JP2591641B2 - 微量アナライト物質の測定方法及び測定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微量アナライト物質の測定方法及び測定装
置、特に免疫反応（抗原−抗体反応）を利用して生体試
料のような多成分系に微量含まれる特定の物質を定量的
に測定するために適した測定方法及び測定装置に関する
ものである。本発明は以下臨床検査における微量生体物
質の測定について説明するが、本発明の測定方法及び測
定装置は薬学、生物学、動物学、植物学、農学、化学、
検査等を取り扱う広い分野への適用が可能である。

（従来の技術） 生体の生理活性に関与する物質は概して微量であり、
しかも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少
なくない。したがつて、このような微量の生理活性物質
を定量的に測定することは医学、生化学等の生物関連分
野にとつては重要であり、そのための種々の方法が考案
され、実用化されている。そのうち酵素、放射性同位元
素、化学発光物質、蛍光物質などを標識として用いるア
ナライト−レセプタ方式の測定は従来より広く普及して
いる。アナライト−レセプタ方式の測定においてはまず
測定対象物質たるアナライトと特異的に結合し得る第１
のレセプタを固定化した固相を試料溶液と標識第２レセ
プタもしくは標識アナライト（以下これらの標識体をコ
ンジユゲートという）と同時、または逐次的に接触させ
てアナライト−レセプタ反応を行なわせた後、洗浄し、
しかる後に該固相上に残存している標識物質の量を測定
することによつて試料溶液中のアナライトの量を測定す
るのである。ここで標識としてはラジオアイソトープや
酵素等の増感作用の大きい物質が用いられる。またレセ
プタとしてはアナライトが抗原やハプテンのときはそれ
に対する特異抗体が、あるいはアナライトが抗体である
時はその抗体に対する抗原性物質が、アナライトがDNA
やRNAである時にはそれらに相補的なDNAやRNAが、アナ
ライトがリガンドである時にはそれに対するレセプタが
それぞれ用いられる。かかる測定方法の代表例として不
均一法EIA、いわゆるEnzyme Linked Immuno Sorbent As
say（ELISA）が知られている。

ELISAにおいては、試料溶液中の測定対象物質を捕捉
するために、測定対象アナライトと特異的に結合し得る
レセプタを試験管、マイクロプレート等に固定化した固
相が用いられ、増感用の標識として酵素が用いられる。
例えば測定対象アナライトが抗原の場合、サンドイツチ
法ELISAにおいては該抗原に結合し得る第２抗体（第２
レセプタ）に酵素を標識する。また競合法ELISAにおい
ては測定対象抗原と同一の抗原に酵素を標識する。一方
測定対象アナライトが抗体であり、これを抗原サンドイ
ツチ法で測定する場合には、レセプタとして抗原が用い
られ、さらに酵素標識した抗原が第２レセプタとして用
いられる。また競合法によつて抗体（アナライト）を測
定する場合には、レセプタとして抗原を用い、該抗原に
対して測定対象抗体と競合し得る抗体を選択しこれに酵
素が標識される。上記標識として用いられた酵素に対す
る基質溶液と、そしてさらに必要ならば発色試薬を固相
と接触させる。すると基質溶液の分解反応に伴う基質溶
液の光学的性質が変化するので、その変化を観察するの
である。

基質溶液の光学的性質の変化を観察するには、従来か
らいくつかの方法が用いられている。そのうち機器を用
いる方法としては、吸光光度計、蛍光光度計、化学発光
光度計などで基質溶液の光学的性質の変化を光学的に測
定するものがある（例えば、石川、河合、宮井、酵素免
疫測定法、医学書院（1982）参照）。

また、別の方法として基質溶液と対照基質溶液を対比
させ基質溶液の色の違いを肉眼で観察して微量アナライ
ト物質の存在を判定するものがある（例えば特開昭60−
128369号参照）。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら機器を用いたこれらの光学的測定系は通
常安定な光源，高感度の光度計，精密な光学系増幅回路
等を要するために、高価で、大がかりで複雑な装置にな
らざるを得なかつた。また測定するに当り、特殊な技術
を必要とするため取扱いのための専門の技術者を配置し
なければならなかつた。

一方肉眼で直接観察する方法は、定性的な測定方法で
あり、色の変化のバラツキや観察者の主観が入るので判
定に個人差が生じやすい。さらに、極く微量の物質の測
定の場合には色の変化が少なく判定が困難であつた。

したがって、本発明の目的は、このような従来の測定
方法のもつ欠点を改良し、観察者の主観による判定基準
の曖昧さを除去して、基質溶液の分解反応を客観的に、
しかも高い検出精度で測定する微量アナライト物質の測
定方法及び測定装置を提供することにある。

