KR100990230B1 - 임피던스 측정 방식을 이용하여 면역학적으로 세균을검출하는 바이오센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 임피던스의 변화를 측정함으로써 식품에 포함된 살모넬라와 같은 세균을 검출하기 위한 바이오센서에 관한 것으로, 반도체 공정을 이용하여 개발된 센서의 전극 위에 살모넬라 항체를 고정시켜 식품 속의 살모넬라와 결합하여 변화하는 교류저항, 즉 임피던스의 변화를 측정하는 방식으로 살모넬라를 검출하는 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명에 관한 바이오센서에서는 서로 교차되는 전극을 가진 센서를 실리콘웨이퍼 위에 형성하고, 이렇게 형성된 전극 위에 살모넬라 항체를 고정하여, 식품 속의 살모넬라와 센서 위의 항체의 결합에 의해 변화하는 임피던스를 이용하여 센서의 임피던스 변화를 측정할 수 있다.

Description

임피던스 측정 방식을 이용하여 면역학적으로 세균을 검출하는 바이오센서{Biosensor for detecting bacteria using impedence measuring method}

본 발명은 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 임피던스 측정 방식을 이용하여 면역학적으로 세균을 정밀하게 검출할 수 있는 바이오 센서에 관한 것이다.

본 발명은 식품위생분야에 있어서 살균 또는 살균 전의 식품에 포함된 세균을 검출하거나, 대형 급식소 등에서 식품의 세균을 실시간으로 검출하는 기술 분야에 관한 것으로, 반도체 전극 개발기술과 생물학적 면역방법을 모두 이용하는 기술에 관한 것이다.

살모넬라 등의 식중독 원인 균을 검사하기 위한 표준방법으로 사용되는 표준평판법은 식중독의 원인균을 찾아내는데 48시간 이상의 시간이 걸리며, 실험실과 같이 멸균된 시설에서 전문 인력이 검사 작업을 수행해야 하는 문제가 있다. 따라서 학교 급식을 포함한 집단급식시설에서의 집단 식중독 사고를 줄이기 위한 체계적이고 효율적인 관리를 위해서는 급식 현장에서 신속히 세균을 검출할 수 있는 바이오센서의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 식품위생분야에서 식품에 포함된 세균을 검출하기 위해 사용되던 기술로, 전자기술을 이용하여 효소면역측정방법(ELISA test; enzyme-linked immunosorbent asssay test)을 개량한 기술이 사용되고 있다. 그런데 이와 같은 종래의 ELISA 기술은 색의 변화를 간접적으로 측정하는 기술이어서, 정밀한 측정이 어려워 검출 정밀도가 높지 않은 문제점이 있었다.

또한 종래의 면역학적 세균 검출 방법은, 24시간 이상의 긴 시간이 소요되는 배양과, 여러 가지 복잡한 과정을 거쳐 세균을 동정하는 방법을 이용하기 때문에 많은 시간과 비용 및 전문 인력이 필요한 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 식품에 포함된 세균을 면역학적으로 검출할 수 있는 바이오센서를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 임피던스 측정 방식을 이용하여 식품에 포함된 세균을 정밀하게 검출할 수 있는 바이오센서를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전문 인력을 이용하지 않으며 적은 비용만으로도 짧은 시간 안에 식품에 포함된 세균을 정밀하게 검출할 수 있는 바이오센서를 제공하는 데 있다.

본 발명은 반도체 공정기술과 첨단의 계측기술을 이용함으로써 식품에 포함된 세균을 검출하는 정밀도가 크게 향상되며, 짧은 시간 안에 세균을 검출할 수 있는 임피던스 측정 방식을 이용하여 면역학적으로 세균을 검출하는 바이오센서를 제공한다.

본 발명에 관한 바이오센서는, 두 개의 전극들의 표면에 세균의 항체를 고정하여 세균과 항체의 면역학적 결합의 임피던스의 변화를 이용하여 세균을 검출하는 바이오센서이며, 전극들은 금(Au)을 포함하고, 전극들의 폭은 8 내지 10㎛ 이다.

본 발명에 있어서, 전극들의 사이의 간격은 0.5 내지 1.5 ㎛ 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 전극들은 서로 맞물리도록 배치되며, 맞물려 형성되는 전극들의 가로와 세로의 길이는 각각 0.5 내지 1.5 ㎛ 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체는 모노크로날 안티바디를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체는 단백질을 매개로 전극들에 결합될 수 있다.

상술한 바와 같은 본 발명의 바이오센서는, 반도체 공정기술과 임피던스를 측정하는 첨단의 계측기술을 이용함으로써 식품에 포함된 세균을 짧은 시간 안에 정밀하게 검출할 수 있다.

