CN102818887B - 免疫学测定方法和芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种免疫学测定方法和芯片，该免疫学测定方法适于在芯片上实施。免疫学测定方法为以下方法，在反应腔室（7）中得到测定对象抗原（2）与抗体（3）已结合的状态下的抗原抗体复合物后，通过使用样品溶液（8）洗涤反应腔室（7），将抗原抗体复合物和未与测定对象抗原结合的抗体分离。根据本发明，不使用处于不含有蛋白质等测定对象抗原的状态下的以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，就能够洗涤反应腔室，并能够以与使用洗涤液的情况相当的精度检测出反应测定对象抗原的量的信号。由此，不需要将洗涤液从芯片的外部供给或将洗涤液预先保持在芯片上，就能够容易地在芯片上实施免疫学测定方法。
Description
本申请是2007年3月20日提出的申请号为200780014700.4的同名申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及利用抗原抗体反应测定样品溶液中的特定成分的量的免疫学测定方法，特别涉及适于在芯片上实施的免疫学测定方法。而且，本发明涉及适于实施该免疫学测定方法的芯片。
背景技术
作为高精度地对活体样品（例如血液）中含有的过敏反应的起因物质、病毒和细菌等蛋白质进行识别和定量分析的方法，免疫学测定方法正受到注目。
免疫学测定方法大致分为免疫比浊法和免疫标记法。免疫比浊法，是对抗原抗体反应产生的抗原抗体复合物引起的样品溶液的浊度变化进行测定的方法。免疫标记法，是使用被标记物质标记的抗体，对抗原抗体反应后的标记物质量的变化进行测定的方法。
免疫标记法按照标记物质的种类被细分。例如能够列举：使用放射性同位素作为标记物质的放射免疫测定法，使用酶的酶免疫测定法（EIA：enzyme immunoassay），使用荧光体的荧光免疫测定法等。EIA与其他免疫标记法相比，标记物质的安全性较高，能够简便的操作，测定精度也高，因此被广泛使用。
作为代表性的EIA，例如是酶联免疫吸附测量法（Enzyme-linkedImmunosorbent Assay：ELISA）。参照图1说明ELISA的一个例子。
（工序1-A：固相抗原的形成）
将含有捕获抗原的溶液导入反应腔室7内，其中，该捕获抗原具有与测定对象抗原的抗原表位（epitope）相同的抗原表位，并且在规定温度下保持规定时间，使该捕获抗原吸附于反应腔室7的表面。之后，以不参与之后的抗原抗体反应和酶反应的蛋白质覆盖（屏蔽）吸附的捕获抗原。由此，在反应腔室7的内部形成固相抗原6。固相抗原6固定在反应腔室7的表面，不会被后述的洗涤从反应腔室7除去。
（工序1-B：测定对象抗原与抗体、以及固相抗原与抗体的结合反应）
在样品溶液9中添加与测定对象抗原2特异性结合的抗体3。抗体3处于被标记物质（例如酶）4标记的状态。之后，将含有该抗体3的样品溶液9导入反应腔室7。由此，在反应腔室7中，固相抗原6与抗体3之间、以及测定对象抗原2与抗体3之间进行抗原抗体反应。
（工序1-C：未反应的抗体和抗原抗体复合物的除去）
使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液10，对反应腔室7的内部进行洗涤。由此，从反应腔室7中除去抗原抗体复合物和未与固相抗体6结合的抗体3，其中，该抗原抗体复合物是抗体3与测定对象抗原2结合而形成的，固相抗原6和抗体3的结合物残留于反应腔室7内。
接着，对反应腔室7内残留的、固相抗原6和抗体3的结合物所具有的标记物质4的量进行测定。该测定例如以下述方式进行。首先，调制含有与标记物质4反应的测定用试剂（例如酶的基质）的溶液。接着，通过将该溶液导入反应腔室7，在反应腔室7内得到含有固相抗原6与抗体3的结合物和测定用试剂的测定溶液。在测定溶液中，使测定用试剂和标记物质4进行反应后，对反映反应生成物的量的信号进行检测。
样品溶液9中的测定对象抗原2的量，根据该测定的结果、固相抗原6的量、和在工序1-B中导入反应腔室7内的样品溶液9的量而被算出。