さらに、本発明の目的は光学的測定系に比べて格段に
簡単な測定系を有する微量アナライト物質の測定方法及
び測定装置を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、訓練されていない人であっ
ても使用できるか、または診断目的のために迅速に決定
が必要であるときに該分野、またはその他における医療
従事者が使用するのに適した簡便な微量アナライト物質
の測定装置を提供することにある。

本発明の他の目的は、中小規模の病院や検査センタ
ー、さらにはベツトサイドで使用できる小型で安価な微
量アナライト物質の測定装置を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の測定方法は、アナライト−レセプタ反応を終
えた円筒状の固相と基質溶液を接触させて、基質溶液の
分解反応に伴う基質溶液のpH変化を利用した微量アナラ
イト物質の測定方法であつて、上記円筒状の固相を、基
質溶液のpH変化を測定するpH電極のpH感応面と円筒状の
固相の内表面との間隙が1mm以下となるように対面配置
して、該間隙内における基質溶液のpH変化を測定するこ
とを特徴とする微量アナライト物質の測定方法である。

さらに本発明の測定装置はアナライト−レセプタ反応
を終えた円筒状の固相と基質溶液を接触させて、基質溶
液の分解反応に伴う基質溶液のpH変化を利用した微量ア
ナライト物質の測定装置において、基質溶液の入口と出
口を有するセルと、該セル内に収容されたpH電極と、該
セル内に基質溶液を供給するポンプ及び測定対象物質た
るアナライトと特異的に結合する第１のレセプタを内表
面に固定化した円筒状の固相に、試料溶液と標識第２レ
セプタ、または標識アナライトを接触反応させ、洗浄し
た円筒状の固相をセル内に収容する手段と、セル内に収
納された円筒状の固相の内表面とpH電極のpH感応面をそ
の間隙が1mm以下となるように対面配置する固相位置決
め手段よりなることを特徴とする微量アナライト物質の
測定装置である。

すなわち、本発明にかかる測定方法では第１図に原理
図で示すように、アナライト−レセプタ反応と洗浄を終
え内表面にコンジユゲートを含むアナライト−レセプタ
複合体５が吸着された円筒状の固相３をpH電極１のpH感
応面２との間隙ｄが1mm以下となるように対面配置さ
せ、上記狭い間隙に実質的に封入された基質溶液４の分
解反応に伴うpH変化を直接測定するのである。

従来、pH電極を検出手段として用いるアナライト−レ
セプタ方式の測定装置は、吸光光度計や蛍光光度計を検
出手段とするものに比べて検出限界が格段に劣るため実
用的でないと考えられていたが、本発明者らはpH電極の
pH感応面とアナライト−レセプタ反応を終えた円筒状の
固相の間隙を1mm以下に設定することにより、意外にも
従来の検出手段を用いたものと同等の高い検出精度が得
られることを見出したのである。

かかる測定方法の基本的な操作は、まず（１）レセプ
タが固定化された内表面を有する円筒状の固相３を準備
する。次に（２）該円筒状の固相をアナライト溶液およ
びコンジユゲート溶液と反応させ、円筒状の固相の内表
面にアナライト−レセプタ複合体（コンジユゲートを含
む）５を形成させる。その後（３）該円筒状の固相を洗
浄して遊離のアナライトや遊離のコンジユゲートを除去
する。次に（４）該円筒状の固相の内表面をpH電極１の
pH感応面２より1mm以下の距離に配置する。（５）この
前もしくは後に少くともこの間隙に基質溶液を導入し
て、（６）円筒状の固相の内表面に吸着したコンジユゲ
ート５によつて基質溶液を分解し、この時の基質溶液の
pH変化をpH電極で測定する。

このように円筒状の固相の内表面上に吸着したコンジ
ユゲート（従つてアナライト）の量に応じて基質溶液の
pH変化が生じ、該pH変化からアナライトの濃度を定量的
もしくは定性的に測定するので必然的に検出限界が高
く、しかも信頼正の高い測定結果が得られる。また検出
手段としてpH電極を使用しているため迅速に、しかも簡
便に微量アナライト物質が測定できる。

次に本発明の判定装置の一実施例を図面にて説明す
る。以下の説明では円筒状の固相として細径管を用いた
装置について説明する。

第２図は本発明の測定装置の概略断面図であり、かか
る装置は基質溶液の入口12と出口13を有するセル11と、
該セル11内に収容されたpH電極14及び比較電極15と、セ
ル内に基質溶液を供給するポンプ20と、内表面にレセプ
タを固定した細径管６をセル11内に収納する手段９と、
細径管の内表面とpH電極14のpH感応面16との間隙を1mm
以下に設定する位置決め手段（図示せず）から構成され
ている。21は基質溶液の液留めである。

