CN103529225A - 一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法，属于肝型脂肪酸结合蛋白含量的检测技术领域。试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：缓冲液、防腐剂、表面活性剂和水；所述的试剂Ⅱ的组分包括：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、缓冲液、助悬剂、防腐剂、表面活性剂和水。采用本发明的技术制备的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒具有操作简单、定量准确、灵敏度高、特异性好、检测范围广等诸多优良的特性，适合于肝型脂肪酸结合蛋白临床检测的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于肝型脂肪酸结合蛋白含量的检测技术领域，特别涉及一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肝型脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid binding protein，L-FABP）是脂肪酸结合蛋白家族的成员，它是在肝脏中表达的脂肪酸结合蛋白，主要介导脂质的吸收和转运，并在调节脂肪酸氧化、减少细胞氧化应激和影响细胞生长等方面发挥重要作用。近年来发现L-FABP是有肝、肾损伤的标志分子，并与脂肪肝、肥胖的发生发展关系密切。随着研究的深入，对L-FABP的生理功能、基因调控以及与疾病的关系有了更清楚的认识，对有关疾病的诊治有了更大的帮助。
肝型脂肪酸结合蛋白与多种疾病的发生发展有着一定的联系。它可以作为肾病和肝损伤的标志分子，分子量仅为14.4KD的肝型脂肪酸结合蛋白在人肾脏近端小管也有表达，多种病理生理应激作用于近端小管都能诱导L-FABP的表达，导致尿液中L-FABP含量增多，因此成为慢性肾病标志分子。由于L-FABP在肝细胞高表达，可能成为肝损伤的标志分子，肝移植患者发生排斥反应的当天，血清L-FABP水平明显升高，并且早于急性排斥反应。后来进一步研究，L-FABP对评估肝缺血损伤程度以及评估肝切除术中导致肝损害的关键因素等，都具有较高的敏感性和特异性。
有文献报道：尿L-FABP水平诊断急性肾损伤敏感度为74.5%，特异性为77.6%；预测需要透析，敏感度69.1%，特异性42.7%；预测死亡率，敏感度93.2%，特异性78.8%。
鉴于L-FABP的检测可以作为肾损伤的诊断标志物，开发该指标的检测试剂盒有利于该指标检测的临床应用。目前，关于L-FABP的专利技术多集中于该物质作为疾病诊断标志物的应用及研究方面。在检测产品方面，现有的L-FABP诊断试剂产品多采用的是酶联免疫分析技术。酶联免疫分析技术具有检测精确度高、灵敏度好等诸多优良的特性，但该检测方法操作繁琐、检测耗时长，不利于样本的及时检测，同时该检测方法只能批量检测样本，不能实现样本的随到随测，此外，酶联免疫检测方法具有自动化程度低，受人工操作影响较大等方面的不利因素，使得其在未来的检测技术中必然处于被替代的技术。由于L-FABP有着良好的诊断意义，开发一种新型、高效便捷的检测方法及检测产品将为该指标的临床应用提供良好的前提条件。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简单和线性范围宽的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，所述试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：缓冲液、防腐剂、表面活性剂和水；所述的试剂Ⅱ的组分包括：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、缓冲液、助悬剂、防腐剂、表面活性剂和水。
优选地，所述包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为180～220nm，所述肝型脂肪酸结合蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
试剂Ⅱ中胶乳微球颗粒的粒径的选择对试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测结果的准确性等有着非常显著的影响，当本发明选用的胶乳颗粒的粒径为180～220nm时，制备出的检测试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测线性范围等特性要明显优于其它粒径的胶乳颗粒，尤其是当胶乳颗粒的粒径为200nm时，制备的检测试剂盒其各项性能最好。
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳微球颗粒，其肝型脂肪酸结合蛋白抗体包被胶乳颗粒可以采用物理吸附法和化学交联法制备，物理吸附法是利用分子之间的作用力将抗体吸附到胶乳颗粒的表面，化学交联法是通过化学键将抗体与胶乳微球颗粒表面的基团相结合。本发明采用化学交联法制备的胶乳颗粒，其配制的试剂盒性能更稳定，产品的货架期、开瓶稳定性以及热稳定性明显优于物理法制备的检测试剂盒。本发明中肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体采用化学交联法包被胶乳颗粒，其中肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体能很好的识别样品中的肝型脂肪酸结合蛋白抗原，从而能很好的提高检测试剂盒的特异性。
进一步地，所述化学交联法制备包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒包括以下步骤：
（1）取0.2～1.0mL胶乳微球颗粒于离心管中，加入4.0～4.8mL磷酸缓冲液，混匀后离心得胶乳微球颗粒，后用3～10mL磷酸盐缓冲液重悬胶乳微球颗粒，向重悬的胶乳微球颗粒溶液中加入浓度为0.02mol/L的6-氨基己酸溶液0.5～2mL，再加入1～3mgEDC粉末，搅拌反应20～60min，离心去上清，并用3～10mL磷酸盐缓冲液重悬胶乳颗粒，既得羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒。聚苯乙烯胶乳微球颗粒的羧化改性是将氨基己酸基团连接到胶乳微球颗粒表面。
（2）取50～200ug肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体冻干品，用0.05～0.5mL去离子水溶解，后取50～300uL抗体溶液用5mL磷酸盐缓冲液稀释，并将稀释后的溶液加入羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液中，再加入1～5mg的EDC，在4℃搅拌反应6～10小时，加入0.2mL甘氨酸溶液终止反应，离心去上清，并用1mL pH7.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中分散，既得包被抗体的胶乳微球颗粒溶液。肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合，是肝型脂肪酸结合蛋白抗体通过氨基己酸键与胶乳微球颗粒连接。
优选地，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液以及2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中的一种或任意两种的混合；所述防腐剂为叠氮化钠、Proclin300、硫柳汞、苯酚以及乙基汞硫代硫酸钠中的一种或任意几种的混合；所述表面活性剂为吐温20、吐温40、司盘40以及司盘60中的一种或任意几种的混合；所述助悬剂为乙二醇、丙三醇、海藻酸钠、乳糖以及麦芽糖中的一种或任意几种的混合。
本发明所述的缓冲剂能够使反应体系维持一定的pH值，各种能使反应体系维持一定pH值的物质均能作为本发明的缓冲剂，可选自三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液和2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中的一种或任意两种混合。
