CN100480703C - 幽门螺旋杆菌抗体及其抗原结合片段在传感器制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断幽门螺旋杆菌感染的新方法。具体而言,本发明涉及新型的非侵入方法,该方法使用基于生物传感器的测量法检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物。本发明还涉及生物传感器的应用,所述传感器包含固定于其上的幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段和防止非特异性结合的生物分子拒斥聚合物。本发明还涉及该方法中使用的检测试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及用于诊断幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染的新方法.具体而言,本发明涉及新的非侵入方法,使用基于生物传感器的测量法检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物.本发明还涉及生物传感器的用途,所述生物传感器包含幽门螺旋杆菌的特异抗体或其抗原结合片段,其与防止非特异性结合的生物分子拒斥聚合物一起固定于生物传感器上。本发明还涉及该方法中使用的检测试剂盒。
发明背景
幽门螺旋杆菌是在人类上胃肠道发现的弯曲革兰氏阴性细菌.自从该细菌在1982年首次分离以来,大量证据集中证明了幽门螺旋杆菌与以下多种胃病症有关,包括消化不良(胃灼热、胃气胀和恶心)、表现为慢性浅表性胃炎或慢性活动性胃炎的有症状的或无症状的胃粘膜炎症、胃溃疡和十二指肠溃疡、甚至胃癌和各种胃淋巴瘤[Dunn,B.E.等人,Clinical Microbiology Reviews,10(1997)720-740]。目前,人们相信几乎所有的原来被认为是自发性胃溃疡的病例实际上是由幽门螺旋杆菌感染引起的[NIH Consensus Conference,JAMA 276(1994)1710].
幽门螺旋杆菌是世界范围的人类致病菌.其它已知的携带该细菌的物种是非人类灵长类动物。幽门螺旋杆菌感染已经与社会经济发展相关:在发展中国家,70到90%的人口携带该细菌,而在发达国家,该感染的发病率约为25到50%。该感染在童年获得,通常在10岁之前获得,据信发病率随卫生保健的改善而降低。然而,虽然认为粪便-口腔和口腔-口腔途径是最主要的途径,但该感染的传播途径并不是明确已知的(Dunn,B.E.等人,同前).
有多种方法和分析法,包括侵入的和非侵入的,可用于诊断幽门螺旋杆菌感染.侵入方法涉及胃或十二指肠的活组织检查。可对该活组织检查样品进行视觉或组织学检查、细菌培养、测试由幽门螺旋杆菌产生的尿素酶、或用基因技术分析。大多数的这些方法都有市售产品.非侵入方法包括检测幽门螺旋杆菌抗体的血清学试验和使用13C或14C标记的尿素的尿素呼吸试验,两者都有市售的多种试验品。另外,已经描述了测量血清[Moulton-Barret,R.G.等人,Am.J.Gastroenterol 88(1993)369-374]和尿[Pathak,C.M.等人,Am.J.Gastroenterol 89(1993)734-738]中幽门螺旋杆菌基底代谢的分析法.
免疫测定法测量患者血清或血样(参见例如,US专利5,262,156;Pyloriset EIA-A and EIA-G,Orion Diagnostica,Finland)、尿样(参见例如,US专利5,262,156)、和唾液或其它粘液分泌样本(参见例如,US专利6,068,985;Home Helicobacter Test,Ani Biotech Oy,Finland)中幽门螺旋杆菌的IgG、IgA或IgM抗体的存在.所述幽门螺旋杆菌抗体的测定方法具有几个缺点,如强烈依赖于用于捕获抗体的抗原制剂、相关菌种抗体的交叉反应、和得到可靠的试验结果需要相对长的时间.用在诊室中的所谓的“基于诊室”或“接近患者”测试法的准确性比常规的实验室分析法的准确性差[Cohen,H.等人,Gastroenterology 110(1996)A83;Sadowski,D.等人,Gastroenterology 110(1996)A246]。重要的是,依靠于检测幽门螺旋杆菌特异抗体的这些分析法不太适合于治疗和治愈的评定和随访,因为升高的抗体水平在感染的治疗和治愈后长期保持。随访研究表明治疗后抗体水平的下降有很大不同[Kosunen,T.U.等人,Lancet 339(1992)893-895;Cutler,A.等人,Dig.Dis.Sci.38(1993)2262-2266],但抗体水平的降低通常需要几个月,该降低可靠地预示了治愈.