セル11は上下部に円筒状の太径部、中間部に細径部を
有し、かつ太径部の両端部は開口している。そして下部
太径部には基質溶液の入口12が、上部太径部には基質溶
液の出口13がそれぞれ取り付けられている。セルの下端
開口は後述するpH電極14及び比較電極15をセル内に液密
に収容するための電気絶縁樹脂からなるキヤツプ体10で
閉塞されている。セルの材質としてはプラスチツク、無
機ガラス、金属などを用いることができる。19はpH電極
及び比較電極とpH電極作動・読み取り回路（図示せず）
とを結ぶコネクタである。

上記セル11内に収容されるpH電極14としては従来から
最も多用されているいわゆるガラス電極の他に、pH感応
性電界効果トランジスタ（以下pH−FETという）、酸化
パラジウム／パラジウムワイヤ等の表面酸化金属線タイ
プのpH電極、プロトン受容体を含有するポリ塩化ビニル
から成るpH感応性高分子膜を金属線や炭素線にコートし
た、コーテイドワイヤ型のpH電極等、各種の微小pH電極
を用いることができる。しかしながらガラス電極型のpH
電極は、細径化すると誘導ノイズが増大する傾向があ
る。表面酸化金属線型pH電極は細径化が容易であるが、
長期の水中寿命等に難点がある。コーテイドワイヤ型の
pH電極も細径化が容易であるが、pH変化に対する直線応
答域が狭い、水中寿命が短いなどの難点がある。そのた
めこれらのpH電極を使用する場合には上記問題点を予め
解消しておく必要がある。

それに対してpH−FETは（１）細径化が容易である。
（２）細径化した時の誘導ノイズが少ない、（３）IC技
術で製造するので、電極間の特性のバラつきが小さくで
き、かつpH感応面（ゲート部）を微小化することができ
る。（４）pH変化に対する応答が極めて速く、かつ応答
曲線にヒステリシスが残らない、（５）pH変化に対する
直線応答域が広い、（６）水中の保存寿命が半永久的
で、かつpH感度等の特性の経時変化が少ない、等の優れ
た特徴を有しているので本発明装置に用いるpH電極とし
ては最適である。pH−FETとしては（１）全周絶縁型
（特公昭57−43863号参照）、（２）接合分離型（実公
昭58−5245号参照）、（３）SOS型（特開昭59−48646号
参照）等いくつかのタイプが知られている。本発明にお
いてはこれらのいずれのタイプのものを用いてもかまわ
ないが、その構造は基本的に第３図に示したように
（１）その先端近傍にpH感応面（ゲート部）28を有し、
（２）該ゲート部を含む素子先端部29が、レセプタ固定
化細径管内に挿入可能な太さであり、（３）素子先端部
の長さは１〜10mm、好ましくは１〜3mmであり、（４）
素子先端部の上・下面、側面全ての面が外部溶液との間
で電気的に絶縁されていることが必要である。一方該pH
−FETの素子尾部31にはリード線のボンデイングパツド3
0が設けられているが、この素子尾部の形状については
特に制約はない。また素子尾部31の外部溶液に対する電
気的絶縁性についても特に制約はない。なぜなら、素子
尾部は通常絶縁樹脂の中に埋め込まれた形で使用される
からである。

素子先端部の太さとしては、内径2.0mm以下、通常内
径0.8mm以下のレセプタ固相用の細径管内に入るもので
あることが望ましい。例えば細径管の内径が0.53mmであ
れば、素子先端部の幅としては0.45mm以下、厚みとして
は0.20mm以下であれば十分である。素子先端部の長さが
10mm以上になると折れやすくなり、細径管のレセプタ固
定化部分の必要長が大きくなる、等の点で問題が生じて
くる。また長さが1mm以下になると素子先端部の細径管
内への挿入長が短かくなりすぎ、そのために細径官内の
酵素反応が細径官外の溶液の影響を受けやすくなるので
好ましくない。素子先端部はそれ自身で外部溶液との間
で電気的に絶縁されていなければならない。上に記した
全周絶縁型pH−FETでは素子先端部の全周が酸化ケイ素
や窒化ケイ素等の層によつて絶縁されている。また接合
分離型ではpn接合によつて電気的絶縁が達成されている
（提、センサ技術、1986年５月臨時増刊号）。またSOS
型pH−FETでは、素子の下面はサフアイヤ基板によつ
て、また上面や側面は酸化ケイ素や窒化ケイ素等の層に
よつて電気的に絶縁されている。

