CN111562363A - 肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,提供一种肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,由1)制备盒体,2)制备检测试纸,3)制备预制液袋,4)整体组装,四个步骤组成。2)检测试纸通过以下详细步骤进一步制备:贴膜、配置包被液、包被及干燥、组装。根据本发明所提供的制备方法所得的肝素结合蛋白检测试剂盒,具有各项优良的参数性能,具体表现在:检测限≤0.5ng/mL,准确度测定值与理论值的相对偏差在±5%以内,线性相关系数r大于0.995,重复性变异系数(CV)不大于5%,经4~30℃12个月长时间保存后,仍满足各项参数指标要求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肝素结合蛋白(heparin-bindingprotein,HBP)是中性粒细胞来源的颗粒蛋白,其结构包含222个氨基酸的单链蛋白,含有8个半胱氨酸残基,在第100、114或145位天冬氨酸残基上具有糖基化位点,结构类似于中性粒细胞弹性蛋白,与其同源性为45%。
HBP主要是由PMN受外界刺激所释放,所以正常人血中HBP含量很低,一般不超过10ng/ml。临床上,当有感染发生时,部分细菌侵入到血管内,菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中细粒细包释放HBP从而导致血中HBP含量升高。HBP在一般感染时能达到20-30ng/ml,ICU中严重感染会更高,可能超过100ng/ml。
基于此,HBP标志指标具有广泛的临床应用,包括但不限制于作为局部感染的诊断指标、辅助诊断尿道感染、对感染性休克发生的预测、对败血症中循环衰竭的预测等等。
HBP标志相比于PCT、CRP具有独特的临床优势,特别是灵敏度高、特异性强、阳性/阴性检出率高,感染早期即可检测出。
基于HBP的广泛应用场景,如何能够提供一种具有快速、准确、定量、使用方便等效果任一以上的肝素结合蛋白检测试剂盒,是相关医疗领域内非常迫切的临床需求。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题,本发明目的在于提供一种准确度高、线性好、使用方便的肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法。
本发明所采用的技术方案为:
本发明提供一种肝素结合蛋白检测试剂盒,其结构组成包括盒体以及位于盒体内的检测试纸和预制液袋,预制液袋内装载有提前预制好的含有兔抗人肝素结合蛋白抗体的溶液。
检测试纸由垫板、NC膜、玻璃纤维素膜和吸水垫组成。NC膜设置在垫板上。玻璃纤维素膜和吸水垫分别设置在NC膜的两端,玻璃纤维素膜和吸水垫之间的NC膜上设置有包被鼠抗人肝素结合蛋白抗体的检测线和包被羊抗兔抗体的质控线,检测线T线靠近玻璃纤维素膜设置,质控线C线靠近吸水垫设置。检测线T线盒之间的NC膜上还设置有微球垫,微球垫上包被有荧光标记的鸡抗兔二抗。
根据本发明的具体实施方式,本发明所提供的肝素结合蛋白检测试剂盒中,检测线和质控线上分别优选包被0.5μg/cm鼠抗人肝素结合蛋白抗体和1.0μg/cm羊抗兔抗体。玻璃纤维素膜上进一步优选搭设滤膜,以进行初步的血滤。盒体上优选开设观察窗和进样孔,进样孔的位置与玻璃纤维素膜相互对应,观察窗的位置与检测线和质控线对应。
本发明另一方面提供前述肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,主要包括步骤:1)制备盒体,2)制备检测试纸,3)制备预制液袋,4)整体组装。
其中检测试纸通过以下详细步骤进一步制备:
(1)贴膜:取NC膜和垫板分别裁剪,然后将NC膜粘贴在垫板上,并在NC膜的中部左侧设置检测线标记线,在NC膜的中部右侧设置质控线标记线。
(2)配置包被液:用磷酸盐缓冲液分别配制鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液、羊抗兔抗体包被液和荧光标记鸡抗兔二抗包被液。