从使用微量的样品溶液，在短时间内测定样品溶液中的测定对象物质的量的观点出发，芯片型的生物传感器受到注目。例如，日本特开平2-062952号公报中公开了一种芯片型的生物传感器，该生物传感器设置有：绝缘性基板，配置在基板上的电极系统，配置在电极系统上的酶反应层，以及以露出电极系统和酶反应层的方式配置在基板上的具有切口部的绝缘层。酶反应层含有由氧化还原酶和电子介质（electron mediator）等代表的、用于诱导酶循环反应的测定用试剂。作为氧化还原酶，使用以测定对象物质为基质的酶。例如，在测定葡萄糖量的情况下使用葡萄糖氧化酶，此外，例如，在测定胆固醇量的情况下，使用胆固醇氧化酶。该生物传感器，通过在切口部滴下样品溶液，使测定用试剂溶解在样品溶液中，通过电子介质进行测定对象物质和酶的反应（酶循环反应）。样品溶液中的测定对象物质的量根据氧化电流值被计算出，该氧化电流值是通过使经酶反应而还原的电子介质电化学氧化而得到的。
在图1所示的现有的免疫学测定方法中，如上所述，使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液进行工序1-C。因此，为了在芯片上实施该免疫学测定方法，需要从芯片的外部供给洗涤液，或者将洗涤液预先保持在芯片上。但是，在从外部供给洗涤液的情况下，为了该供给而多余地花费劳力和时间。在将洗涤液保持在芯片上的情况下，优选以密封状态并且在洗涤时能够容易地导入芯片的状态将该液体保持在芯片上。但是，在芯片上形成这样的保持状态并不容易。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于在芯片上实施的免疫学测定方法，该免疫学测定方法不需要将以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液从芯片的外部进行供给并预先保持在芯片上。而且，本发明的目的是提供一种适于实施该免疫学测定方法的芯片。此外，本发明的目的是提供一种使用该芯片的测定方法。
在现有的免疫学测定方法中，对于反应腔室的洗涤，认为使用不含有蛋白质等测定对象物质的以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液很重要。但是，本发明者意外地发现了以下情况：取代以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，使用含有蛋白质等测定对象物质的活体试剂来洗涤反应腔室，由此，也能够以与使用洗涤液的情况相当的优良的精度检测出反应测定对象物质的量的信号。
本发明提供一种方法，其为使用芯片测量样品溶液中含有的测定对象抗原的量的方法，上述芯片具有反应腔室、洗涤液保持腔室、废液腔室、和注入上述样品溶液的注入孔，上述注入孔和上述反应腔室之间通过第一流路连接，上述注入孔和上述洗涤液保持腔室之间通过第二流路连接，上述洗涤液保持腔室和上述反应腔室之间通过第三流路连接，上述反应腔室和上述废液腔室之间通过第四流路连接，上述方法包括：从上述注入孔注入上述样品溶液，将上述样品溶液通过上述第一流路分配给上述反应腔室，并通过上述第二流路分配给上述洗涤液保持腔室的工序；在上述反应腔室内，使上述样品溶液中含有的测定对象抗原、与抗体结合，得到抗原抗体复合物的工序，其中，该抗体为与上述测定对象抗原特异性结合的抗体；通过上述第三流路向上述反应腔室注入保持在上述洗涤液保持腔室中的上述样品溶液，并对具有上述抗原抗体复合物的上述反应腔室进行洗涤，由此，将从i)上述抗原抗体复合物、和ii)未与上述测定对象抗原结合的上述抗体中选择的一方残留在上述反应腔室内，并将另一方移动至上述废液腔室，将上述抗原抗体复合物和未与上述测定对象抗原结合的上述抗体分离的工序；对上述抗原抗体复合物或未与上述测定对象抗原结合的上述抗体的量进行测定的工序；和根据测量的上述抗原抗体复合物或未与上述测定对象抗原结合的上述抗体的量，计算出上述样品溶液中含有的上述测定对象抗原的量的工序。