本発明に用いられるpH−FETは、25℃において40ない
し60mV/pH、さらには50ないし60mV/pHのpH感度を有する
ことが望ましい。またpH感応膜としては窒化ケイ素、酸
化アルミニウム、酸化タンタル等の水中安定性のすぐれ
たものを採用することが望ましい。特に酸化タンタルや
酸化アルミニウムは水中での安定性、pH応答特性等の点
で優れている。酸化タンタルをpH感応膜とするpH−FET
は本発明に用いるpH電極として適している。

本発明の装置を用いて微量物質の測定を行なうために
は、pH−FETはノイズレベルの極めて低い（定pHで通常
0.05mV以下）ものを用いることが好ましい。そのために
は、相互コンダクタンスが50μ、好ましくは100μ
、より好ましくは200μ以上のものを用いることが
望ましい。またpH−FETの素子先端部と外部電極とを室
温の生理食塩水中につけて、pH−FETのソース電極と外
部電極との間に3Vの電圧をかけた時のもれ電流が30nA以
下、好ましくは10nA以下であることが望ましい。相互コ
ンダクタンスが50μ以下であつたり、上記もれ電流が
30nA以上であつたりすると、測定時のノイズが大きくな
る。

比較電極15としては、飽和カンコウ電極や銀−塩化銀
電極等の液絡式比較電極、イオン不感応性膜をゲート膜
とする電界効果トランジスタ（特公昭58−25221号参
照）、あるいはイオン不感応性膜を金属線や炭素線にコ
ートしたコーテイドワイヤ型の比較電極等を用いること
ができる。本発明の装置にはいずれの方式の比較電極を
用いてもかまわないが、現時点では液絡式比較電極が最
も信頼性が高く好ましく用いられる。比較電極のセル内
への設置場所としては通常第２図に示したように、セル
の下部太径部で、かつpH電極のpH感応面16と液絡してい
る場所に取り付けることが好ましい。また比較電極をセ
ルと液絡しているセル外の任意の場所に設置することも
可能である。

細径管６をセル内に収容する手段９としては、手で把
持してセル内に挿入してもよいが、例えば細径管６を先
端に把持した把持部材30の他端部に螺子棒31を挿通し、
この螺子棒31をステツピングモータ（図示せず）の回転
力により回転させて自動的に上昇、下降させるようにし
てもよい。32は螺子棒31と離間して平行に装備されたガ
イド部材である。把持部材30を昇降させる機構は上記機
構の他の公知の種々の機構のものを採用することができ
る。

細径管６の位置決め手段としては細径管の内表面のpH
電極14のpH感応面16との間隙を調整する公知の機構を採
用できる。例えば細径管６を直径方向に移動可能として
もよいし、あるいは、セル11の細径部の内径を細径管の
外径よりわずかに太くすることによつて、セルの細径部
の細径管に対するガイドとすることもできる。上記細径
管の位置決め手段によつて、細径管６の内表面とpH電極
のpH感応面の距離を1.0mm以下、好ましくは0.5mm以下に
設定する。上記の細径管の内表面とpH感応面との距離が
1.0mm以上になると細径管の内表面とpH感応面の間隙に
封入された基質溶液のpH変化速度が急激に遅くなるため
に、高い検出感度を達成することが事実上不可能とな
る。

細径管６は、少くともpH電極のpH感応面が十分にその
中に入り得る長さであることが必要である。例えばpH電
極のpH感応面の長さが1.5mmであれば、細径管のレセプ
タ固定化部の長さは通常3mm以下である。細径管のレセ
プタ固定化部が上記の条件を満たすものであれば、細径
管全体の形としては任意の形を採用することができる。
その一例を第４図に示す。第４図に示した細径管22はピ
ペツトチツプの形状としたもので、細径管部23と太径管
部24とから成る。太径管部はピペツタの受口用のテーパ
となる。この細径管部23の先端部分内表面23−１にレセ
プタが固定化されている。第５図は細径管の他の例を示
す。この細径管22はやはりピペツトチツプ型であるが、
細径管部の内表面25に凹凸を設けて、表面積を大きく
し、その先端部25−１にレセプタが固定化されている。
太径部26はやはりピペツタ受口用のテーパとなつてい
る。このように細径管内表面の表面積を大きくすること
によつて、検出感度を向上させたり、インキユベーシヨ
ン時間を短縮することが可能となる。これら細径管の材
質としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビ
ニル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコー
ル、エチレン−ビニルアルコール共重合体等のポリオレ
フイン系ポリマー、ポリエチレンテレフタレートやポリ
ブチレンテレフタレート等のポリエステル系ポリマー、
ポリジメチルシロキサン等のポリシロキサン系ポリマ
ー、６ナイロン、6,6−ナイロン等のポリアミド系ポリ
マー、ポリカーボネート、酢酸セルロースやニトロセル
ロースのようなセルロース系ポリマー、さらには各種無
機ガラスを用いることができる。