代替检测幽门螺旋杆菌特异抗体的检测法,检测生物样品中的幽门螺旋杆菌抗原或代谢物解决了这一缺点.US专利5,716,791、5,871,942和5,932,430特别公开了用于检测粪便样品中幽门螺旋杆菌抗原的方法,其通过使抗原与多克隆抗体复合并用第二抗体检测由此形成的复合体来进行。国际专利申请WO 01/44815公开了使用如ELISA方法检测血样中幽门螺旋杆菌抗原的方法。已建议使用这些方法用于幽门螺旋杆菌感染的疗效的随访。
然而,常规的免疫测定法依靠标记分子如放射性标记、酶标记、荧光标记、或化学发光标记,并且是费力的和费时的,因为在实际检测之前需要数次培养、洗涤和分离步骤.另外,为了操作可靠,需要熟练的工作人员和相当昂贵的仪器.样品,特别是粪便样品,也可引起各种问题.许多患者发现收集一份粪便样品使人感到不愉快并且是不卫生的,更不要说收集数份随访所必需的粪便样品了,并且对他们的治疗依从性也是个挑战。类似地,由于固有的感染危险,工作人员可能不喜欢处理粪便样本和制备用于这种分析的样品.
显然,需要进一步改善的诊断幽门螺旋杆菌感染的诊断方法。
因此本发明的一个目的是提供高灵敏度和特异性的方法和方式,用于非侵入检测和测定生物样品中的幽门螺旋杆菌抗原和/或由所述细菌产生的代谢物.
本发明的另一个目的是提供改善的方法和方式,用于可靠地随访幽门螺旋杆菌感染的药物治疗效果和确定患者的治愈,而较少引起患者的不便.
本发明的另一个目的是提供用于检测幽门螺旋杆菌感染的改善的方法和方式,该方法可靠地适于在诊室和保健中心使用,那里的技术人员的技能和常规操作可能不如临床实验室中的先进.
本发明的另一个目的是提供用于检测幽门螺旋杆菌感染的改善的方法和方式,该方法是简单的、迅速的和实时的,使得患者甚至在医院或诊室看病的过程中就可以获得测试结果,从而避免患者的数次应诊。
发明简述
出乎意料地发现了采用基于使用高度特异和敏感的生物传感器的方法,有可能非侵入地检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌,从而满足本发明的目的.本发明中使用的生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了固定化抗体或抗体片段之间的表面.这些生物分子拒斥分子有效地防止分析物和存在于生物样品中的污染(生物)分子的不希望的非特异性结合,并且高度增加分析的灵敏度.这种生物传感器用于可靠地检测任何生物标本中的幽门螺旋杆菌抗原和/或由所述细菌产生的代谢物。
本发明涉及非侵入方法,该方法用于检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物,其包括使得自患有或被怀疑患有幽门螺旋杆菌感染的患者的生物样品与生物传感器接触,并且检测由抗体-抗原-复合体的形成所产生的信号,所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上连接有幽门螺旋杆菌抗体或抗原结合片段连同生物分子拒斥分子.
本发明进一步涉及生物传感器在诊断幽门螺旋杆菌感染中的用途,所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了固定化抗体或其抗原结合片段之间的表面。
本发明还涉及用于检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物的检测试剂盒,该检测试剂盒包含生物传感器和检测所需的试剂,所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了所述固定化抗体或抗体片段之间的表面.
附图简述
图1表示本发明的方法中使用的载体基底/生物传感器的示意图,在其上连接有幽门螺旋杆菌抗体的Fab′片段连同生物分子拒斥分子.
图2表示本发明的方法中使用的载体基底/生物传感器与用于放大检测/信号的胶体/纳米粒子的示意图。
图3A和3B表示用于SPR测量法的标准曲线和标准偏差。
图4表示检测粪便样品中幽门螺旋杆菌的SPR结合等温线。条形图表示用不同薄层进行的两次测量。BSF37和BSF48是得自幽门螺旋杆菌阳性患者的样品,BSF51是得自幽门螺旋杆菌阴性患者的样品。“ref”表示空白.