本发明从另一方面提供一种方法，其为测量样品溶液中含有的测定对象抗原的量的方法，该方法包括：在反应腔室内，使上述测定对象抗原与抗体结合，得到抗原抗体复合物的结合工序，其中，该抗体为与上述测定对象抗原特异性结合的抗体；通过利用上述样品溶液对上述反应腔室进行洗涤，将上述抗原抗体复合物和未与上述测定对象抗原结合的上述抗体分离的洗涤分离工序；对上述抗原抗体复合物或未与上述测定对象抗原结合的上述抗体的量进行测定的测定工序；和根据测得的上述抗原抗体复合物或未与上述测定对象抗原结合的上述抗体的量，计算出上述样品溶液中含有的上述测定对象抗原的量的工序。
本发明从又一方面提供一种芯片，其为用于测定样品溶液中含有的测定对象抗原的量的芯片，该芯片具有反应腔室、洗涤液保持腔室、废液腔室、和注入上述样品溶液的注入孔，上述注入孔和上述反应腔室之间通过第一流路连接，上述注入孔和上述洗涤液保持腔室之间通过第二流路连接，上述洗涤液保持腔室和上述反应腔室之间通过第三流路连接，上述反应腔室和上述废液腔室之间通过第四流路连接，从上述注入孔注入的上述样品溶液，通过上述第一流路流向上述反应腔室、并通过上述第二流路流向上述洗涤液保持腔室，在上述反应腔室内，使上述测定对象抗原与抗体结合，得到抗原抗体复合物，其中，该抗体为与上述测定对象抗原特异性结合的抗体，通过上述第三流路向上述反应腔室注入保持在上述洗涤液保持腔室中的上述样品溶液，并对具有上述抗原抗体复合物的上述反应腔室进行洗涤，由此，将从i)上述抗原抗体复合物、和ii)未与上述测定对象抗原结合的上述抗体中选择的一方残留在上述反应腔室内，并将另一方移动至上述废液腔室，将上述抗原抗体复合物和未与上述测定对象抗原结合的上述抗体分离。
根据本发明，在实施免疫学测定方法时，不使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，能够通过洗涤反应腔室，检测出反映测定对象物质的量的信号。
附图说明
图1是用于对现有的免疫学测定方法的一例进行说明的工序图。
图2是用于对本发明的免疫学测定方法的一例进行说明的工序图。
图3是用于对使用非标记的一次抗体和被标记的二次抗体，实施本发明的免疫学测定方法的情况的一例进行说明的图。
图4是用于对本发明的芯片的一例进行说明的图。
图5是用于对通过夹心法（sandwich method）实施抗体和测定对象抗原的抗原抗体反应的情况的一例进行说明的工序图。
图6是表示吸光度的测定结果的图表。
具体实施方式
使用图2的工序图对本发明的免疫学测定方法的一例进行说明。
（工序2-A：固相抗原的形成）
将具有与样品溶液中含有的特定的蛋白质（测定对象抗原2）的抗原表位相同的抗原表位的捕获抗原，以规定量固定于反应腔室7的表面，由此形成固相抗原6。捕获抗原的固定，例如与现有型的ELISA中的工程1-A同样地进行即可。
反应腔室7的材料，例如为聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯（PET）、聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷等树脂、玻璃、磁性体等。反应腔室7优选为管型、以微板为代表的井（well）型等具有能够保持液体的形状。
（工序2-B：结合工序）
注入规定量的样品溶液的一部分1。样品溶液例如为血液、尿、唾液、汗、泪等液态活体样品。向样品溶液的一部分1中添加由标记物质4标记的抗体3。抗体3是与测定对象抗原2特异性结合的一次抗体。样品溶液的另一部分8以不添加抗体3的状态保存。抗体3可以是市售的抗体，也可以是利用实验动物独自制作的抗体。抗体3虽然也可以是多克隆（polyclonal）抗体，但从提高抗原抗体反应的特异性和灵敏度等观点出发，优选单克隆抗体。测定对象抗原2例如为C反应性蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A、肌钙蛋白T、肌酸激酶MB、视黄醇结合蛋白等临床注目度高的蛋白质。标记物质4优选酶，也可以是荧光色素和放射性同位素。
将添加被标记的抗体3后的状态下的样品溶液的一部分1导入固定有固相抗原6的反应腔室7。通过该操作，样品溶液的一部分1被导入反应腔室7。将导入后的样品溶液的一部分1以规定温度和规定时间保持在反应腔室7内。由此，在固相抗原6与抗体3之间、以及测定对象抗原2与抗体3之间竞争地进行抗原抗体反应，在反应腔室7中，形成作为测定对象抗原2和抗体3的结合物的抗原抗体复合物，以及固相抗原6和抗体3的结合物。固相抗原6和抗体3的结合物，因为未与测定对象抗原2结合，所以在本说明书中，与抗体3同样用作“未与测定对象抗原结合的抗体”。这样，关于本发明的免疫学测定方法，在反应腔室中固定有固相抗原，在结合工序中，可以得到抗原抗体复合物、和抗体与固相抗原结合的状态下的未与测定对象抗原结合的抗体。