本发明所述的防腐剂是为了防止细菌滋生，避免细菌滋生导致的产品变质从而对检测结果造成的不良影响。各种能阻止细菌繁殖的物质均能用作本发明检测试剂盒的防腐剂组分，本发明检测试剂盒中所用的防腐剂选自叠氮化钠、Proclin300、硫柳汞、苯酚和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或任意几种混合。
本发明试剂盒中的表面活性剂有利于反应试剂盒的各种组分均匀分散，有利于维持试剂盒各组分储存过程中的稳定性，同时表面活性剂有利于检测样本均匀分散于反应体系中，使反应体系处于均一状态，可减少样本浊度对测定结果的不良影响。凡是具有增溶性及表面活性的物质均可作为本发明检测试剂盒中的表面活性剂组分，本发明检测试剂盒中的表面活性剂选自吐温20、吐温40、司盘40或司盘60中的一种或任意几种的混合。
本发明试剂盒试剂Ⅱ中的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持良好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉对检测试剂盒的稳定性及检测结果的可靠性带来不良影响，各种能增加反应体系黏度的物质均能作为本发明的助悬剂，本发明中所述的助悬剂选自乙二醇、丙三醇、海藻酸钠、乳糖和麦芽糖中的一种或任意两种的混合。
优选地，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：缓冲剂5～80g，防腐剂0.1～10g，表面活性剂0.1～5mL，余量为水。
更优选地，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：缓冲剂15～30g，防腐剂1～5g，表面活性剂1～3mL，余量为水。
优选地，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳微球颗粒0.5～3.5g，缓冲剂5～80g，助悬剂5～50g，防腐剂0.1～10g，表面活性剂0.1～5mL，余量为水。
更优选地，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳微球颗粒0.8～3g，缓冲剂10～30g，助悬剂10～30g，防腐剂1～5g，表面活性剂1～3mL，余量为水。
优选地，所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的的pH值范围为6.0～9.0。
一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，调整pH值，定容得到试剂Ⅰ；
（2）制备试剂Ⅱ：通过化学交联法制备包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体包被的胶乳微球颗粒，将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液，将混合溶液于胶乳颗粒混匀，调整pH值，定容得到试剂Ⅱ。
本发明具有以下优点：
本发明检测试剂盒采用粒径为180～220nm的胶乳微球颗粒制备检测试剂盒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及良好的检测线性范围；肝型脂肪酸结合蛋白抗体包被胶乳微球颗粒采用特定的化学交联法能保证检测试剂盒中包被抗体的胶乳微球颗粒的稳定性，既而保证了检测试剂盒品质的稳定性；本发明检测试剂盒中采用的肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体能特异性识别样本中的肝型脂肪酸结合蛋白，保证了检测试剂盒的特异性，从而保证了检测结果的准确性；另外，本发明通过优选组分和优化各种组分的含量，使采用本专利技术制备出来的检测试剂盒在各方面的性能均处于最佳状态，使其能更好的满足检测的需要，本发明试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。
附图说明
图1为实施例1-5制备的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒标准工作曲线图；
图2为本发明实施例1与对比实施例1-5制备的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒标准工作曲线的比对图；
图3为实施例1制备出的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒与R&D公司的酶联免疫试剂盒测定尿液样本中肝型脂肪酸结合蛋白的含量的结果比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备
取0.5mL粒径为200nm的10%浓度的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，向离心管中加入4.5mL0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒；向胶乳微球颗粒溶液中加入1.0mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入2mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌反应30分钟，离心并倾去上清液，制成接有氨基乙酸基团的羧化聚苯乙烯胶乳微球颗粒，并用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒，得到羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液。
（2）肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合
将100ug兔抗人肝型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自FitzgeraldIndustries International）冻干品，加入0.2mL去离子水溶解，取100uL溶液，用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液稀释后，加入（1）步所得的胶乳微球颗粒溶液中，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应7小时，加入0.2mL0.1mol/L的甘氨酸缓冲液（pH8.0）搅拌反应30min后终止反应，离心弃去上清，用20mL pH7.0的MES缓冲液洗涤1次，后用1mL pH7.0的MES缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为50g/L。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
2-（N-吗啡啉）乙磺酸 20g
叠氮化钠 3g
吐温20 2mL
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于800mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入40份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例2
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备
取0.5mL粒径为200nm的10%浓度的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，向离心管中加入4.5mL0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒；向胶乳微球颗粒溶液中加入1.0mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入2mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌反应30分钟，离心并倾去上清液，制成接有氨基乙酸基团的羧化聚苯乙烯胶乳微球颗粒，并用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒，得到羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液。