なお、このような細径管にレセプタを固定化し、微量
物質の検出に利用することができると思われる物質と、
それらにより測定できると考えられる項目の一例を表−
１に示す。

本発明におけるコンジユゲート用標識酵素と基質溶液
の組み合わせとしては、酵素反応によつて基質溶液のpH
が大きく変化する標識酵素／基質溶液の組み合わせを用
いることが必要である。そのような組み合わせとしては
例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ／トリアシル
グリセロール、アセチルエステラーゼ／酢酸エステル、
アセチルコリンエステラーゼ／アセチルコリン、グルコ
ノラクトナーゼ／グルコノラクトン、アルカリホスフア
ターゼ/p−ニトロフエノールリン酸、アリルサルフアタ
ーゼ／アリルサルフエート、ウレアーゼ／尿素、バルビ
ツラーゼ／バルビツレート等の加水分解酵素／その基質
の組み合わせ、グルコースオキシダーゼ／グルコース、
コリンオキシダーゼ／コリン、カテコール1,2−ジオキ
シゲナーゼ／カテコール等の酸化還元酵素／その基質溶
液の組み合わせ等があげられる。中でもウレアーゼ／尿
素、トリアシルグリセロールリパーゼ／トリアシルグリ
セロール、グルコースオキシダーゼ／グルコース等の組
み合わせは、安定で活性の高い酵素が入手しやすいこ
と、安価で純度の高い基質溶液が入手しやすいこと等の
理由により、実用に適している。中でも特にウレアーゼ
／尿素の組合せは、酵素反応に伴うpH変化が大きいので
適している。

次に本発明装置を用いた測定方法を１ステツプサンド
イツチ法による抗原の測定の場合について説明する。競
合法や２ステツプサンドイツチ法では操作が若干異なる
が装置の構成は変らないので説明を省略する。まず細径
管６の内表面にレセプタを固定する。かかるレセプタを
固定化する方法としては、従来のELISAに用いられた方
法をそのまゝ採用することができる。例えば物理吸着に
よつてレセプタを固定化する時には、まず細径管を十分
に洗浄した後、レセプタである第１抗体を溶解した緩衝
溶液を細径管の内部に導入し、０℃〜40℃の温度で一定
時間静置する。この時レセプタ溶液の中に細径管の先端
部のみを浸漬してもかまわない。後者の方法では、レセ
プタ溶液の中に浸漬された細径管の先端部の外壁と内壁
の両方にレセプタが吸着するが、その事が測定に悪影響
を及ぼすことはない。その後細径管を洗浄用緩衝液で洗
浄した後、ブロツキング処理を行なう。ブロツキング処
理は、該洗浄後の細径管を例えばウシ血清アルブミン、
ウシ胎児血清アルブミン、各種動物の血清、各種イムノ
グロブリン、あるいは界面活性剤等で処理することによ
つて行なわれる。ブロツキング処理はレセプタ固定化部
は勿論のことそれ以外の試料溶液やコンジュゲート溶液
との接触が予想される部分全体に行なうことが必要であ
る。

次にブロツキング処理後の細径管の先端部を、所定量
の標識第２抗体を含有する試料溶液に含浸し、所定時間
インキユベーシヨンする。それにより細径管内壁上に第
１抗体−抗原−標識第２抗体のサンドイツチ型抗原−抗
体複合体が形成される。

強いで洗浄操作によつて、サンドイツチを形成してい
ない遊離の測定対象抗原、遊離の標識第２抗体、あるい
は遊離の抗原−標識第２抗体複合体を細径管内表面より
除去する。これらインキユベーシヨン及び洗浄操作によ
つて、細径管の内表面には試料溶液中の測定対象抗原の
濃度と相関を持つた量のサンドイツチ型抗原−抗体複合
体、したがつて標識酵素が結合した状態となる。

一方酵素反応をpH電極で追跡するためのセルでは第６
図に示すように、基質溶液17をポンプ20によつて液留め
21よりセル内に供給し、出口13よりオーバーフローさせ
てpH電極14のpH感応面16及び比較電極15を洗浄する。セ
ル内の液面はpH電極のpH感応面の先端部より上にある。
33は排液容器である。

