JP2752429B2

JP2752429B2 - レセプタが固定された細径管およびレセプタの固定方法

Info

Publication number: JP2752429B2
Application number: JP1109997A
Authority: JP
Inventors: 仁志鶴田; 秀明山田; 通宏中村
Original assignee: KURARE KK
Current assignee: KURARE KK
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1989-04-27
Publication date: 1998-05-18
Anticipated expiration: 2013-05-18
Also published as: JPH02287145A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は微量アナライト物質の測定、特に免疫反応
（抗原−抗体反応）を利用して生体試料のような多成分
系に微量含まれる特定の物質を定量的に測定するために
用いられる、レセプタが固定された細径管およびレセプ
タの固定方法に関するものである。

（従来の技術）生体の生理活性に関与する物質は概して微量であり、
しかも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少
なくない。したがつて、このような微量の生理活性物質
を定量的に測定することは医学、生化学等の生物関連分
野にとつて重要であり、そのための種々の方法が考案さ
れ、実用化されている。そのうち酵素、放射性同位元
素、化学発光物質、螢光物質などを標識として用いるア
ナライト−レセプタ方式の測定が従来より広く普及して
いる。アナライト−レセプタ方式の測定においてはまず
測定対象物質たるアナライトと特異的に結合し得る第１
のレセプタを固定化した固相を試料溶液と標識第２レセ
プタ、もしくは標識アナライト（以下これらの標識体を
コンジユゲートという）と同時、または逐次的に接触さ
せてアナライト−レセプタ反応を行なわせた後、洗浄
し、しかる後に該固相上に残存している標識物質の量を
測定することによつて試料溶液中のアナライトの量を測
定するのである。ここで標識としてはラジオアイソトー
プや酵素等の増感作用の大きい物質が用いられる。また
レセプタとしてはアナライトが抗原やハプテンのときは
それに対する特異抗体、あるいはアナライトが抗体であ
る時はその抗体に対する抗原性物質、アナライトがDNA
やRNAである時にはそれらに相補的なDNAやRNA、アナラ
イトがリガンドである時にはそれに対するレセプタがそ
れぞれ用いられる。かかる測定方法の代表例として不均
一法EIA、いわゆるEnzyme Linked Immuno Sorbent Assa
y（ELISA）が知られている。

ELISAにおいては、試料溶液中の測定対象物質を捕捉
するために、測定対象アナライトと特異的に結合し得る
レセプタを試験管、マイクロプレート等に固定化した固
相が用いられ、増感用の標識として酵素が用いられる。
例えば測定対象アナライトが抗原の場合、サンドイツチ
法ELISAにおいては該抗原に結合し得る第２抗体（第２
レセプタ）に酵素を標識する。また競合法ELISAにおい
ては測定対象抗原と同一の抗原に酵素を標識する。一方
測定対象アナライトが抗体であり、これを抗原サンドイ
ツチ法で測定する場合には、レセプタとして抗原が用い
られ、さらに酵素標識した抗原が第２レセプタとして用
いられる。また競合法によつて抗体（アナライト）を測
定する場合には、レセプタとして抗原を用い、該抗原に
対して測定対象抗体と競合し得る抗体を選択しこれに酵
素が標識される。上記標識として用いられた酵素に対す
る基質溶液と、そしてさらに必要ならば発色試薬を固相
と接触させる。すると基質溶液の分解反応に伴う基質溶
液の光学的性質が変化するので、その変化を観察するの
である。

基質溶液の光学的性質の変化を観察するには、従来か
らいくつかの方法が用いられている。そのうち機器を用
いる方法としては、吸光光度計、蛍光光度計、化学発光
光度計などで基質溶液の光学的性質の変化を光学的に測
定するものがある（例えば、石川、河合、宮井、酵素免
疫測定法、医学書院（1982）参照）。

また、別の方法として基質溶液と対照基質溶液を対比
させ基質溶液の色の違いを肉眼で観察して微量アナライ
ト物質の存在を判定するものがある。

しかしながら機器を用いたこれらの光学的測定系は通
常安定な光源、高感度の光度計、精密な光学系増幅回路
等を要するために、高価で、大がかりで複雑な装置にな
らざるを得なかった。また測定するに当り、特殊な技術
を必要とするため取扱いのための専門の技術者を配置し
なければならなかつた。