따라서 종래의 검출 방법에 의하면 세균의 배양을 위해 24시간 이상의 긴 시간이 필요한 문제가 있었으나, 본 발명의 바이오센서에 의하면 세균의 검출과 동정을 현장에서 바로 측정할 수 있으므로, 대량으로 식사를 제공하는 급식소 및 식당 등의 위생을 철저히 할 수 있는 장점이 있다.

이하, 첨부 도면의 실시예들을 통하여, 본 발명에 관한 바이오센서의 구성과 작용을 상세히 설명한다.

항원-항체 반응을 이용한 바이오센서의 개발은 각종 진단키트의 개발 방법으로 가장 널리 사용되는 방법 중의 하나이다. 소변을 이용한 당뇨병 진단, 임신 진단, 혈액을 이용한 질병의 검사 등이 대표적인 항원-항체 반응을 이용한 사례이다.

진단키트의 개발에 있어 중요한 설계가 되는 부분은 항원-항체 반응을 어떻게 측정하는가 하는 방법이다. 따라서 본 발명에서는 항원-항체 반응을 전기적인 방법으로 측정하는 방법을 이용하였다.

살모넬라는 두께 0.5㎛, 길이 2 내지 4㎛의 세균으로 광학현미경을 이용하여 세균을 개체 단위로 관찰하는 것이 불가능하며, 전자현미경을 이용하여 관찰하기 위해서는 까다로운 전처리 공정을 거쳐야만 관찰 가능하다. 이러한 어려움으로 인해 인체에 해로운 세균을 동정해 내고, 검출하는 것은 식품위생에서 뿐만 아니라, 병리학적인 측면에서도 매우 중요 하다.

종래에는 반도체 센서의 개발에 있어서, 주로 가속도 센서나 자이로 센서와 같이 실리콘웨이퍼 위에 입체구조물을 형성하여 센서의 감도를 높이는 연구가 수행되어 왔다. 그러나 항원-항체 반응을 이용한 센서의 세척, 항체 고정, 항원 반응 등의 과정을 거쳐야 하고 센서의 제작 과정에서 센서에 반응되지 않은 항원, 항체, 수분 등이 센서에 남지 않아야 하므로 평면형 반도체 센서 구조를 선택하였다. 또한 평면형 반도체 센서는 제작이 쉬우면서도 센서 전극간의 거리를 가까이 할 수 있어 센서의 감도를 높일 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서는 센서 시뮬레이션 결과를 이용하여 반도체 센서를 제작하였으며, 제작된 센서의 전기적인 성능을 평가하였다. 또한 반도체 센서에 항체를 고정하고 항원과 반응시켜 임피던스 변화를 측정하고, 이를 시뮬레이션 결과와 비교하였다. 살모넬라 항원의 농도를 변화시키며 센서의 임피던스변화를 측정함으로써 살모넬라 항원의 농도측정모델을 개발하고 측정된 모델을 검증하였다. 우유와 닭에서의 살모넬라 측정 가능성을 평가하기 위하여 농도에 따른 시료의 임피던스를 측정하고 개발된 살모넬라 농도 측정 모델을 이용하여 센서의 실용가능성을 평가하였 다.

임피던스 측정 방법은 측정하고자 하는 대상의 주파수대역과 임피던스 값의 범위에 따라 그 측정방법이 달라진다. 특히 바이오센서의 개발에서 사용되는 항원과 항체의 종류는 매우 많고 다양하기 때문에 측정해야할 임피던스의 범위도 매우 넓고 다양하다. 또한, 생체물질들의 반응 주파수는 수백 MHz의 고주파대역 보다는 100kHz이하의 저주파수 대역이기 때문에 바이오센서의 개발을 위해서는 저주파 대역에서 임피던스를 정확히 측정할 수 있는 장비가 필수적이다.

임피던스 측정기는 미국 Agilent사의 4294A를 사용하였으며, 측정 주파수는 40Hz 내지 110MHz 범위에서 3mΩ 내지 500MΩ까지 임피던스를 측정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 관한 임피던스 측정 방식을 이용하여 면역학적으로 세균을 검출하는 바이오센서는, 항원-항체 반응에 의하여 변화되는 전기적인 성질을 이용하는 항원-항체 반응형 임피던스식 바이오센서에 해당한다. 두 전극의 사이에 존재하는 물질의 종류에 따라 두 전극 사이에 저장되는 전기에너지의 양과 두 전극 사이에 흐르는 전하의 양이 변화함에 따라, 바이오센서의 임피던스도 변화한다.