反应腔室7中的抗原抗体反应也可以是非竞争反应。关于非竞争反应，将添加有被标记的抗体3的样品溶液的一部分1导入反应腔室7之前，在规定温度下保持规定时间，在测定对象抗原2和被标记的抗体3的反应达到稳定状态后，将该样品溶液的一部分1导入反应腔室7，使未与测定对象抗原2结合的抗体3、和固相抗原6反应，由此进行该非竞争反应即可。用于进行抗原抗体反应的温度和时间，按照抗原和抗体的种类适当设定即可。在以下的抗原抗体反应中也相同。
（工序2-C：洗涤分离工序）
使用在结合工序（工序2-B）中保存的样品溶液的另一部分8洗涤反应腔室7。该洗涤例如以下述方式进行即可。首先，使用移液管，除去反应腔室7的内部的样品溶液的一部分1。接着，使用移液管将样品溶液的另一部分8滴下至反应腔室7的内部，进行多次移液。之后，将样品溶液的另一部分8从反应腔室7除去。由此，抗原抗体复合物从反应腔室7被除去，而未与测定对象抗原结合的抗体残留在反应腔室7内，于是，在结合工序（工序2-B）中得到的抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体被分离。这样，不使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，而使用样品溶液洗涤反应腔室。如上所述，历来，认为在反应腔室的洗涤中使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液很重要。这是为了将抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体不带夹杂物地分离。可是，即使这样使用样品溶液洗涤反应腔室，也能够高精度的分离抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体。如后述的实施例所示，能够以与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液洗涤反应腔室的情况相当的精度，检测出反映测定对象物质的量的信号。
（测定工序）
对反应腔室7中残留的未与测定对象抗原结合的抗体中的标记物质4的量进行测定。该测定例如也可以下述方式实施。首先，调制含有测定用试剂的溶液。测定用试剂按照标记物质4的种类选择即可。例如，如果标记物质4是酶，则使用该酶的基质即可。接着，将该溶液导入反应腔室7，在反应腔室7中得到含有未与测定对象抗原结合的抗体和测定用试剂的测定溶液。在测定溶液中，使未与测定对象抗原结合的抗体中的标记物质4和测定用试剂进行反应后，使用公知的光学测定方法和电化学测定方法等，检测出反映反应生成物的量的信号量。
（计算工序）
根据测定工序中得到的测定结果，算出测定对象抗原的量。更具体而言，根据该测定结果、固定在反应腔室7中的固相抗原6的量、和在结合工序（工序2-B）中导入反应腔室的样品溶液的一部分1的量，计算出测定对象抗原2的量。所谓测定对象抗原的量，是与该量相关的物理量，例如可以是浓度。这样，根据测定工序中测得的未与测定对象抗原结合的抗体的量，或者根据如后所述的抗原抗体复合物的量，计算出样品溶液中含有的测定对象抗原的量。
使用图5的工序图，对本发明的免疫学测定方法的另一例进行说明。该例中，通过夹心法进行抗体和测定对象抗原的抗原抗体反应。
（工序5-A：固相抗体的形成）
通过将样品溶液中含有的与测定对象抗原2结合的捕获抗体以规定量固定在反应腔室7的表面上，形成固相抗体19。捕获抗体的固定，例如与图2所示的免疫学测定方法中的工序2-A相同地进行即可。
（工序5-B～D：结合工序）
分别注入规定量的样品溶液。由此制备样品溶液的一部分1和样品溶液的另一部分8。