一方肉眼で直接観察する方法は、定性的な測定方法で
あり、色の変化のバラツキや観察者の主観が入るので判
定に個人差が生じやすい。さらに、極く微量の物質の測
定の場合には色の変化が少なく判定が困難であつた。

本発明者らは従来の測定方法の欠点を解消し、観察者
の主観による判定規準の曖昧さを除去して、基質溶液の
分解反応を客観的に、しかも高い検出精度で測定する操
作の簡単な微量アナライト物質の測定装置を特願昭63-3
8274号に提案した。

かかる装置は第４図に示すように、基質溶液の入口12
と出口13を有するセル11と、該セル11内に収容されたpH
電極14（通常pH感応電界効果トランジスタが用いられ
る）及び比較電極15と、セル内に基質溶液を供給するポ
ンプ20と、内表面にレセプタを固定した細径管１をセル
11内に収納する手段９で構成されている。

上記装置の基本的な操作は、まず内壁にレセプタを固
定化した細径管１を準備する。次に該細径管をアナライ
ト溶液およびコンジユゲート溶液と反応させ、内壁にア
ナライト−レセプタ複合体（コンジユゲートを含む）を
形成させる。その後細径管を洗浄して遊離のアナライト
や遊離のコンジユゲートを除去する。次に細径管をセル
内に収容する手段９により、第５図に示すように細径管
１がpH電極14のpH感応面16を包囲するようにセル内に収
容する。そのとき細径管１の内壁とpH電極14のpH感応面
16の間隙が1mm以下に設定することが重要である。この
前もしくは後に少くともこの間隙に基質溶液を導入し
て、細径管の内壁に吸着したコンジユゲートによつて基
質溶液を分解し、この時の基質溶液のpH変化をpH電極14
で測定する。

かかる装置は従来の光学的検出器を用いて微量なアナ
ライト物質を検出する方法に比べて、装置が簡易で、ま
た細径管の先端部内壁を固相とするために、洗浄が容易
で、かつ免疫反応時間および酵素反応時間が短くても測
定が可能であるという優れた利点を有している。

（発明が解決しようとする課題）上記測定法において、一定の品質を有する固相用の細
径管を量産することは、再現性の良好な測定結果を得る
ために極めて重要である。また細径管の先端部内壁に固
定されるレセプタは高価であるので、そのロスを少なく
することも重要である。したがつて、本発明の目的は上
記装置に適用可能な、レセプタが固定された細径管を提
供することである。さらに本発明の目的は上記二つの条
件を満たしながら細径管の先端部内壁に抗原や抗体など
のレセプタを固定する方法を提供することである。

（課題を解決するための手段）すなわち、本発明の細径管は先端に設けられたpH電極
挿入用の細管部から後端に向つて拡径するピペツトチツ
プ形状の細径管の少くとも細管部内壁に、測定対象物質
たるアナライトと特異的に結合する第１のレセプタが固
定された細径管である。

さらに本発明の製造方法は複数の上記細径管を直列に
連結して、最後部の細径管の後端開口に吸引手段を接続
するとともに、該吸引手段によつて先端部の細径管の細
管部先端から測定対象物質たるアナライトと特異的に結
合する第１のレセプタを溶解させた緩衝溶液を吸引する
ことにより、各細径管の少くとも細管部内壁に第１のレ
セプタを固定する方法である。

第１図は本発明の細径管１の断面図であり、該細径管
は先端にpH電極を挿入する細管部２と、拡径部３及び後
端に設けられたヘツド４で構成されている。拡径部３は
さらにセルに設けられたテーパに沿つて細径管の先端細
管部２をpH電極に確実に包囲させるためのガイドとして
の第１の拡径部ａと、後述する複数の細径管を直列に連
結するための第２の拡径部ｂ及び吸引手段（図示せず）
の先端に設けられたテーパが嵌設される第３の拡径部ｃ
を有している。細径管１の先端細管部２はその中に挿入
されるpH電極の外径もしくは幅より若干太めに設計され
る。例えばpH電極の幅が450μｍであれば通常内径500〜
600μｍが適当である。また細管部の長さは、通常挿入
されるpH電極の長さの２〜10倍が適当である。例えばpH
電極としてpH感応電界効果トランジスタを使用すると、
その長さが通常1.5mmであるので細管部２の長さは３〜1
5mm程度が好ましい。細径管１の有効内容積は細管部
２、第１の拡径部ａ及び第２の拡径部ｂの内容積の和に
等しい。したがつて所望する容積に応じて第１の拡径部
ａ及び第２の拡径部ｂの内径と長さが設計される。第３
の拡径部ｃの内径およびテーパは吸引手段（通常ピペツ
タ、シリンジなどが使用される）の外径とテーパに対応
して設計される。第２の拡径部ｂの内壁テーパと外壁テ
ーパは複数の細径管を直列に連結したときに液密に接合
するようにその勾配を部分的もしくは全体的に一致させ
る必要であるが、例えば第３の拡径部ｃの内壁と第２の
拡径部ｂの外壁の一部、あるいは細管部２の内壁もしく
は第１の拡径部ａの外壁を接合させても２つの細径管を
液密に連結できる。