(3)包被及干燥:将配制好的鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液包被在检测线标记线处形成检测线,将配制好的羊抗兔抗体包被液包被在检测线标记线处形成质控线,将配制好的荧光标记鸡抗兔二抗包被液包被在微球垫上,分别检干燥。
(4)组装:将干燥好的微球垫粘贴设置在检测线左侧的NC膜上,将玻璃纤维素膜粘贴在微球垫左侧的NC膜上,玻璃纤维素膜与微球垫相互搭接,再将吸水垫粘贴在质控线右侧的NC膜上,最后将可选的滤膜粘贴设置在玻璃纤维素膜上即组装完成形成检测试纸。
根据本发明所提供的制备方法制备所得的肝素结合蛋白检测试剂盒,具有各项优良的参数性能,具体表现在:检测限≤0.5ng/mL,准确度测定值与理论值的相对偏差在±5%以内,线性相关系数r大于0.995,重复性变异系数(CV)不大于5%,经4~30℃12个月长时间保存后,仍满足各项参数指标要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例
本实施例首先提供一种肝素结合蛋白检测试剂盒,其结构组成包括盒体以及位于盒体内的检测试纸和预制液袋,预制液袋内装载有提前预制好的含有兔抗人肝素结合蛋白抗体的溶液。
检测试纸由垫板、NC膜、玻璃纤维素膜和吸水垫组成。NC膜设置在垫板上。玻璃纤维素膜和吸水垫分别设置在NC膜的两端,玻璃纤维素膜和吸水垫之间的NC膜上设置有包被鼠抗人肝素结合蛋白抗体的检测线和包被羊抗兔抗体的质控线,检测线T线靠近玻璃纤维素膜设置,质控线C线靠近吸水垫设置。检测线T线盒之间的NC膜上还设置有微球垫,微球垫上包被有荧光标记的鸡抗兔二抗。
可进一步改进增加的限制是检测线和质控线上分别包被0.5μg/cm鼠抗人肝素结合蛋白抗体和1.0μg/cm羊抗兔抗体。
可进一步改进增加的限制是在玻璃纤维素膜上进一步搭设滤膜。
可进一步改进增加的限制是可在盒体上开设观察窗和进样孔,进样孔的位置与玻璃纤维素膜相互对应,观察窗的位置与检测线和质控线对应。
本实施例所提供的肝素结合蛋白检测试剂盒可通过如下方法制备:
1.盒体的制备
盒体通体材质宜选择为有一定坚硬度的医用材料,比如医用塑料PVC,其可由预制铸模成型或拉伸成型或由多块PVC板拼接而成。
盒体内部应设置有固定检测试纸的机构,以保证在其上开设的观察窗和进样孔能够分别与检测试纸上的检测区域和玻璃纤维素膜分别对应,检测区域即为检测试纸上包含检测线和质控线的区域。
一般可在盒体的内部相对的两个侧壁上设置容纳固定检测试纸两端的固定槽,以达到所需效果。盒体应尽量为不透明的,遮光的,以利于荧光检测信息的顺利读取。
盒体内也可以设置单独容纳预制液袋的隔离空腔,预制液袋应当是能够从盒体内取出以方便使用的,例如可以在隔离空腔的盒体侧壁上开设取物孔,并在取物孔上黏贴设置封膜,具体使用时,直接撕开封膜即可。
当然,预制液袋也可以是与盒体相互独立的,其也可以不设置在盒体内,此时,预制液袋与盒体适合使用一个更大的盒子或者袋子进行统一包装包裹。
2.检测试纸的制备
(1)贴膜:取NC膜和垫板分别裁剪,然后将NC膜粘贴在垫板上,并在NC膜的中部左侧设置检测线标记线,在NC膜的中部右侧设置质控线标记线。
(2)配置包被液:用磷酸盐缓冲液分别配制鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液、羊抗兔抗体包被液和荧光标记鸡抗兔二抗包被液。
(3)包被及干燥:将配制好的鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液包被在检测线标记线处形成检测线,将配制好的羊抗兔抗体包被液包被在检测线标记线处形成质控线,将配制好的荧光标记鸡抗兔二抗包被液包被在微球垫上,分别检干燥。
(4)组装:将干燥好的微球垫粘贴设置在检测线左侧的NC膜上,将玻璃纤维素膜粘贴在微球垫左侧的NC膜上,玻璃纤维素膜与微球垫相互搭接,再将吸水垫粘贴在质控线右侧的NC膜上,最后将可选的滤膜粘贴设置在玻璃纤维素膜上即组装完成形成检测试纸。
3.预制液袋的制备
取100μL 30mmol/L的磷酸盐缓冲液,加入100ng兔抗人肝素结合蛋白抗体,混合均匀得到预制液,将预制液装载入医用袋封装得到预制液袋。
4.整体组装:
将检测试纸置入盒体内,将检测试纸上检测线和质控线组成的检测区域对准盒体上的观察窗,将检测试纸上玻璃纤维素垫对准盒体上的进样口后,固定检测试纸。