酵素反応を開始させるためには第７図のように、イン
キユベーシヨン、洗浄後の細径管６を細径管収納手段
（図示せず）によりセルの上端開口よりセル内に挿入し
て、pH電極のpH感応面を該細径管で完全に取りかこむよ
うにする。その時送液ポンプ20は停止させておくことが
望ましい。第８図に細径管６をセル11内に収納したとき
のセルの細径部周辺の詳細を示す。その後、該細径管内
で基質の分解反応が進行するので、それに伴うpH変化を
測定する。この時のpHの変化速度から標識第２抗体の酵
素活性、すなわち試料溶液中の測定対象抗原の濃度を求
める。

上記細径管６をセル内に挿入したときの重要な点は、
第８図に示しているように細径管６の下端とpH電極の樹
脂部35の先端の間隙を可能な限りせまくすることであ
る。酵素活性を測定する時には、細径管の内外の基質溶
液が互いに混り合わないことが望ましい。そのためpH電
極の樹脂部35の外径を細径管６の外径とほゞ同程度にし
て、セルの細径部18の中に下方より挿入・固定してお
き、酵素活性測定時には細径管６を、樹脂部35にその先
端部が接触するまで上方より挿入する。こうすることに
よつて細径管６の下端開口部がpH電極14の樹脂部35によ
つて適度に閉塞され、塞径管内の基質溶液を隔離するこ
とができる。なおこの場合pH電極のpH感応面16と比較電
極15との間はある程度液絡していることが必要である。
この液絡は電気的な液絡であるから、通常樹脂部35の上
面や細径管６の先端部の凹凸にもとずく微小な間隙によ
つて十分確保される。

（実施例） 以下本発明の測定方法の一例を実施例にて説明する。

［実施例１］ 細径管を固相、pH−FETを検出手段とするELISA測定装
置を組み立て、この装置を用いて、まずヒト−IgGの定
量を試みた。

ELISA測定装置の組み立て まずセルとしては第２図で示されたものを用いた。pH
電極14としては、特公昭57−43863に記載の方法で製造
された全周絶縁型のpH−FETのゲート部に、タンタル酸
化物をpH感応膜として蒸着したものを用いた。このpH−
FETの全体の寸法は長さ5.5mm、幅0.45mm、厚み0.15mm
で、その先端0.8mmの部分にゲート部（pH感応面）が設
けられている。第８図に示すようにこのpH−FETをゲー
ト部を含む先端1.5mm程度を突出させて樹脂35で固定し
た。この樹脂部の外径は0.60mmである。この場合pH−FE
TのpH感応面と細径管の内表面との間隙の最大値ｄは
（0.53−0.15）/2＝0.19mmであつた。それに対して、反
応セルの細径部の内径を0.65mm、長さを15mmとした。比
較電極15としては銀／塩化銀型の液絡式比較電極を用い
た。ポンプ20としてはペリスタポンプを用い、流速を1m
l/分に設定した。

使用したpH−FETのpH感度は37℃で57.3mV/pH、相互コ
ンダクタンスは380μであつた。pH−FETの作動は、ド
レイン電圧４ボルト、ドレイン電流100μＡで定電流回
路に接続して行なつた。またpH−FETの出力信号として
は液絡式比較電極を基準とするソースの電位（以下これ
をソース電位と略称する）を測定、記録した。

細径管へのレセプタ（キャプチャ抗体）の固定化 レセプタとして抗ヒト−IgG（Sheep）を選び、細径管
に次のようにして固定した。細径管としては、第４図に
示す細径部の内径が0.53mmのメデイキツト株式会社製の
ポリテトラフルオロエチレン製カニユーラ（商品名ハツ
ピーキヤスＺ）を用いた。このカニユーラの細径部の長
さは25mm、太径部の内径、外径、長さは各々4mm、6mm、
および20mmであつた。50μg/mlの抗ヒト−IgGのPBS溶液
（pH7.0）を調製し、該溶液の中に上記カニユーラの先
端10mmの部分を４℃下24時間浸漬して、この部分の内外
壁に抗ヒトIgGを物理吸着させた。次いで0.05％の界面
活性剤（商品名Tween−20）を含むPBS溶液（pH7.0）で
該吸着後カニユーラの内外壁をよく洗浄した。この後該
カニユーラの細径部全体の内外壁を１％牛血清アルブミ
ン（BSA）と0.05％のTween−20を含むPBS溶液中に室温
下１時間浸漬し、いわゆるブロツキング処理を行なつ
た。