細径管の材質としては、例えばポリスチレン、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、ポリ
ビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合
体等のポリオレフイン系ポリマー、ポリエチレンテレフ
タレートやポリブチレンテレフタレート等のポリエステ
ル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等のポリシロキ
サン系ポリマー、６ナイロン、6,6−ナイロン等のポリ
アミド系ポリマー、ポリカーボネート、酢酸セルロース
やニトロセルロースのようなセルロース系ポリマー、さ
らには各種無機ガラスを用いることができる。

上記細径管１の少くとも先端細管部２の内壁に測定対
象物質たるアナライトと特異的に結合する第１のレセプ
タ５が固定されている。細管部２の内壁は第２図に示す
ように多数の凹凸を設けて表面積を大きくすると検出感
度を向上させたり、インキユベーシヨン時間を短縮する
ことができて好ましい。

なお、このような細径管にレセプタを固定化し、微量
物質の検出に利用することができると思われる物質と、
それらにより測定できると考えられる項目の一例を表−
１に示す。

次に細径管１の少くとも先端細管部２の内壁にレセプ
タを固定する方法について説明する。まず複数、例えば
４ケの細径管１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）、１（ｄ）
を用意して、細径管１（ａ）の後端開口から順次細径管
１（ｂ）、１（ｃ）、１（ｄ）の先端を挿入して第３図
に示すように直列に連結する。この場合細径管に設けら
れた第２の拡径部の外壁と、隣接する細径管に設けられ
た第２の拡径部の内壁が液密に接合されるように細径管
を隣接する細径管の内腔へ嵌挿する。

次いで細径管１（ｄ）の端部開口からピペツタのヘツ
ド６を液密に嵌挿する。そして細径管１（ａ）の先端細
管部２を測定対象物質たるアナライトと特異的に結合す
る第１のレセプタを溶解させた緩衡溶液７中に入れ、ピ
ペツタで所望容積の緩衡溶液を各細径管内に吸引する。
この時吸引する溶液の容積Ｖは、第１図に示す細管部２
と第１の拡径部ａの内部の容積をｖ、直列に連結された
細径管の数をｎとすると、Ｖ＝nvであらわされる。この
状態で所定時間静置後、細径管内の緩衡溶液を排出する
ことによりアナライトと特異的に結合する第１のレセプ
タ（例えば抗原、抗体など）が細径管１の先端細管部２
及び第１の拡径部ａ内壁に物理吸着もしくは化学結合に
より固定される。化学結合により固定する場合には細径
管のすくなくとも先端細管部２及び第１の拡径部ａの内
壁に官能基を導入しておく必要がある。

通常細径管の少くとも先端細管部の内壁へ第１のレセ
プタを固定した後、酵素標識体等の非特異的吸着を抑制
するためブロツキングが行われる。そのために例えば、
牛の血清アルブミン等のアツセイ中の免疫反応に関与し
ない蛋白質の水溶液を細径管内に導入して所定時間静置
する。その後ブロツキング溶液を排出し、細径管を乾燥
することにより少くとも細管部に第１のレセプタが固定
された細径管が製造される。細径管の乾燥は複数の細径
管を連結した状態のままでピペツタヘツドをはずし、連
結された細径管の内部に乾燥空気を流通させることによ
り行うことができる。また複数の細径管の連結をほど
き、各細径管をバラバラにした状態で所定温度・所定湿
度下に静置することによつても行うことができる。細径
管の良好な保存安定性を確保するために、ブロツキング
溶液に糖類などを共存させておいてもよい。

（実施例）第１図に示したような細径管をポリプロピレン樹脂を
用いて成型した。細径管の先端細管部の内壁は560μ
ｍ、その部分の長さは8mmである。また細管部と第１の
拡径部の内容積の和は6.5μｌである。