图5表示检测尿样中幽门螺旋杆菌的SPR结合等温线.样品1和3是得自幽门螺旋杆菌阳性患者的样品,样品2是得自幽门螺旋杆菌阴性患者的样品.“ref”表示空白,BSU表示患者的尿样。
发明详述
本发明建立在能足够灵敏和特异地检测和/或测量少量的抗体-抗原-复合物的方法和方式基础上,其中的抗体-抗原-复合物在对幽门螺旋杆菌细菌、其抗原和/或由所述细菌产生的代谢物特异的抗体或其抗原结合片段与幽门螺旋杆菌衍生抗原的免疫反应中形成.使用这样的方法和方式,可以在任何可非侵入地由幽门螺旋杆菌感染的患者获得的生物样品中检测幽门螺旋杆菌抗原和/或由所述细菌产生的代谢物。
本文使用的术语“幽门螺旋杆菌抗原”和“幽门螺旋杆菌衍生抗原”指由幽门螺旋杆菌细菌的表面抗原或幽门螺旋杆菌细菌分解或代谢产生的抗原。本文使用的术语“抗原结合片段”和“抗体片段”指幽门螺旋杆菌特异抗体的(Fab′)2或Fab′片段.
本发明的方法的优点在于使用特定载体基底和包含这种载体基底的生物传感器.这些载体基底和生物传感器在芬兰的专利申请20011877中一般性地公开,其被引入本文作为参考.可用于本发明的载体基底包括幽门螺旋杆菌细菌或幽门螺旋杆菌抗原的特异抗体或这些抗体的抗原结合片段,所述抗体被连接到载体基底上.另外,载体基底还包含与所述抗体或抗体片段连接到相同载体基底上的生物分子拒斥单体/聚合物分子,以防止分析物和存在于生物样品中的不希望的污染物(生物)分子的非特异性结合.
具体而言,所述基底携带有幽门螺旋杆菌抗体或他们的抗原结合片段,所述幽门螺旋杆菌抗体或抗体片段通过其上存在的官能团直接固定在载体基底的固体表面上,以形成一层取向抗原结合位点(图1).抗体或抗体片段在基底表面自我装配,活性抗原结合位点暴露,与基底表面有亲合力的所述官能团结合到该表面上。
抗体或抗体片段中的游离的硫氢基充当官能团,并且可以通过金属原子和硫原子之间的共价键化学吸附在金属表面,如金、银、铜、铝和钯表面上,从而形成单层.抗体或抗体片段中可能存在的并且能够自我装配的其它基团包括硫醇、二硫化物和硫化物基团,其通过含硫官能团自发地化学吸附在金属表面上.如果必要并且期望,也可通过使抗体或抗体片段的一结构部分转换为官能团或通过使用包含官能团的连接分子,为抗体或抗体片段引入新的官能团.
可选择地,可使用已知的方法用于实现抗体的受控固定化,条件是符合特异性和灵敏度标准.这些方法尤其包括通过蛋白A或蛋白G选择性的结合[参见例如,Lekkala,J.和Sadowsky,J.,ChemicalSensor Technology 5(1994)199-213]、通过Fab′片段绞链区中的游离硫氢基共价结合[参见例如,Fischer,B.,等人,Langmuir9(1993)136-140]和通过生物素/(链霉)抗生物素蛋白化学反应而偶联到表面上的生物素化抗体[Morgan,H.和Taylor,D.M.,Biosens.Bioelectron.7(1992)405-410].优选通过幽门螺旋杆菌抗体或抗体片段中存在的官能团直接连接.
类似地,生物分子拒斥分子也可通过游离的硫氢基或其它含硫基团在表面上自我装配,并覆盖抗体或抗体片段之间的固体表面.本文使用的“生物分子拒斥分子”指连接到固体表面并在固定化抗体之间形成亲水层的分子,对于分析物和污染(生物)分子,生物分子拒斥分子的引力小于斥力。本发明的生物传感器中可使用的生物分子拒斥分子包括中性的亲水单体或聚合物,如聚丙烯酰胺、聚N,N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷)和聚(乙二醇).还可使用其它的聚合物,如聚邻苯二甲酸乙二酯(polyethylenephalate)、聚四氟乙烯、聚氨酯和类似的生物相容的聚合物.本发明中使用的优选的生物分子拒斥分子为聚丙烯酰胺和聚N,N-二甲基丙烯酰胺,特别优选N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺.
优选生物分子拒斥聚合物通过位于聚合物的一个末端的适当的官能团(末端锚定基团)如硫化物、二硫化物或硫醇共价结合到固体表面.典型地,生物分子拒斥聚合物在分子的另一末端包含OH基团,从而形成亲水层.优选生物分子拒斥分子层的厚度略低于固体表面上的抗体层的厚度.
本发明可使用的载体基底的固体表面为可诱导信号改变的类型,所述信号被发射到基底上与基底、固定化抗体或抗体片段和结合的分析物的组合互相作用,并且当随后检测时,信号变化指示基底上的物质质量增加(即,与基底表面上固定的生物分子选择性地结合的分析物分子的积聚).
