CN112858696B - 肝素结合蛋白测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其包括第一试剂、第二试剂和试纸条。本发明肝素结合蛋白测定试剂盒可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肝素结合蛋白测定试剂盒特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。

Description

肝素结合蛋白测定试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及肝素结合蛋白测定试剂盒，特别是涉及一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒及其应用。

背景技术

肝素结合蛋白(heparin-bindingprotein,HBP)也被称为azurocidin或者CAP37，是中性粒细胞来源的颗粒蛋白，HBP的趋化活性、杀菌能力以及肝素结合能力都与其自身带有较强的正电荷有关，HBP作为一种趋化物质，可以激活单核细胞和巨噬细胞，诱发血管渗漏和组织水肿，体外能诱导Ca2+依赖的细胞骨架重排以及单层内皮细胞间隙的形成。HBP能增加血管内皮细胞通透性是因为HBP带有较强的正电荷，与内皮细胞接触导致内皮细胞胞内Ca2+快速激活，形成肌动蛋白张力纤维，从而导致细胞旁通路渗漏。HBP的浓度过高会导致严重的血管渗漏，从而引起低血压甚至休克，除此之外，HBP还与软组织感染等多种感染有关，这表明HBP与严重的细菌感染有紧密的关系，极有可能成为临床诊断指标和药物治疗靶标。

目前，临床上将HBP≥15ng/mL作为严重败血症的指标。HBP具有出现早、灵敏度高、特异性强、阳性/阴性检出率高等优点。HBP只在急性细菌感染时浓度升高，在病毒感染和非特异性炎症时保持较低水平。传统炎症指标，如降钙素原、C反应蛋白、中性粒细胞、白细胞、乳酸等的影响因素较多，尤其是老年人常伴有免疫功能反应低下，这些传统炎症指标的升高水平不一定能精确反映病情的严重程度。

检测肝素结合蛋白(HBP)的代表产品是英国Axis-Shield公司的酶联免疫分析试剂盒(国械注进20162400300)。酶联免疫分析法是在96孔板上包覆捕捉抗体，当含有抗原的样品在孔中培养时，包覆在孔内的抗体通过抗体抗原反应捕捉样品中的抗原，然后用酶标记的检测抗体与抗原结合，形成抗体-抗原-抗体的三明治结构。标记好的的酶可以与相应的底物定量地发生反应，产生颜色变化。通过测量特定波长下的吸光度变化，可以定量检出样品中的抗原浓度。酶联免疫分析法可以准确地检测样品中的肝素结合蛋白浓度，但是实际操作中酶联免疫分析(ELISA)实验耗时比较长，一般需要4至5小时才能得到检测结果，作为预测脓毒症及炎症反应的重要指标，不能够很好地满足门诊或者急诊的快速检测的需求。同时96孔板只能是每8孔进行拆卸，不能够做到单人份测试，且检测范围只能覆盖5.9-200.0ng/mL，由于临床上报道的HBP值高于检测范围上限的例子较多，该试剂盒的使用上存在局限性。其他报道的检测方法还有CN204882574U公开的胶体金法和CN204882575U公开的免疫荧光层析的方法。胶体金法和免疫荧光层析法虽然可以快速检测，但是只能进行定性或者半定量的检测，准确度低，无法提供精确的临床判断依据。同时受限于方法本身，由于使用的是非均相反应体系，检测的精密度差，且无法从操作程序上清除干扰物，使得测试的准确性不能得到保障。

发明内容

基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于一种肝素结合蛋白测定试剂盒。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及肝素结合蛋白测定试剂盒，包括第一试剂、第二试剂和试纸条，其特征在于：

其中第一试剂为含有兔抗人肝素结合蛋白抗体和海藻酸钠的磷酸盐缓冲液；

所述第二试剂为含有异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗以及萘酚的磷酸盐缓冲液；

试纸条包括塑料垫板，塑料垫板上设置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜分别设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素膜上设置玻璃纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤血膜；所述检测线上包被来源于小鼠的肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体；所述质控线上包被羊抗鼠IgG多克隆抗。

在本发明的一个优选实施方式中，所述萘酚为α萘酚和/或β萘酚。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第一试剂的pH为7.0-7.4。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第二试剂的pH为7.0-7.4。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第一试剂为含有1-2ng/μl兔抗人肝素结合蛋白抗体和40-60μg/mL海藻酸钠的磷酸盐缓冲液。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第二试剂为含有0.1-0.15μg/μl异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗和80-120μg/mL萘酚的磷酸盐缓冲液。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述检测线上包被0.4-0.6μg/cm来源于小鼠的肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述质控线上包被0.8-1.2μg/cm羊抗鼠IgG多克隆抗。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒在37℃下保存1个月之后对标准样品的测定值与理论值的偏差不超过±15％。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备定量测定肝素结合蛋白试剂中的应用。

有益效果

本发明肝素结合蛋白测定试剂盒可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肝素结合蛋白测定试剂盒特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。虽然本发明能够提高试剂盒性能的机理尚不清楚，但推测是由于海藻酸钠有助于保护兔抗人肝素结合蛋白抗体而苯酚有助于保护异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