上記細径管の100本を直列に連結し、その開口部末端
の細径管にピペツタを挿入した。一方50μg/mlの抗アル
フアフエトプロテイン抗体を含むリン酸緩衡溶液を調製
し、この溶液中に上記直列に連結された細径管の先端を
挿入し、700μｌの該溶液を吸引し、25℃で24時間静置
することにより、細管部２及び第１の拡径部ａの内壁に
抗アルフアフエトプロテイン抗体を吸着させた。次に該
抗体溶液をピペツタで排出し、リン酸緩衡溶液（pH7.
0）700μｌの吸引、排出を５回繰りかえすことにより、
細径管内を洗浄した。次いで１％の牛血清アルブミンを
含むリン酸緩衡溶液700μｌを吸引して25℃で３時間静
置することによりブロツキング処理を行つた。この溶液
を排出した後、ピペツタを取りはずし、乾燥した窒素ガ
スを直列に連結された細径管内にゆるやかに流通させて
細径管を乾燥させた。

このようにして作成された100本の細径管を用いて、
以下のようにしてアルフアフエトプロテインのサンドイ
ツチアツセイを行い、100本の細径管の性能のバラつき
を測定した。すなわち50ng/mlのアルフアフエトプロテ
インと５μg/mlのウレアーゼ標識抗アルフアフエトプロ
テイン抗体および10％ヒト血清を含むリン酸緩衡溶液を
調製し、該溶液20μｌを上記各細径管中に吸引し、37℃
で10分間インキユベーシヨンした。その後細径管を、10
0mMの塩化アンモニウムと150mMの塩化ナトリウムを含む
水溶液で、５回の吸引・排出処理することにより洗浄し
た。

この処理の後、細径管の先端細管部内壁に残存するウ
レアーゼの活性を、第４図に示す装置を用いて測定し
た。基質溶液としては、100mMの尿素と100mMの塩化アン
モニウムおよび150mMの塩化ナトリウムを含む水溶液を
用いた。

ウレアーゼ活性の指標としては、pH感応電界効果トラ
ンジスタのソース電位の変化速度の最大値（ピークレー
ト）を用いた。

100本の細径管についてその値の最大・最小値、平均
値はそれぞれ1.83mV/sec、1.65mV/sec、1.74mV/secでそ
の中心変動値（CV値）はわずか1.88％であつた。

（発明の効果）以上に述べた本発明のレセプタが固定された細径管お
よびその製造方法は次のような優れた効果を有する。

（１）大量の均質な細径管を一度に製造することがで
きる。（２）使用する測定対象物質たるアナライトと特
異的に結合する第１のレセプタが極めて少量ですむ。通
常細径管の先端細管部２と第１の拡径部ａの容積すなわ
ち１つの細径管あたりの第１のレセプタの使用量は数μ
ｌであり、これは従来よく用いられているマイクロプレ
ートの１ウエルあたりの使用量（通常100μｌ前後）の
十分の１以下である。（３）第１のレセプタ（抗原や抗
体など）は高価であり、その使用量は細径管のコストを
決める重要な因子であるのが、本発明の細径管は第１の
レセプタの使用量が極めて少ないため安価である。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の第１のレセプタが固定され
た細径管の断面図であり、第３図は複数の細径管を直列
に連結した状態を示す断面図であり、第４図は本発明の
細径管を使用した微量アナライト物質の測定装置の模式
図であり、第５図は細径管をセル内に挿入した状態を示
す断面図である。１……細径管、２……細管部３……拡径部、４……ヘツド５……第１のレセプタ、６……ピペツタヘツドａ……第１の拡径部、ｂ……第２の拡径部ｃ……第３の拡径部

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】先端に設けられたpH電極挿入用の細管部か
ら後端に向つて拡径するピペツトチツプ形状の細径管の
少くとも細管部内壁に、測定対象物質たるアナライトと
特異的に結合する第１のレセプタが固定されてなること
を特徴とするレセプタが固定された細径管。
【請求項２】請求項１記載の複数の細径管を直列に連結
して、最後部の細径管の後端開口に吸引手段を接続する
とともに、該吸引手段によつて先端部の細径管の細管部
先端から測定対象物質たるアナライトと特異的に結合す
る第１のレセプタを溶解させた緩衡溶液を吸引すること
により、各細径管の少くとも細管部内壁に第１のレセプ
タを固定することを特徴とするレセプタの固定方法。