酵素標識抗体の作成 標識酵素としてナタ豆から分離、精製したウレアーゼ
（シグマ社、タイプＣ−３）を用い、アビジン−ビオチ
ン法によつて抗ヒト−IgG（Goat）と以下のようにして
結合させた。まず1mg/mlのウレアーゼ、1mMのEDTAを含
む0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（pH8.3）を調製し
た。またＮ−ヒドロキシサクシミド化ビオチン（Pieroe
社）の1mg/mlのDMSO溶液を調製した。次にこのウレアー
ゼ溶液1mlとＮ−ヒドロキシサクシミド化ビオチン溶液
５μとを室温で４時間反応させて、ウレアーゼをビオ
チン化した。この反応後溶液をPD−10カラム（フアルマ
シア社）をカラムとするゲルクロマトグラフィーにか
け、ビオチン化ウレアーゼの分画を分取した。この分画
を、１％BSA、0.05％Tween−20、1mM EDTA、0.01％NaN₃
を含むPBS溶液（pH7.4;以下この溶液はよく使われるの
で“希釈バツフア”と略記する）で希釈して、25μg/ml
の濃度の溶液とした。

次にアビジン−Ｄ（ベクター社）を希釈バツフアで7.
6μg/mlの溶液とし、またビオチン化抗ヒト−1gG（TAGO
社）を同じ希釈バツフアで6.9μg/mlの溶液とした。こ
のようにして得られたビオチン化ウレアーゼ、アビジン
−Ｄ、ビオチン化抗ヒト−IgGの溶液を容積比1:1:1で混
合することによつて目的とするウレアーゼ標識化抗ヒト
−IgGの溶液を調製した。以下この溶液をコンジュゲー
ト溶液と略記する。

ヒト−IgGに対する検量線の作成 次に本発明のELISA測定装置の性能を試験するために
ヒト−IgGに対する検量線を作成した。まず所定量のヒ
ト−IgGを上述の希釈バツフアに溶かして所定濃度のヒ
ト−IgG溶液を調製した。次にこのヒト−IgG溶液と前述
のコンジユゲート溶液とを等容量ずつ混合した。一方抗
ヒト−IgGを固定化した細径管体をブロツキング溶液か
ら引き上げ、PBS−Tween20溶液で洗浄した。この細径管
内に上述のヒト−IgG−コンジユゲートの混合溶液を吸
引し、室温下で30分間インキユベーシヨンした後、PBS
−Tween20で洗浄を行なつた。

基質溶液として0.1Mの尿素、1mMの塩化アンモニウ
ム、0.15Mの塩化ナトリウムを含む溶液を調製し、これ
を第２図に示された液留め21に仕込み、ポンプ20を作動
させてセル11の中に基質溶液を送り込み、セル出口13よ
りオーバーフローさせた。この時点よりpH−FETのソー
ス電位及びその変化速度を記録した。その一例を第９図
に示した。第９図において、ΔＶは反応前の基質溶液に
対するソース電位を基準とした時に、反応によるソース
電位の変化分であり実線で示されている。ｄΔV/dtはそ
の時間微分であり、破線で示されている。第９図の時刻
Ａでポンプ20を停止させた。時刻Ｂで上記のインキユベ
ーシヨン−洗浄後細径管を第７図のようにセルの細径部
に挿入した。この時点を時刻ゼロとする。その直後より
細径管内では尿素の（アンモニア＋二酸化炭素への）分
解反応が進行し、それに伴つて基質溶液のpHがアルカリ
側（ソース電位が低下する方向）に変化する。この間Δ
Ｖの変化速度は時刻Ｍで最大となる。時刻Ｃで細径管体
をセルより引き抜くと同時に送液ポンプの運転を作動さ
せると、ソース電位およびその時間微分はすみやかに元
に戻る。

このようにして各種濃度のヒト−IgG溶液でインキユ
ベートした細径管に対するpH応答曲線を測定し、その結
果から第10図および第11図に示した２種類の検量線を作
成した。第10図は細径管挿入後５分後でのΔＶとヒト−
IgGの濃度との関係を示したもの、第11図はｄΔV/dtの
極大値（第９図ＭにおけるｄΔV/dt、いわゆるピークレ
ート）とヒト−IgGの濃度との関係を示したものであ
る。第10図、第11図のいずれの検量線でも検出下限濃度
は1ng/ml程度である。第10図と第11図を比べると、第10
図では100ng/ml程度でΔＶがやゝ飽和しかけているのに
対して、第11図ではまだそのような傾向が見られない。
このことは細径管挿入後５分後のΔＶを用いるよりは、
いわゆるピークレートを用いた方が１本の検量線での測
定可能範囲が広くなることを示唆している。