将装入检测试纸的盒体与预制液袋进一步组合后形成所述的肝素结合蛋白检测试剂盒。肝素结合蛋白检测试剂盒。还可进一步随附包含通过肝素结合蛋白标准品配置的标准浓度测定的荧光值对照曲线。
盒体和与预制液袋的组合方式可以是将预制液袋置入盒体的单独隔离空间,也可以是将盒体和与预制液袋共同装载在一个更大的盒子或者袋子进行统一包装包裹。
本实施例提供的肝素结合蛋白检测试剂盒的使用方法如下:
1.标准品回归曲线校正:
可选步骤,具体使用中,除了将测试结果直接与所附的标准浓度/荧光值对照曲线进行比对得到所测样品肝素结合蛋白浓度之外。还可以进一步提前重新进行标准浓度/荧光值对照曲线的测定和校正。
具体而言,取不同浓度的肝素结合蛋白标准溶液分别加入预制液袋的预制液中,混合均匀后,分别滴入检测试纸的滤膜上,放置5~10分钟后,将包含检测试纸的盒体放入荧光免疫读数仪,读取不同浓度肝素结合蛋白标准溶液的荧光值,每个浓度的肝素结合蛋白标准溶液检测3次以上,并计算每个浓度的肝素结合蛋白标准溶液对应的荧光值的平均值;以每种荧光值的平均值和肝素结合蛋白标准溶液的浓度值分别为横纵坐标,得到校正后的回归曲线。也可据此进一步分析出回归方程以利于后续检测时的计算方便。
2.样品检测:
(1)样品前处理:
针对不同样品,分别通过不同方法对待测样品进行前处理:
血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2.5~3小时或5℃以下过夜。然后离心20分钟,取上清进行后续检测。
血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集样品,并将样品在采集后的40min内于5℃离心20分钟,取上清进行后续检测。
组织匀浆:取PBS(0.01M,pH=7.4)预先降温5℃以下,然后冲洗组织,去除残留血液,称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与8倍重量体积比的PBS加入玻璃匀浆器中,2~4℃充分研磨裂解组织细胞。超声后匀浆,将匀浆液于离心5~10分钟,取上清进行后续检测。
细胞培养物上清或其它生物标本:离心30分钟,取上清即可进行后续检测。
(2)检测:
取经过前处理后的待测样品加入预制液袋的预制液中,混合均匀后,滴入检测试纸的滤膜上,放置5~10分钟后,将包含检测试纸的盒体放入荧光免疫读数仪,读取检测线荧光值,然后将读取的荧光值与所附的对照曲线或者校正所得的回归曲线对应,计算出待测样品的肝素结合蛋白浓度。
取前述实施例所获得的肝素结合蛋白检测试剂盒,采用行业通用方式进行效果测试,相关参数测试情况如下:
1.检测限
取不同浓度梯度的肝素结合蛋白低浓度值样本进行检测,每份样本检测5次,对检测结果按照大小进行排序,符合如下条件,即可得到空白限和检出限的范围:低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。HBP检测限检测结果≤0.5ng/mL。
2.准确度
根据线性区间,在检测范围0.25ng/mL–8ng/mL内,用HBP抗原配制成已知5个浓度标准品作为样本进行检测,每个样品重复测定5次,将测定值与理论计算值相互比较。测定值与理论值的相对偏差在±5%以内。
3.线性
用HBP抗原配制成5个不同浓度标准品作为样本进行检测。对每一个浓度的样本至少重复测定5次,计算其平均值,将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性方程拟合,得到线性回归方程,计算的线性相关系数r大于0.995。
4.重复性
随机抽取同一批次20个试剂盒,用HBP抗原配制已知浓度标准品作为样本进行检测,用线性范围内的样本重复检测10次,所得结果的变异系数(CV)不大于5%。
5.稳定性
4~30℃保存12个月后,进行试剂检测限、准确度、线性和重复性测试,依然满足前述各参数情形。
6.液体移行速度
随机取本发明的肝素结合蛋白检测试剂盒,取样品经过处理后滴入盒体的进样口,当观察窗内出现液体时开始计时,当液体移出观察窗后停止计时,用游标卡尺测量观察窗的长度,以长度除以用时时间即为移行速度。随机选取待测样品和随机选取肝素结合蛋白检测试剂盒进行10次测量后平均值为15.3mm/min。