使用的固体表面材料因所选择的分析方法的不同而不同,其为具有适当厚度和适当材料的薄层,可用于检测其表面上面增加的质量.因此,当使用表面等离子共振(SPR)测量法用于分析时,固体表面可为SPR相容材料的薄层,所述SPR相容材料如为金、银、铜、铝、钯、或其它适当的金属,优选金;当使用石英晶体微量天平(QCM)技术时,固体表面可为用金或其它适当的金属如上述金属之一,优选金覆盖的电极;或当分别使用基于表面声波(SAW)技术或电化学方法时,固体表面可为在SAW装置中或电极上的适当的金属涂层。
任选地,如果需要,可在反应混合物中引入如固体表面中使用的类似涂布的材料的隔离粒子,如胶体或纳米粒子,以放大检测信号(图2).
本发明中使用的抗体和抗体片段可以是任何能与幽门螺旋杆菌抗原结合的多克隆或单克隆抗体或抗体片段.也可使针对不同幽门螺旋杆菌菌株的抗体或抗体片段的混合物连接到载体基底上,以确定检测灵敏度和特异性.优选使用单特异性多克隆或单克隆抗体,最优选单克隆抗体,或其抗原结合片段.为保证正确的取向,优选抗体片段,即,(Fab′)2和Fab′片段,由于灵敏度增加,最优选Fab′片段.说明性的例子为市售的由得自芬兰Kauniainen,Medix Biochemica的克隆7101和7102生产的单克隆抗幽门螺旋杆菌抗体或其抗原结合片段。
优选地,使属于IgG类的抗体或抗体片段连接到载体基底上。然而,如果适用的话,也可使用属于IgM或IgA免疫球蛋白类的抗体或抗体片段.
用于必要时制备载体基底以及制备抗体片段的抗体或抗体片段的量在本领域技术人员的知识范围内.类似地,用于制备载体基底的生物分子拒斥分子的量可由本领域技术人员使用标准程序决定。抗体或其抗原结合片段和生物分子拒斥分子通常都过量使用,以保证载体基底的最佳性能。在这方面,参考以下所述的实施例1和芬兰的专利申请20011877,其被引入本文作为参考.在载体基底的制备中,可使抗体或抗体片段和生物分子拒斥分子同时或顺序地进行连接.可选择地,生物分子拒斥分子可连接到已经包含固定抗体的载体基底上.
可使用适当的溶液使包含所述抗体或抗体片段的层再生,如0.1MHCl-甘氨酸溶液(pH1-2),或0.1M磷酸盐缓冲剂(pH2-7).这为载体基底提供了另外的优点,即,基底可重复使用达10次,为使用者提供实质上的经济和便利的优点。
待分析的生物样品可以是任何的液体或可溶生物样品.因此生物样品可以是全血、血清、尿、唾液或其它粘液分泌物、泪液或粪便。如果期望,使用本发明的方法还可分析得自活组织检查样品的样品。样品可直接进行分析或使用常规技术作为浓缩物进行分析.
本发明的载体基底中特异抗体或抗体片段的正确取向和生物分子拒斥分子的使用使得可简单、迅速、非侵入地从生物样品检测幽门螺旋杆菌感染。另外,这些特点提供足够高的特异性和灵敏度,如果期望,除定性测量之外,进行幽门螺旋杆菌抗原的定量或半定量测量.这对幽门螺旋杆菌感染的药物治疗效率的随访特别有利,如果选择的治疗没有效果,通常可在早期改变相当繁重的和冗长的治疗方案.可以比用抗体测量法更早地显示总治愈。还可容易地检测新的或复发的感染.幽门螺旋杆菌抗原的定量测量也可提供感染持续时间和严重程度的信息,其有助于药物的选择.
在本发明的方法中,如上详述的,使得自患有或被怀疑患有幽门螺旋杆菌感染的患者的生物样品与生物传感器的载体基底(上面详细描述)接触,和检测由抗体-抗原-复合体的形成所产生的信号.本发明的载体基底和生物传感器适用于任何使用基于生物传感器的测量法的标准平台.然而,特别适合于本发明的方法的检测方法为表面等离子共振(SPR)、厚度剪切模式共振技术,如石英晶体微量天平(QXM)、表面声波(SAW装置)和电化学测量。特别优选表面等离子共振(SPR)。
本发明的检测试剂盒包含用于实施本发明方法的试剂.具体而言,该检测试剂盒包含生物感应器和测量所需试剂如标准液、对照液、洗涤液和稀释液,所述生物感应器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了固定化抗体或抗体片段之间的表面。
用以下非限制性实施例说明本发明.