将样品溶液的一部分1导入固定有固相抗体19的反应腔室7（工序5-B）。通过该操作，样品溶液的一部分1被导入反应腔室7中。将导入的样品溶液的一部分1在反应腔室7中以规定温度保持规定时间。由此，在固相抗体19与测定对象抗原2之间进行抗原抗体反应，在反应腔室7中，形成测定对象抗原2和固相抗体19的结合物。
接着，使用样品溶液的另一部分8洗涤反应腔室7（工序5-C）。此时，不使用所有样品溶液的另一部分8，为了在后述的洗涤分离工序（工序5-E）中使用而残留。该洗涤（工序5-C）与图2所示的免疫学测定法中的工序2-C同样地实施即可。但是，样品溶液的该另一部分8，因为含有测定对象抗原2，所以优选在该测定对象抗原2和固相抗体19之间还没有进行抗原抗体反应时，迅速将其从反应腔室7中除去。通过该洗涤（工序5-C），在工序5-B中未与固相抗体19结合的测定对象抗原2被从反应腔室7除去，测定对象抗原2和固相抗体19的结合物残留在反应腔室7内。
之后，将溶液30导入反应腔室7。溶液30是通过将由标记物质4标记的抗体3添加规定量至溶剂中调制而成，其中，该溶剂不含有具有与测定对象抗原2的抗原表位相同的抗原表位的蛋白质。抗体3使用能够与测定对象抗原2结合的一次抗体，其中，该测定对象抗原2处于与固相抗体19结合的状态。溶液30的溶剂例如为Tris-HCL缓冲液。在反应腔室7中将导入的溶液30以规定温度保持规定时间（工序5-D）。由此，处于与固相抗体19结合的状态的测定对象抗原2、和被标记的抗体3之间进行抗原抗体反应。通过该抗原抗体反应，在反应腔室7中得到作为固相抗体19、测定对象抗原2和抗体3的结合物的抗原抗体复合物，以及作为被标记的抗体3的残留部21的、未与测定对象抗原结合的抗体。抗体3的残留部21为从反应腔室7的表面游离的状态，存在于溶液30中。
这样，本发明的免疫学测定方法也可以为如下方法：在反应腔室中配置有固相抗体，在结合工序中，使固相抗体和测定对象抗原结合，进一步，使抗体的一部分与处于与固相抗体结合的状态的测定对象抗原结合，由此，能够得到作为固相抗体、测定对象抗原和抗体的上述一部分的结合物的抗原抗体复合物，以及作为抗体的残留部的未与测定对象抗原结合的抗体。
（工序5-E：洗涤分离工序）
使用工序5-C中预先残留的样品溶液的另一部分8洗涤反应腔室7。该洗涤与图2所示的免疫学测定法中的工序2-C同样地实施即可。由此，将未与测定对象抗原结合的抗体从反应腔室7中除去，抗原抗体复合物被残留于反应腔室7。这样，通过使用样品溶液洗涤反应腔室，不使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，对在工序5-D中得到的抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体进行分离。认为该分离的精度也优良到与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液洗涤反应腔室的情况相当的程度。
（测定工序）
测定残留在反应腔室7中的抗原抗体复合物中的标记物质4的量。该测定与图2所示的免疫学测定方法中的测定工序同样地实施即可。
（计算工序）
根据测定工序中得到的测定结果，计算出测定对象抗原的浓度。更具体而言，根据该测定结果、固定在反应腔室7中的固相抗原19的量、和在结合工序（工序5-B）中导入反应腔室7的样品溶液的一部分1的量，计算出测定对象抗原2的量。所谓测定对象抗原的量，是与该量相关的物理量，例如可以是浓度。
本发明的免疫学测定方法，只要能够与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液的情况相当的程度地检测出反映测定对象物质的浓度的信号，也可以适当的变更操作和使用的工具。例如，在图2和5所示的免疫学测定方法中，对以标记物质标记一次抗体的情况进行了说明，其中，该一次抗体为用于得到抗原抗体复合物或未与测定对象抗原结合的抗体的一次抗体，但也可以代替这种情况，如图3的概念图所示，用于得到抗原抗体复合物或未与测定对象抗原结合的抗体的一次抗体22为非标记，以标记物质标记与该非标记的一次抗体22结合的二次抗体18。此外，在图2和5所示的免疫学测定方法中，对以从洗涤分离工序后在反应腔室7中残留的抗原抗体复合物和未与测定对象抗原结合的抗体中选择的一方作为对象实施测定工序的情况进行了说明，但也可以代替这种情况，以从通过洗涤分离工序从反应腔室7中除去的抗原抗体复合物和未与测定对象抗原结合的抗体中选择的另一方为对象实施测定工序。