（2）肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合
将100ug兔抗人肝型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自FitzgeraldIndustries International）冻干品，加入0.2mL去离子水溶解，取100uL溶液，用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液稀释后，加入（1）步所得的胶乳微球颗粒溶液中，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应7小时，加入0.2mL0.1mol/L的甘氨酸缓冲液（pH8.0）搅拌反应30min后终止反应，离心弃去上清，用20mL pH7.0的MES缓冲液洗涤1次，后用1mL pH7.0的MES缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为50g/L。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
2-（N-吗啡啉）乙磺酸 30g
叠氮化钠 5g
吐温20 3mL
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于800mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入30份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例3
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备
取0.4mL粒径为220nm的10%浓度的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，向离心管中加入4.6mL0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒；向胶乳微球颗粒溶液中加入0.8mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入1.8mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌反应40分钟，离心并倾去上清液，制成接有氨基乙酸基团的羧化聚苯乙烯胶乳微球颗粒，并用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒，得到羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液。
（2）肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合
将100ug鼠抗人肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（购自R&D Systems,Inc.）冻干品，加入0.2mL去离子水溶解，取120uL溶液，用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液稀释后，加入（1）步所得的胶乳微球颗粒溶液中，再加入2.5mg EDC，在4℃搅拌反应8小时，加入0.2mL0.1mol/L的甘氨酸缓冲液（pH8.0）搅拌反应30min后终止反应，离心弃去上清，用20mL pH7.0的MES缓冲液洗涤1次，后用1mL pH7.0的MES缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为40g/L。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
2-（N-吗啡啉）乙磺酸 15g
叠氮化钠 5g
吐温20 2.8mL
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于800mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入42份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例4
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备
取0.5mL粒径为190nm的10%浓度的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，向离心管中加入4.5mL0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒；向胶乳微球颗粒溶液中加入1.0mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入2mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌反应30分钟，离心并倾去上清液，制成接有氨基乙酸基团的羧化聚苯乙烯胶乳微球颗粒，并用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒，得到羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液。
（2）肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合
将100ug兔抗人肝型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自FitzgeraldIndustries International）冻干品，加入0.2mL去离子水溶解，取100uL溶液，用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液稀释后，加入（1）步所得的胶乳微球颗粒溶液中，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应7小时，加入0.2mL0.1mol/L的甘氨酸缓冲液（pH8.0）搅拌反应30min后终止反应，离心弃去上清，用20mL pH7.0的MES缓冲液洗涤1次，后用1mL pH7.0的MES缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为50g/L。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
2-（N-吗啡啉）乙磺酸 35g
叠氮化钠 6g
吐温20 4mL
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.2，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于800mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入37份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.2，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例5
包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液的制备：
（1）羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备
取0.4mL粒径为210nm的10%浓度的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，向离心管中加入4.6mL0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒；向胶乳微球颗粒溶液中加入0.8mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入1.8mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌反应40分钟，离心并倾去上清液，制成接有氨基乙酸基团的羧化聚苯乙烯胶乳微球颗粒，并用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒，得到羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液。
