probenfluid und vorzugsweise wenigstens 10-fach geringer ist als der effektive Diffusionskoeffizient des Analyten durch das Probenfluid.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der diffundierbare Mediator ein Molekulargewicht von wenigstens 5.000 Dalton aufweist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass der Redox-Mediator leichter an der Arbeitselektrode elektrolysiert wird als der Gegenelektrode.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Sensor eine molare Menge des Redox-Mediators enthält, die auf einer stöchiometrischen Basis nicht mehr als eine mittlere normale physiologische Menge des Analyten beträgt und der Sensor vorzugsweise eine molare Menge des Redox-Mediators umfaßt, die auf einer stöchiometrischen Basis nicht mehr als 20% einer mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten beträgt.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Arbeitselektrode eine Oberfläche von nicht mehr als etwa 0,01 cm², die in der Meßzone freiliegt, aufweist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Aktivität des Enzyms nicht mehr als 1 Einheit/cm³ beträgt.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 25, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass der diffundierbare Redox-Mediator ausgefällt wird, wenn er an der Gegenelektrode reagiert.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 26, wobei der Sensor so konfiguriert und angeordnet ist, dass ein mathematisches Produkt des wirksamen Diffusionskoeffizienten des Redox-Mediators und der Konzentration des Redox-Mediators nicht mehr als 1 × 10^–12 Mol cm^–1 s^–1 beträgt, wenn das Probenfluid die Meßzone füllt.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27, wobei der diffundierbare Redox-Mediator auf der Arbeitselektrode angeordnet ist.
Sensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 28, wobei das auf den Analyten ansprechende Enzym auf der Arbeitselektrode angeordnet ist.
Verfahren zur Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in einer Probe, das die Schritte umfaßt: Inkontaktbringen einer Probe mit irgendeinem der elektrochemischen Sensoren der Ansprüche 1 bis 29; Erzeugen eines Sensorsignals an der Arbeitselektrode, und Bestimmung der Konzentration des Analyten unter Verwendung des Sensorsignals.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Hintergrundsignal, das durch den diffundierbaren Redox-Mediator erzeugt wird, nicht mehr ist als entweder: (a) das Fünffache eines Signals, das durch Oxidation oder Reduktion einer mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten erzeugt wird; oder (b) das Fünffache eines Signals, das durch Oxidation oder Reduktion einer Menge des Analyten erzeugt wird, die einer mittleren Abweichung von einer mittleren normalen physiologischen Menge des Analyten entspricht; oder (c) das Fünffache eines Signals, das durch Oxidation oder Reduktion von 5 mM Glucose erzeugt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch Coulometrie unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch Amperometrie unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch Potentiometrie unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch Chronoamperometrie unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch Chronopotentiometrie unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 31, wobei die Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten durch eine Cottrell-Meßtechnik unter Verwendung des Sensorsignals umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 37, das außerdem umfaßt: Bereitstellung von Eichdaten für eine Liefermenge von elektrochemischen Sensoren in einem Meßinstrument, wobei die Eichdaten eine Information umfassen, die einen Bezug zu einer Größe für eine Hintergrundladung für die Liefermenge der elektrochemischen Sensoren aufweist; wobei die Stufe der Bestimmung der Konzentration des Analyten die Bestimmung der Konzentration des Analyten unter Verwendung des Sensorsignals und der Eichdaten umfaßt.
Verfahren zur Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Inkontaktbringen einer Probe mit irgendeinem der elektrochemischen Sensoren der Ansprüche 1 bis 29; Beachten eines Signals von der Anzeigeelektrode, das anzeigt, dass die Meßzone Probe enthält; Anlegen eines Potentials zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, um den Analyten in der Probe zu elektrolysieren; Erzeugung eines auf den Analyten ansprechenden Signals durch den Sensor in Reaktion auf die Elektrolyse des Analyten in der Probe; und Bestimmen der Konzentration des Analyten unter Verwendung des auf den Analyten ansprechenden Signals.
Verfahren zur Herstellung irgendeines der elektrochemischen Sensoren der Ansprüche 1 bis 29, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Ausbilden einer Vielzahl von Arbeitselektroden auf einem ersten Substrat; (b) Ausbilden einer Vielzahl von Gegenelektroden auf einem zweiten Substrat; (c) Anordnen einer Abstandshalterschicht auf einem von dem ersten oder dem zweiten Substrat; (d) Entfernen eines Teils der Abstandshalterschicht, um die Bereiche der Probenkammer zu definieren; (e) Bildung eines Laminats aus dem ersten und dem zweiten Substrat; und (f) Abtrennen einer Vielzahl von elektrochemischen Sensoren von den laminierten Substraten, wobei jeder elektrochemische Sensor wenigstens eine von den Arbeitselektroden, wenigstens eine von den Gegenelektroden und wenigstens einen von den Probenkammerbereichen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das erste Substrat ein erster Bereich eines Substrats ist und das zweite Substrat ein zweiter Bereich des Substrats ist, und das außerdem umfaßt: Falten des Substrats, so dass sich die ersten und zweiten Bereiche des Substrats überlagern.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 40 und 41, wobei das Abtrennen der Vielzahl von elektrochemischen Sensoren das Schneiden des ersten und zweiten Substrats umfaßt, um die elektrochemischen Sensoren herauszutrennen und wenigstens ein Ende der Probenkammer der elektrochemischen Sensoren zu definieren.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 40 bis 42, das außerdem das Bilden einer Vielzahl von Anzeigeelektroden auf einem von dem ersten und zweiten Substrat umfaßt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 40 bis 43, wobei der Bereich der Abstandshalterschicht entfernt wird, um die Probenkammerbereiche zu definieren, nachdem die Abstandshalterschicht auf dem ersten und zweiten Substrat angeordnet ist.