이러한 임피던스 변화는 두 전극 사이의 거리가 가까울수록, 전극의 크기가 클수록 크며, 반응하는 항원의 유전율이 클수록, 항원의 수가 많을수록 임피던스 변화가 크게 나타난다.

그런데 평행판 축전기의 형상은 서로 마주보는 전극이지만, 본 발명의 실제 제작할 센서는 평면 위에 전극이 배열되는 형상이므로 전극 사이에 형성되는 전 기장의 경로가 평행판 축전기의 경우보다 멀어지게 된다. 전극의 폭을 크게하면 센서의 정전용량의 변화는 커지지만 전극간의 유효 거리가 멀어지게 되어 센서의 감도가 떨어지게 된다. 그러므로 실제 센서의 제작에 있어서는 전극의 폭을 넓게 만들 수 없는 문제가 있었다.

이러한 문제 때문에 전극의 폭을, 측정 대상인 살모넬라의 길이(4㎛)의 2.5배인 10㎛로 설계하였다. 이와 같이 전극의 폭을 10㎛로 설계함으로써 살모넬라가 센서의 표면에 항체와 결합하여 고정될 때 너무 적은 수가 센서의 표면에 항체와 결합하는 것을 방지하고, 전극 간의 유효 거리가 멀어지는 것을 방지할 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 한정되지 않으며 전극의 폭은 8 내지 10㎛ 의 범위에서 정해질 수 있다.

전극 사이의 거리도 측정 대상인 살모넬라의 길이(4㎛)의 1/4인 1㎛로 설계하였다. 이와 같이 전극 간의 거리를 1㎛로 설계함으로써 살모넬라와 항체가 결합함으로써 변화되는 정정용량의 변화를 크게 할 수 있었다.

표 1은 전극의 폭과 간격을 각각 10㎛ 및 1㎛로 설계 하였을 때 센서의 임피던스 변화를 시뮬레이션 한 결과이다. 시뮬레이션에는 수학식 1을 이용하였다.

여기서, C는 정전용량(임피던스의 허수성분)이고, ε는 유전율이며, D는 평행판 충전판 사이의 거리이고, S는 평행판 충전판의 면적이다.

또한 본 발명의 일 실시예에 관한 바이오센서에 있어서, 전극들이 서로 엇갈리는 부분의 전극의 폭과 길이를 같게 하는 것이 평면형 센서에 있어서 전극 간의 유효 거리를 줄일 수 있으며, 엇갈리는 전극 이외의 전극의 폭은 가능한 한 좁게 하는 것이 센서의 효율을 높일 수 있다. 이는 센서의 측정값으로부터 전체 센서의 임피던스에 대한 임피던스 변화를 보는 것이므로, 유효범위 밖의 면적을 불필요하게 넓게하면 센서의 감도가 떨어지기 때문이다.

상술한 설명들을 기초로 제작된 본 발명의 바이오센서에 관한 반도체센서는 10㎜×10㎜ 크기의 실리콘 웨이퍼 위에 금 전극으로 제작되었으며, 항원-항체 반응이 일어나는 전극의 길이는 5㎜로 제작하였고, 전극의 끝부분은 1㎜×1㎜의 정사각형으로 만들어 센서의 신호를 측정할 수 있는 탐침을 연결할 수 있도록 제작하였다.

임피던스 변화형 항원-항체 센서의 재질은 실리콘 웨이퍼와 유리 웨이퍼를 모두 사용할 수 있지만, 실리콘 웨이퍼의 경우 유리 웨이퍼에 비해 견고하고 회로의 집적이 가능한 장점이 있다.

전극으로는 생물체와 접촉하였을 경우 영향이 적고, 화학적으로 항체를 결합시키기 좋은 전극인 금(Au)를 선택하였다. 금은 실리콘웨이퍼와 유리에 모두에 접착성이 좋지 않기 때문에 접착층(adhesion layer)으로 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti)을 사용하였고, 본 발명에서는 센서의 제작을 위하여 티타늄을 접착 층으로 사용하여 금 전극을 제작하였다. 전극의 증착방법으로는 열증착법(thermal evaporation)을 사용하였다.

도 1 내지 도 3은 바이오센서를 제작하기 위해 반도체 센서를 제작하는 공정의 각 단계를 개략적으로 도시한 것으로, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 관한 바이오센서의 반도체 센서를 제작하기 위해 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 도포한 상태를 도시한 측면도이고, 도 2는 도 1의 실리콘 웨이퍼 위에 티타늄과 금을 증착한 상태를 도시한 측면도이며, 도 3은 도 3의 실리콘 웨이퍼에서 감광제를 제거한 상태를 도시한 측면도이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 센서의 패턴을 만들기 위하여 실리콘 웨이퍼(4) 위에 감광제(5; photo resist)를 도포한 후, 형성될 전극의 패턴 모양으로 감광제(5)의 일부를 제거한다.