此外，如上所述，本发明的免疫学测定方法，从容易在芯片上实施的观点出发，作为反应腔室，优选使用以微板为代表的具有能够保持液体的形状的基体，但也不排除代替上述基体，使用以树脂珠（beads）和磁性珠等珠体为代表的具有不容易保持液体的形状的基体。此外，在图2和5所示的免疫学测定方法中，对分别注入样品溶液，制备用于在反应腔室中诱导抗原抗体反应的溶液，和用于洗涤反应腔室的溶液的情况进行了说明，但也可代替这种情况，通过重新采取样品溶液，准备用于洗涤的溶液。
图4是用于对适于实施本发明的免疫学测定方法的芯片的一例进行说明的图。
芯片100具有：芯片基板11、形成在该基板11上的反应腔室12、洗涤液保持腔室14、废液腔室15和样品溶液注入孔17。作为芯片基板11的材料，例如为以PET为代表的用于在本发明的免疫学测定方法中使用的反应腔室7的材料。
注入孔17和反应腔室12通过形成在芯片基板11上的流路16a连接。而且，注入孔17和洗涤液保持腔室14通过形成在芯片基板11上的流路16b连接。流路16a和流路16b是互不联通的状态。因此，如果将样品溶液注入注入孔17，则该样品溶液分别通过流路16a被分配至反应腔室12，通过流路16b被分配至洗涤液保持腔室14。这样，样品溶液的一部分被送至反应腔室12，并且，样品溶液的另一部分被送至洗涤液保持腔室14而保持在该腔室14中。
反应腔室12中优选固定有从（1）固相抗原和（2）固相抗体中选择的任意一方。在样品溶液的上述一部分被导入至反应腔室12的路径上或者在反应腔室12的内部，优选以能够溶解于该样品溶液中的状态配置与样品溶液中的测定对象抗原特异性结合的一次抗体。一次抗体优选处于由标记物质标记的状态。如果样品溶液的上述一部分被导入反应腔室12，则（1）在反应腔室12中固定有固相抗原的情况下，得到作为测定对象抗原和抗体的结合物的抗原抗体复合物、和作为固相抗原和抗体的结合物的未与测定对象抗原结合的抗体，（2）在反应腔室12中固定有固相抗体的情况下，得到作为固相抗体、测定对象抗原和抗体的结合物的抗原抗体复合物，和作为抗体的残留部的未与测定对象抗原结合的抗体。
反应腔室12和废液腔室15通过形成在芯片基板11上的流路16d连接。而且，洗涤液保持腔室14和反应腔室12通过形成在芯片基板11上的流路16c连接。洗涤液保持腔室14中保持的样品溶液（上述另一部分）在反应腔室12中的抗原抗体反应达到稳定状态后，通过流路16c被注入反应腔室12，进一步通过流路16d从反应腔室12被送至废液腔室15。由此，在反应腔室12中配置有固相抗原的情况下，作为固相抗原和抗体的结合物的未与测定对象抗原结合的抗体残留在反应腔室12中，此外，在反应腔室12中配置有固相抗体的情况下，作为固相抗体、测定对象抗原和抗体的结合物的抗原抗体复合物残留在反应腔室12中。这样，通过利用样品溶液洗涤反应腔室12，能够将抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体分离。
这样，本发明的芯片也可以为以下方式，在反应腔室中固定有固相抗原，未与测定对象抗原结合的抗体处于与固相抗原相结合的状态，通过上述洗涤，未与测定对象抗原结合的抗体残留在反应腔室中，抗原抗体复合物移动至废液腔室。而且，如上所述，本发明的芯片也可以为如下方式，在反应腔室中固定有固相抗体，抗原抗体复合物是固相抗体、测定对象抗原和抗体的结合物，通过上述洗涤，抗原抗体复合物残留在反应腔室内，未与测定对象抗原结合的抗体移动至废液腔室。
通过各个流路传送液体的方法可以采用以下公知的方法：利用电渗流的方法（例如，Barker等、Anal.Chem.；(Article)；2000；72(24)；5925-5929），利用泵的喷射力或吸引力的方法（例如，Hisamoto等、Anal.Chem.；(Article)；2001；73（22）；5551-5556），利用离心力的方法（例如，Duffy等，Anal.Chem.；(Article)；1999；71(24)；4669-4678）等。