一种肝素结合蛋白测定试剂盒，包括第一试剂、第二试剂和试纸条；其中第一试剂为含有1.5ng/μl兔抗人肝素结合蛋白抗体和50μg/mL海藻酸钠的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2；所述第二试剂为含有0.12μg/μl异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗和100μg/mLα萘酚的磷酸盐缓冲液，pH为7.2。

试纸条包括塑料垫板，塑料垫板上设置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜分别设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素膜上设置玻璃纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤血膜。所述检测线上包被0.5μg/cm来源于小鼠的肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体；所述质控线上包被1.0μg/cm羊抗鼠IgG多克隆抗。

本实施例试剂盒储存在4～8℃环境下。

比较例1

与实施例1相同，其区别在于制备第一试剂时不加入海藻酸钠。

比较例2：

与实施例1相同，其区别在于制备第二试剂时不加入α萘酚。

测试实施例

将实施例1和比较例1～2试剂盒用于标准样品的检测，以确定试剂盒的存储稳定性，具体操作步骤为：

(1)肝素结合蛋白标准品预处理：取1μg肝素结合蛋白标准品加入1ml的无肝素结合蛋白的正常人血清中，制成1μg/ml的母液；用无肝素结合蛋白的血清将该母液分别稀释成200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1μg/L、0.5μg/L的肝素结合蛋白标准溶液；

(2)取第一试剂，室温下静置平衡10～15分钟后，取步骤Ⅰ制备的不同浓度的肝素结合蛋白标准溶液各100μl分别加入到60μl平衡后的第一试剂中，然后再分别加入10μl第二试剂，混合均匀后分别加入到试纸条上的滤血膜，室温水平放置15min后，将试剂卡插入荧光免疫读数仪，设定激发光波长为494nm，发射光波长为518nm，读取不同浓度肝素结合蛋白标准溶液的荧光值，每个浓度的肝素结合蛋白标准溶液检测五次，并计算荧光值的平均值；以每种荧光值的平均值为纵坐标，分别对应的肝素结合蛋白标准溶液的浓度值为横坐标做回归曲线，得出回归曲线方程，得到荧光值与肝素结合蛋白浓度关系式。

采用行业通用的方式对上述试剂盒进行性能评价，结果如下：

(1)、最低检测限

检测方法：取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合如下条件，即可得到空白限和检出限的范围；低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。

检测结果：HBP的最低检测限≤6μg/L。

(2)、准确度

检测方法：根据线性区间，用HBP抗原配置制成已知3个浓度企业参考品作为样本进行检测，每个样本重复测定10次，计算10次检测结果的均值以及相对偏差。

检测结果：用HBP抗原配置成已知浓度作为样本进行检测，测定值与理论值的相对偏差不超过±15％。

(3)、线性

HBP在[6，200]μg/L线性区间内，拟合曲线的线性相关系数(r)应不小于0.9900。

(4)、精密度

HBP：平行检测100μg/L的参考品10次，检测结果的变异系数应不大于15％。

(5)、稳定性

将试剂盒在37℃保存以进行加速试验，要求其至少稳定保存30天(即试剂盒加速试验之后对标准样品的测定值与理论值的偏差不超过±15％)。

表1为实施例和比较例的评估结果对比，测定结果表面本发明的实施例和比较例的相关系数≥0.99；但本发明实施例在检测限、准确度、精密度以及稳定性方面具有更为显著的优势。

表1：实施例和比较例的试剂盒评估结果对比

试剂盒	检测限(μg/L)	准确度	线性相关系数	精密度	稳定性
						实施例1	1	±3.7％	0.9996	±4.1％	±5.1％
比较例1	2.5	±5.4％	0.9982	±12.3％	±23.2％
						比较例2	5	±7.8％	0.9977	±10.6％	±31.3％

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (8)

1.一种肝素结合蛋白测定试剂盒，包括第一试剂、第二试剂和试纸条，其特征在于：

其中第一试剂为含有兔抗人肝素结合蛋白抗体和海藻酸钠的磷酸盐缓冲液；

所述第二试剂为含有异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗以及萘酚的磷酸盐缓冲液；

试纸条包括塑料垫板，塑料垫板上设置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜分别设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素膜上设置玻璃纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤血膜；所述检测线上包被来源于小鼠的肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体；所述质控线上包被羊抗鼠IgG多克隆抗；

所述第一试剂为含有1-2ng/μl兔抗人肝素结合蛋白抗体和40-60μg/mL海藻酸钠的磷酸盐缓冲液；

所述第二试剂为含有0.1-0.15μg/μl异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗和80-120μg/mL萘酚的磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述萘酚为α萘酚和/或β萘酚。

3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述第一试剂的pH为7.0-7.4。

4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述第二试剂的pH为7.0-7.4。

5.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述检测线上包被0.4-0.6μg/cm来源于小鼠的肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述质控线上包被0.8-1.2μg/cm羊抗鼠IgG多克隆抗。

7.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述试剂盒在37℃下保存1个月之后对标准样品的测定值与理论值的偏差不超过±15％。

8.权利要求1-7任意一项所述试剂盒在制备定量测定肝素结合蛋白试剂中的应用。