그 이후에, 도 2와 같이 실리콘 웨이퍼(4) 및 감광제(5)의 표면에 접착층으로서 티타늄(3; Ti)을 증착한 후 결합층으로서 금(2; Au)을 증착하였다. 그리고 아세톤을 이용하여 감광제(5)를 제거하면 도 3과 같이 실리콘 웨이퍼(4) 위에 패턴을 형성하는 전극(2, 3)이 형성되어 반도체 센서의 제작이 완료된다. 도 4는 도 3의 반도체 센서의 표면을 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

도 5는 도 3의 바이오센서에서 전극과 살모넬라 항체를 고정한 상태의 측면도이다.

면역 바이오센서는 도 3의 반도체 센서의 전극(2,3)의 표면에 살모넬라 항체(20)를 고정시켜 제작한다. 제작된 면역 바이오센서의 임피던스를 측정한 후, 살모넬라 항원과 반응시킨 후의 임피던스를 측정하여 살모넬라 항원(10)의 농도를 측정하게 된다.

살모넬라 공통항체(Antibody to Salmonella Common Structural Antigens)는 Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.에서 구입하여 사용하였다. 구입한 항체의 농도는 1.0mg/㎖이었으며, 인산완충용액(pH 7.4)에 10배 희석하여 사용하였다.

살모넬라 항원(Salmonella enteritidis)과 E. Coli는 한양대학교 식품영양학과에서 제공 받아 사용 하였고, 살모넬라 항원(Salmonella enteritidis)은 37℃에서 3일간 배양하여 약 108CFU/㎖의 농도까지 배양하였다. 배양된 살모넬라 항원은 그림 4.17와 같이 표준평판법(SPC, Standard Plate Count)으로 정확한 살모넬라 항원의 농도를 측정하였으며, 농도를 측정한 항원을 인산완충용액(pH 7.4, EC 20.7mS/m)으로 희석하여 실험에 사용하였다.

항체를 반도체 센서위에 고정하는 방법에 대한 연구가 많이 진행되었는데, 본 실시예에서는 센서에 결합하는 항원의 결합력을 높이기 위하여 도 5와 같은 구조의 바이오센서를 제작하였다.

도 5의 구조를 갖는 면역 바이오센서를 만들기 위한 항체 고정 방법과 각 처리 공정별 작업방법은 다음과 같다.

(1) 반도체 센서의 표면 세척

반도체 센서의 표면에 있을 수 있는 유기물질로 인한 측정 오차를 없애기 위하여 센서의 표면에 pirahna 용액(30 vol.% H2O2 and 70 vol.% H2SO4, vol/vol)을 센서의 표면에 가하여 60℃에서 5분간 세척한 후에 ethanol과 deionized water로 센서표면을 닦는다.

(2) 11-MUA와 Hexanethiol이 혼합된 박막의 제조

금으로 형성된 전극의 표면에 항체를 고정하기 위하여 금과 항체를 이어줄 박막을 형성한다. Glycerol과 Ethanol의 비율이 1대1(vol./vol.)인 용액에 50mM 11-MUA와 100mM Hexanethiol을 넣어 만든 용액에 반도체 센서를 담가 센서 표면에 박막(40)을 형성한다.

(3) 프로테인-G(30)와 11-MUA&Hexanethiol 박막(40)과의 결합

항체와 결합력이 좋은 프로테인-G(30)를 11-MUA & Hexanethiol 박막(40)과 결합시킨다. 11-MUA & Hexanethiol 박막(40)이 입혀진 반도체 센서(2,3,4)를 상온에서 2 시간 동안 10% EDAC(water/ethanol (10/1, v/v)에 담가 전처리를 행한 후, 2 시간동안 상온에서 프로테인-G가 담겨있는 용액(10mg/l protein-G in 10mM phosphate buffer(pH 7.4) containing 0.14 mol/l NaCl and 0.02%(w/v) thimerosal (PBS))에 담가 self-assembled protein G layer를 만든다. 이렇게 제작된 센서를 0.1% Tween 20용액에 20-30분 담근 후 인산완충용액으로 씻어낸다. 항체를 고정하기 전에 1몰의 ethanolamine으로 남아있는 11-MUA를 비활성 시킨다.