如上所述，利用本发明的芯片，即使不使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液，也能够分离抗原抗体复合物、和未与测定对象抗原结合的抗体。如本发明的免疫学测定方法的说明中所述，该分离的精度较高。因此，利用本发明的芯片，能够以与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液的情况相当的程度，检测出反映测定对象物质浓度的信号。关于信号的检测，既可以将从反应腔室12中残留的抗原抗体复合物和未与测定对象抗原结合的抗体中选择的一方作为对象进行该信号的检测，也可以将移动至废液腔室15的另一方对象进行该信号的检测。这样，废液腔室除储藏废液以外，也能够用于实施酶反应，术语“废液”并不限定其用途。
本发明的芯片，只要能够以与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液的情况相当的程度进行良好的测定，还可以适当的改变其设计。例如，也可以另外形成用于将被标记的抗体导入反应腔室的流路，使得能够通过夹心法实施抗原抗体反应。
以下，通过实施例，对本发明进行更详细的说明。
（参考例）
首先，对通过使用缓冲液（Tris-HCL缓冲液），洗涤抗原抗体反应后的反应腔室的参照例进行说明。
（样品溶液的调制）
将42.3μM的CRP溶液与人体正常血清混合，调制具有0nM、10nM、20nM、50nM和100nM的CRP浓度的样品溶液。
（反应芯片的制作）
在厚度1mm的PET板上形成有多个φ5mm的孔。以覆盖该孔的一个端部的方式，使用公知的光固化型粘结剂（Luxtrak：ラツクストラツク）将另一PET板粘贴在该PET板的一个面上。
（CRP的固定化）
使用50mM的Tris-HCL缓冲液（pH7.5）调制42.3nM的CRP溶液。将该CRP溶液向各个反应腔室各导入10μL。接着以树脂片（96孔用片）密封各个反应腔室，通过在35℃下保持1小时，在反应腔室中吸附CRP。之后，使用50mM的Tris-HCL缓冲液（pH7.5）洗涤反应腔室。接着，向各个反应腔室各加入10μL的阻滞剂（生化学工业社（SEIKAGAKU CORPORATION）制ApplieDuo，CatNo.200140），在35℃下保持1小时。这样，阻滞吸附的CRP，在反应腔室中形成固相抗原。之后，再次使用50mM的Tris-HCL缓冲液（pH7.5）洗涤反应腔室。
（抗原抗体反应）
向反应腔室导入被碱性磷酸酶（ALP：alkaline phosphatase）标记的880nM的抗CRP单克隆抗体1μL、样品溶液1μL和人体正常血清8μL，在35℃温度下保持15分钟。这样，使固相抗原与抗体、以及CRP与抗体之间进行抗原抗体反应。而且，各个反应腔室中的抗体的最终浓度均为88nM，最终CRP浓度各自约为0nM、10nM、20nM、50nM和100nM。
（洗涤分离）
将洗涤液20μL导入反应腔室后将其排除。洗涤液使用50mM的Tris-HCL缓冲液（pH7.5）。这样洗涤反应腔室。由此，将作为CRP和抗体的结合物的抗原抗体复合物、与作为固相抗原和抗体的结合物的未与测定对象抗原结合的抗体分离。更具体而言，从反应腔室除去抗原抗体复合物，并将未与测定对象抗原结合的抗体残留在反应腔室内。
（测定）
在各个反应腔室中导入10μL的对硝基苯磷酸溶液（Cygnus社制PNPP Liquid Substrat，CatNo.F008-1000；pNPP）。由此，使未与测定对象抗原结合的抗体中的ALP和pNPP之间进行酶反应。从各个反应腔室测定该酶反应的生成物对硝基苯（pNP）的吸光度。
（实施例）
除了通过代替洗涤液，使用20μL的样品溶液对抗原抗体反应后的反应腔室进行洗涤以外，与参考例相同地实施免疫学测定。通过分别注入用于诱导抗原抗体反应的样品溶液，制备用于该洗涤的样品溶液。
（比较例）
除了在抗原抗体反应后未洗涤反应腔室以外，与参考例相同地进行免疫学测定。更具体而言，在不除去导入的洗涤液的状态下，进一步将pNP导入反应腔室，并测定吸光度。
图6是表示由各例得到的吸光度的测定结果的图表。吸光度，表示为以从参考例中的最终CRP浓度为约0nM的反应腔室得到的吸光度为1时的相对值。