实施例1
制备本发明的载体基底的通用工序
为制备载体基底,首先从特异单克隆抗幽门螺旋杆菌抗体制备Fab′片段,制备如下。首先,使用ImmunoPure F(ab′)2制备试剂盒(PIERCE,USA)从单克隆抗幽门螺旋杆菌抗体如单克隆抗螺旋杆菌抗体克隆7101和7102(Medix Biotechnica,Kauniainen,Finland)制备F(ab′)2片段.也可同样使用其它已知的市售试剂盒和方法。然后用二硫苏糖醇(DTT,Merck)在HEPES/EDTA缓冲剂中把F(ab′)2片段裂分成Fab′片段,所述HEPES/EDTA缓冲剂包含150mM NaCl、10mMHEPES、5mMEDTA,pH6.0,所述裂分如Ishikawa所描述[Ishikawa,E.,J.Immunoassay 4(1983)209-320]典型地在微量透析管中过夜进行.简要地,使0.2-0.5mg/ml浓度的F(ab′)2片段与HEPES/EDTA缓冲剂和6.25mM DTT溶液在微量透析管中混和.使透析管浸入250ml的氩气吹洗的HEPES/EDTA缓冲剂中,并且在氩气下在室温下透析过夜.使Fab′片段保持在氩气下并直接用于连接.
固体表面制备如下.首先用钛薄层涂布玻璃载玻片以增加对金的附着力,然后通过真空蒸发涂布金薄层.就在使用之前使载玻片在热的H2O2:NH4OH:H2O(1:1:5)溶液中清洗并且用水淋洗.通过折射率匹配油(index matching oil)使载玻片附于表面等离子共振装置(SPRDEVI,VTT,Tampere,Finland)的SPR棱镜上,把流通池装配到棱镜上,并且用包含10mM HEPES、150mM NaCl、pH6、在高纯水(18.2MΩcm;Milli-Q system,Millipore Co.,Bedford,USA)中制备的缓冲剂溶液淋洗流通池.
把在10mM HEPES/EDTA缓冲剂(pH6)中的70μg/ml浓度的Fab′片段(850μl)加入到流通池中.使Fab′片段与涂有金的表面相互作用,一般作用5分钟,然后用HEPES/EDTA缓冲剂淋洗所述表面5分钟。然后将缓冲剂改为0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH7.2,并且使1-1.5ml、浓度为0.15mg/ml的N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺在PBS缓冲剂中的溶液与所述表面相互作用5分钟.然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭所述表面.
实施例2
用SPR测量幽门螺旋杆菌抗原的通用工序
可使用以下通用SPR工序测量生物样品中的幽门螺旋杆菌抗原。用PBS(pH7.2)淋洗实施例1制备的载体基底的表面.首先测量阴性样品(空白).使用的阴性样品随待测量生物样品的不同而不同。因此,例如当测量粪便样品时,阴性样品为幽门螺旋杆菌呈阴性的粪便样品;当测量尿样时,阴性样品为得自没有幽门螺旋杆菌感染的受试者的尿样;当测量血清样品时,阴性样品为得自没有幽门螺旋杆菌感染的受试者的血清样品.然后,使载体基底的表面顺序地与标准液、阳性和阴性对照液和样品接触,用每种待测量溶液充满测量装置的流通池10分钟,并记录SPR信号.在测量之间用PBS(pH7.2)淋洗流通池5分钟.
实施例3
标准曲线的制备和测量重现性
用Rautelin和Kosunen[J.Clin.Microbiol.25(10)(1987)1944-1951]描述的甘氨酸-酸萃取工序从幽门螺旋杆菌菌株ATCC49503的细菌团中提取用作标准品的幽门螺旋杆菌抗原.用Bradford分析法[Bradford,Anal.Biochem.72(1976)248]测定蛋白质浓度。在0.1M PBS(pH7.2)稀释标准品到0.001、0.01、0.1、1、10、100和270μg/ml的浓度,并遵循实施例2中描述的通用工序测量.随后几天分别进行三次的测量以分析重现性.
结果如图3A中所示.图3A中所示的标准曲线表明应答与抗原浓度在半对数标度上是直接可比的.表1表示随后几天的三次标准曲线测量的标准偏差(图3B).得到了优异的重现性.