(4) 항체의 고정

준비된 항체(20)를 반도체 센서 표면에 가한 후, 2시간 동안 온도 5℃, 습도 90% 이상의 항온항습조에 놓아둔다. 다시 반도체 센서의 표면을 인산완충용액으로 씻어낸다.

(5) 임피던스의 측정

항체(20)가 고정된 반도체 센서의 표면에 인산완충용액 150㎖를 가한 후 반도체 센서의 임피던스를 측정한다. 임피던스의 측정은 센서를 임피던스 측정기에 연결한 후 10분 후에 측정한다.

<살모넬라 항원의 측정 방법 및 측정 조건 구명>

배양된 살모넬라 항원(Salmonella enteritidis)은 인산완충용액에 농도별로 희석하여 5 수준으로 샘플을 제작하였다. 살모넬라 측정샘플의 농도는 4 CFU/㎖, 38 CFU/㎖, 380 CFU/㎖, 3800 CFU/㎖, 38000 CFU/㎖로 제작하였다.

살모넬라 항체(20)를 고정한 면역 바이오센서를 이용하여 살모넬라 항원(10)을 측정하였다. 살모넬라 항원(10)을 센서에 반응시키기 전에 면역 바이오센서의 임피던스를 측정하여 살모넬라 항원을 측정하기 위한 센서의 기준값으로 설정한다.

기준값을 측정한 센서의 표면에 살모넬라 항원 150㎕를 가하고, 항온항습조(37℃, 상대습도 90%)에 30분간 놓아 항원과 항체를 반응시킨다. 항원-항체 반응이 끝난 후 항체와 반응하지 않은 살모넬라항원을 인산완충용액으로 충분히 닦아내고, 센서 표면에 인산완충용액 150㎕를 가하여 면역 바이오센서의 임피던스를 측정한다.

센서의 임피던스는 8번 측정하여 그 평균값을 사용하였다. 측정은 센서를 임피던스 측정기에 연결한 후 10분 후에 측정을 시작하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 관한 바이오센서를 이용하여 살모넬라의 농도에 따른 임피던스 변화를 나타내는 그래프이다.

도 6을 참조하면, 살모넬라 항원의 농도가 3.8×10³ 일때 임피던스 값이 크게 나타났으며, 임피던스 측정을 통하여 시료 속의 살모넬라의 농도를 측정할 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바이오센서는 반도체 공정기술과 임피던스를 측정하는 첨단의 계측기술을 이용하여 식품에 포함된 세균을 짧은 시간 안에 정밀하게 검출할 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해져야 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 관한 바이오센서의 반도체 센서를 제작하기 위해 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 도포한 상태를 도시한 측면도이고, 도 2는 도 1의 실리콘 웨이퍼 위에 티타늄과 금을 증착한 상태를 도시한 측면도이며, 도 3은 도 3의 실리콘 웨이퍼에서 감광제를 제거한 상태를 도시한 측면도이다.

도 4는 도 3의 반도체 센서의 표면을 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

도 5는 도 3의 바이오센서에서 전극과 살모넬라 항체를 고정한 상태의 측면도이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 관한 바이오센서를 이용하여 살모넬라의 농도에 따른 임피던스 변화를 나타내는 그래프이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

2: 금 10: 살모넬라 항원

3: 티타늄 20: 살모넬라 항체

4: 실리콘 웨이퍼 30: 프로테인-G

5: 감광제 40: 11-MUA와 Hexanethiol 박막

Claims (5)

1. 실리콘 웨이퍼;

   티타늄(Ti)을 포함하여 상기 실리콘 웨이퍼의 위에 형성된 접착층과, 금(Au)을 포함하여 상기 접착층의 위에 형성된 결합층을 구비하는 두 개의 전극들;

   11-MUA와 헥산티올(hexanethiol)을 포함하여 상기 결합층의 위에 형성된 박막;

   상기 박막의 위에 형성된 프로테인-G; 및

   상기 프로테인-G를 매개로 상기 전극들의 표면에 고정된 세균의 항체;를 구비하며,

   상기 세균과 상기 항체의 면역학적 결합으로 인한 상기 전극들의 임피던스의 변화를 이용하여 상기 세균을 검출하는 바이오센서에 있어서,

   상기 전극들은 금(Au)을 포함하고, 상기 전극들의 폭은 8 내지 10㎛ 이며, 상기 전극들의 사이의 간격은 0.5 내지 1.5 ㎛ 이고, 상기 전극들은 서로 맞물리도록 배치되며, 맞물려 형성되는 상기 전극들의 가로와 세로의 길이는 각각 0.5 내지 1.5 ㎛ 이고,

   상기 항체는 모노크로날 안티바디를 이용하는, 바이오센서.
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