表1是根据图6的图表，对各自的吸光度的背景（background）和偏差的好坏进行评价后的结果。吸光度的背景的评价中，以平均值的绝对值通过洗涤变得最低时为“◎”，其次为“〇”，保持原样地受到背景的影响时为“×”。吸光度的偏差评价中，以标准偏差最小的为“◎”，比其略大的为“〇”，明显更大的为“×”。
[表1]
| 参考例 | 实施例 | 比较例 | |
| 背景 | 〇 | ◎ | × |
| 偏差 | ◎ | 〇 | × |
如表1所示，即使在洗涤中使用样品溶液，也能够得到与使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液的情况相当的程度的优良的洗涤效果。
工业上的可应用性
本发明提供一种免疫学测定方法，其不需要将以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液从芯片的外部供给或预先保持在芯片上，对于需要在芯片上实施免疫学测定方法的各个领域中具有很大的利用价值。
Claims (2)
1.一种免疫学测定方法，其为使用芯片测定样品溶液中含有的测定对象抗原的量的方法，该方法的特征在于：
所述芯片具有反应腔室、洗涤液保持腔室、废液腔室、和注入所述样品溶液的注入孔，
所述注入孔和所述反应腔室之间通过第一流路连接，
所述注入孔和所述洗涤液保持腔室之间通过第二流路连接，
所述洗涤液保持腔室和所述反应腔室之间通过第三流路连接，
所述反应腔室和所述废液腔室之间通过第四流路连接，在所述反应腔室内固定有固相抗体，
所述方法包括：
从所述注入孔注入所述样品溶液，将所述样品溶液通过所述第一流路分配给所述反应腔室，并通过所述第二流路分配给所述洗涤液保持腔室的工序；
在所述反应腔室内，使所述固相抗体与所述样品溶液中含有的测定对象抗原结合，进一步，使抗体的一部分与处于与所述固相抗体结合的状态的所述测定对象抗原结合，得到抗原抗体复合物的结合工序，其中，该抗体为与所述测定对象抗原特异性结合的抗体，所述抗原抗体复合物是所述固相抗体、所述测定对象抗原和所述抗体的结合物；
通过所述第三流路向所述反应腔室注入保持在所述洗涤液保持腔室中的所述样品溶液，并对具有所述抗原抗体复合物的所述反应腔室进行洗涤，由此，将选自
i)所述抗原抗体复合物、和
ii)未与所述测定对象抗原结合的所述抗体中的一方残留在所述反应腔室内，并将另一方移动至所述废液腔室，将所述抗原抗体复合物和未与所述测定对象抗原结合的所述抗体分离的工序；
对所述抗原抗体复合物或未与所述测定对象抗原结合的所述抗体的量进行测定的工序；和
根据测得的所述抗原抗体复合物或未与所述测定对象抗原结合的所述抗体的量，计算出所述样品溶液中含有的所述测定对象抗原的量的工序，
在进行所述分离的工序中，将所述抗原抗体复合物残留在所述反应腔室内，并将未与所述测定对象抗原结合的所述抗体移至所述废液腔室。
2.一种芯片，其为用于测定样品溶液中含有的测定对象抗原的量的芯片，该芯片的特征在于：
具有反应腔室、洗涤液保持腔室、废液腔室、和注入所述样品溶液的注入孔，
所述注入孔和所述反应腔室之间通过第一流路连接，
所述注入孔和所述洗涤液保持腔室之间通过第二流路连接，
所述洗涤液保持腔室和所述反应腔室之间通过第三流路连接，
所述反应腔室和所述废液腔室之间通过第四流路连接，
从所述注入孔注入的所述样品溶液，通过所述第一流路流向所述反应腔室，并通过所述第二流路流向所述洗涤液保持腔室，
在所述反应腔室内固定有固相抗体，使所述固相抗体和所述测定对象抗原结合，进一步，使抗体的一部分与处于与所述固相抗体结合的状态的所述测定对象抗原特异性结合，得到抗原抗体复合物，其中，所述抗原抗体复合物是所述固相抗体、所述测定对象抗原和所述抗体的结合物，
通过所述第三流路向所述反应腔室注入保持在所述洗涤液保持腔室中的所述样品溶液，并对具有所述抗原抗体复合物的所述反应腔室进行洗涤，由此，将所述抗原抗体复合物残留在所述反应腔室内，并将未与所述测定对象抗原结合的所述抗体移至所述废液腔室，将所述抗原抗体复合物和未与所述测定对象抗原结合的所述抗体分离。
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