表1:使用标准品得到的SPR强度
幽门螺旋杆菌浓度[μg/ml] | 强度改变[mV] | SD[mV] |
0.001 | 0.004 | |
0.01 | 0.005 | 0.001 |
0.1 | 0.009 | 0.004 |
1 | 0.014 | 0.005 |
10 | 0.031 | 0.004 |
100 | 0.062 | 0.014 |
270 | 0.102 | 0.010 |
实施例4
尿和粪便样品中幽门螺旋杆菌抗原的检测
根据实施例2中描述的通用工序用SPR分析得自患有幽门螺旋杆菌感染(该感染通过活组织检查复核)的患者和得自未感染患者的尿和粪便样品.患者所患幽门螺旋杆菌感染已经从活组织检查样品用市售的快速尿素酶试验诊断出来并且由病理学者评价证实.
粪便样品制备如下。使0,1g的粪便悬浮在500μl的0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)中涡旋15秒。悬浮液以5000rpm离心5分钟,上清液用于测量。同样对尿样进行分析。
测量的两个粪便样品,样品BSF37和BSF48,来自于通过活组织检查复核的患有幽门螺旋杆菌感染的患者.第三个样品BSF51来自于幽门螺旋杆菌阴性患者.分别使用两个不同薄层进行测量。结果如图4中所示.对所述层的非特异性结合为0.0013±0.0006mV(n=3,比较两个不同的层).患者样品BSF48的响应为0.0136±0.0004mV,患者样品BSU37为0.0113mV,即分别为背景的十倍和八倍.阴性的患者样品BSF51给出0.00096mV的强度.结果表明本发明的方法能特异检测存在于粪便样品中的幽门螺旋杆菌抗原。
测量得自通过活组织检查复核的患有幽门螺旋杆菌感染的患者两个尿样,样品1和3。第三个样品,样品2,得自幽门螺旋杆菌呈阴性的患者.结果如图5中所示。对所述层的非特异性结合为0.0185±0.0050mV.患者的样品1的响应为0.117mV,患者的样品3的响应为0.044mV,即分别为背景的6.3倍和2.4倍.阴性患者样品2给出0.008mV的强度.结果清楚地表明本发明的方法能特异检测存在于尿样中的幽门螺旋杆菌抗原。
Claims (9)
1.幽门螺旋杆菌抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子在制备用于检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物的生物传感器中的应用,其中,
所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有所述抗体或抗体片段连同生物分子拒斥分子;并且
在生物分子拒斥分子与载体基底的固体表面连接的同时或之前,所述抗体或其抗原结合片段与载体基底的固体表面连接;
所述生物分子拒斥分子选自聚丙烯酰胺、聚N,N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)、聚邻苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯和聚氨酯.
2.权利要求1的应用,其特征在于生物分子拒斥分子选自聚丙烯酰胺和聚N,N-二甲基丙烯酰胺。
3.权利要求1的应用,其特征在于生物分子拒斥分子为N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺分子。
4.权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于载体基底表面的固体表面为表面等离子共振相容材料的薄层。
5.权利要求4的应用,其特征在于载体基底表面的固体表面为金、银、铜、铝、钯、或其它适当的金属的薄层。
6.权利要求4的应用,其特征在于载体基底表面的固体表面为金薄层.
7.权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于生物传感器是表面等离子共振生物传感器.
8.生物传感器在制备用于检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物的试剂盒中的应用,所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了固定化抗体或其抗原结合片段之间的表面,并且在生物分子拒斥分子与载体基底的固体表面连接的同时或之前,所述抗体或其抗原结合片段与载体基底的固体表面连接;所述生物分子拒斥分子选自聚丙烯酰胺、聚N,N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)、聚邻苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯和聚氨酯。
9.一种检测试剂盒,其用于检测生物样品中是否存在幽门螺旋杆菌抗原或由所述细菌产生的代谢物,该检测试剂盒的特征在于,
具有生物传感器,校准和质量控制所需的试剂,和辅助试剂如洗液和稀释缓冲剂,所述生物传感器包括载体基底,在该载体基底上直接连接有幽门螺旋杆菌特异抗体或其抗原结合片段连同生物分子拒斥分子,所述生物分子拒斥分子覆盖了固定化抗体或抗体片段之间的表面,并且在生物分子拒斥分子与载体基底的固体表面连接的同时或之前,所述抗体或其抗原结合片段与载体基底的固体表面连接;
所述生物分子拒斥分子选自聚丙烯酰胺、聚N,N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)、聚邻苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯和聚氨酯.
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Granted publication date: 20090422 Termination date: 20110924 |