［実施例２〜8,比較例１〜３］ 次にレセプタ固定化細径管の内径を0.53〜3.0mmの範
囲で変えて実施例１同様の測定を行なつた時のpH応答曲
線の変化について検討した。この目的のために、セルの
細径部の内径（これをＬとする）および樹脂部35の直線
ａの異なるものを製作し、これに外径l₁、内径l₂のレセ
プタ固定化細径管を用いてELISAの測定を行なつた。こ
の時Ｌ−ａ＝0.05mm、ａ＝l₁、l₁−l₂≒0.16mmの関係が
保持されるようにした。この場合pH−FETのpH感応面と
細径管内表面との間隙の最大値ｄはｄ＝（l₁−0.15）/2
で表わされる。

このような反応セルおよび細径管を用い、実施例１と
同様にして、10ng/mlのヒト−IgG溶液を測定対象溶液と
してpH応答曲線を測定した。その結果から、レセプタ固
定化細径管の内径と、酵素反応開始５分後におけるpH−
FETの出力の関係を求め、表−２及び第12図に示した。
表−２には上記のpH−FET感応面と細径管内表面との間
隙ｄの値も示した。第12図から明らかなように、細径管
の内径が小さいほど同一のヒト−IgG濃度に対するpH−F
ETの出力は大きくなる。細径管の内径が2.20mm以上、す
なわち間隙ｄが1.0mm以上では５分程度の反応時間ではp
H変化はほとんど認められない。細径管の内径が2.2mm以
下では10ng/mlといった微量のヒトIgGに対して数mVから
数十mVといつた十分検出可能な出力が得られる。さらに
細径管の内径が0.8mm以下、すなわち間隙ｄが0.20mm以
下では45mV以上という大きな出力が得られる。

（発明の効果） 本発明によれば、従来の光学的検出手段にくらべて格
段に簡単なpH電極を用いたアナライト−レセプタ方式の
測定装置を提供することができる。また、pH電極を用い
るため小型、安価で、しかも使い易く中小規模の病院や
検査センター、さらにはベツドサイドで使用可能な微量
アナライト物質測定装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による測定原理を示す断面図であり、第
２図は本発明の測定装置の模式図であり、第３図はpH−
FETの斜視図であり、第４図及び第５図は細径管の一例
を示す断面図であり、第６図及び第７図は本発明装置の
測定方法を示す模式図であり、第８図はセルの細径管部
拡大断面図であり、第９図はpH−FETのソース電位及び
その変化速度の時間的変化を示すグラフであり、第10図
及び第11図は濃度とpH応答曲線の関係を示すグラフであ
り、第12図はpH感応面と細径管内表面との距離とソース
電位の関係を示すグラフである。 １……pH電極、２……pH感応面 ３……円筒状の固相、４……基質溶液 ５……コンジユゲートを含むアナライト−レセプタ複合
体 ６……細径管 ９……細径管をセル内に収納する手段 11……セル、14……pH電極 15……比較電極

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アナライト−レセプタ反応を終えた円筒状
   の固相と基質溶液を接触させて、基質溶液の分解反応に
   伴う基質溶液のpH変化を利用した微量アナライト物質の
   測定方法であって、上記円筒状の固相を、基質溶液のpH
   変化を測定するpH電極のpH感応面と円筒状の固相の内表
   面との間隙が1mm以下となるように対面配置して、該間
   隙内における基質溶液のpH変化を測定することを特徴と
   する微量アナライト物質の測定方法。
2. 【請求項２】アナライト−レセプタ反応を終えた円筒状
   の固相と基質溶液を接触させて、基質溶液の分解反応に
   伴う基質溶液のpH変化を利用した微量アナライト物質の
   測定装置であって、該測定装置は基質溶液の入口と出口
   を有するセルと、該セル内に収容されたpH電極と、該セ
   ル内に基質溶液を供給するポンプと、測定対象物質たる
   アナライトと特異的に結合する第１のレセプタを内表面
   に固定化した円筒状の固相に、試料溶液と標識第２レセ
   プタ、または標識アナライトを接触反応させ、しかる後
   洗浄した円筒状の固相をセル内に収納する手段と、セル
   内に収納された円筒状の固相の内表面とpH電極のpH感応
   面をその間隙が1mm以下となるように対面配置する固相
   位置決め手段よりなることを特徴とする微量アナライト
   物質の測定装置。