本发明不局限于上述可选的实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制,本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准,并且说明书可以用于解释权利要求书。
Claims (10)
1.一种肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于,由以下步骤组成:1)制备盒体,2)制备检测试纸,3)制备预制液袋,4)整体组装;
其中2)检测试纸通过以下详细步骤进一步制备:
(1)贴膜:取NC膜和垫板分别裁剪,然后将NC膜粘贴在垫板上,并在NC膜的中部左侧设置检测线标记线,在NC膜的中部右侧设置质控线标记线。
(2)配置包被液:用磷酸盐缓冲液分别配制鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液、羊抗兔抗体包被液和荧光标记鸡抗兔二抗包被液;
(3)包被及干燥:将配制好的鼠抗人肝素结合蛋白抗体包被液包被在检测线标记线处形成检测线,将配制好的羊抗兔抗体包被液包被在质控线标记线处形成质控线,将配制好的荧光标记鸡抗兔二抗包被液包被在微球垫上,分别检干燥;
(4)组装:将干燥好的微球垫粘贴设置在检测线左侧的NC膜上,将玻璃纤维素膜粘贴在微球垫左侧的NC膜上,玻璃纤维素膜与微球垫相互搭接,再将吸水垫粘贴在质控线右侧的NC膜上,最后将可选的滤膜粘贴设置在玻璃纤维素膜上即组装完成形成检测试纸。
2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于:检测线和质控线上分别包被0.5μg/cm鼠抗人肝素结合蛋白抗体和1.0μg/cm羊抗兔抗体。
3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在玻璃纤维素膜上进一步搭设滤膜。
4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于,其中3)预制液袋通过以下详细步骤进一步制备:取100μL30mmol/L的磷酸盐缓冲液,加入100ng兔抗人肝素结合蛋白抗体,混合均匀得到预制液,将预制液装载入医用袋封装得到预制液袋。
5.一种肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:通过权利要求1~4任一所述制备方法制备获得。
6.根据权利要求5所述的肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:所述盒体通体材质为医用塑料PVC,其可由预制铸模成型或拉伸成型或由多块PVC板拼接而成。
7.根据权利要求5所述的肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:盒体上开设有观察窗和进样孔,观察窗与检测试纸上的检测区域对应,检测区域为检测试纸上包含检测线和质控线的区域,进样孔与玻璃纤维素膜对应。
8.根据权利要求5所述的肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:盒体内部应设置有固定检测试纸的机构,以保证在其上开设的观察窗和进样孔能够分别与检测试纸上的检测区域和玻璃纤维素膜分别稳定的一一对应,固定检测试纸的机构为在盒体的内部相对的两个侧壁上设置容纳固定检测试纸两端的固定槽。
9.根据权利要求5所述的肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:盒体内单独设置容纳预制液袋的隔离空腔,在隔离空腔的盒体侧壁上开设取物孔,并在取物孔上黏贴设置封膜。
10.根据权利要求5所述的肝素结合蛋白检测试剂盒,其特征在于:所述肝素结合蛋白检测试剂盒,检测限≤0.5ng/mL,准确度测定值与理论值的相对偏差在±5%以内,线性相关系数r大于0.995,重复性变异系数(CV)不大于5%,4~30℃下保质期大于12个月。
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