（2）肝型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳微球颗粒的结合
将100ug鼠抗人肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（购自R&D Systems,Inc.）冻干品，加入0.2mL去离子水溶解，取120uL溶液，用5mL浓度为0.12mol/L pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液稀释后，加入（1）步所得的胶乳微球颗粒溶液中，再加入2.5mg EDC，在4℃搅拌反应8小时，加入0.2mL0.1mol/L的甘氨酸缓冲液（pH8.0）搅拌反应30min后终止反应，离心弃去上清，用20mL pH7.0的MES缓冲液洗涤1次，后用1mL pH7.0的MES缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为40g/L。
检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
2-（N-吗啡啉）乙磺酸 28g
叠氮化钠 2.5g
吐温20 2.5mL
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于800mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入39份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
对比实施例1肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳微球颗粒的粒径为170nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例2肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳微球颗粒的粒径为230nm外，其余均与实施例3完全相同。
对比实施例3肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳微球颗粒的粒径为160nm外，其余均与实施例4完全相同。
对比实施例4肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳微球颗粒的粒径为240nm外，其余均与实施例5完全相同。
试验例1试剂盒线性范围
配制浓度为0ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，160ng/mL的肝型脂肪酸结合蛋白标准品溶液，用本发明实施例1-5及对比实施例1-4所制备的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。
本发明检测试剂盒及对比实施例检测试剂盒检测样本的流程如下：向5uL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品，校准品购自美国Fitzgerald Industries公司）中加入120uL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40uL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
测定结果见图1和图2。从图1可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒具有良好的线性，另本发明采用最优化的条件制备出的试剂盒（实施例1），其标准工作曲线较其余优选条件制备出的试剂盒线性更优良；根据图2可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒的线性范围要明显的优于对比实施例1-5所制备的检测试剂盒。
试验例2试剂盒最低检测限
取本发明实施例1制备的检测试剂盒，以5%人血清白蛋白为空白样本，按照上述测定“线性范围”的实验方法，重复测定20次，计算结果均值为0.0005，标准差S为0.00018，以空白均值加两倍标准差方法计算吸光度变化量为0.00086，用稀释后浓度分别为0.008ug/mL、0.016ug/mL和0.032ug/mL的肝型脂肪酸结合蛋白校准品溶液测定，吸光度变化值分别为0.0003、0.0009和0.0014，其中浓度为0.016ug/mL肝型脂肪酸结合蛋白校准品溶液ΔA略高于空白均值加两倍标准差方法来计算值，因此，本发明检测试剂盒检测肝型脂肪酸结合蛋白的灵敏度为0.016ug/mL。试验例3检测试剂盒的重复性和准确度
用购自美国Fitzgerald Industries公司的肝型脂肪酸结合蛋白粉末配制浓度为80ng/mL的校准品作为样本，用本发明实施例1、实施例2和实施例3所制备的检测试剂盒测定校准品溶液中肝型脂肪酸结合蛋白的含量，每个试剂盒重复测定15次，分别计算测定均值（M）和标准差（S），以S/M×100%计算变异系数进行重复性考察，以（1—M/样本浓度）×100%计算相对偏差进行准确度考察，实验结果见下表1，由表1的结果可知本发明实施例1采用最优粒径胶乳颗粒制备的检测试剂盒其准确度及精密度优于采用其他粒径胶乳颗粒制备的检测试剂盒。
表1本发明实施例检测试剂盒的重复性及准确度结果
试验例4试剂盒与酶联免疫分析试剂盒测值的相关性试验
1.供试试剂盒
本发明实施例1所制备的肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，酶联免疫试剂盒（购自美国R&D公司）；
2.试验方法及结果
通过本发明实施例1所制备的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒与购自美国R&D公司的酶联免疫试剂盒测定尿液样本中肝型脂肪酸结合蛋白的含量的测定值进行比较，试验结果如图3所示，并进行回归分析。从图3中可以看出本发明实施例1所制备的肝型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒在测定尿液样本中肝型脂肪酸结合蛋白含量方面具有良好的相关性。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：缓冲液、防腐剂、表面活性剂和水；所述的试剂Ⅱ的组分包括：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、缓冲液、助悬剂、防腐剂、表面活性剂和水。
2.根据权利要求1所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，所述包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为180～220nm，所述肝型脂肪酸结合蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，所述包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒采用化学交联法制备得到，所述化学交联法制备包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒包括以下步骤：
（1）取0.2～1.0mL胶乳微球颗粒于离心管中，加入4.0～4.8mL磷酸缓冲液，混匀后离心得胶乳微球颗粒，后用3～10mL磷酸盐缓冲液重悬胶乳微球颗粒，向重悬的胶乳微球颗粒溶液中加入浓度为0.02mol/L的6-氨基己酸溶液0.5～2mL，再加入1～3mgEDC粉末，搅拌反应20～60min，离心去上清，并用3～10mL磷酸盐缓冲液重悬胶乳颗粒，既得羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒；
（2）取50～200ug肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体冻干品，用0.05～0.5mL去离子水溶解，后取50～300uL抗体溶液用5mL磷酸盐缓冲液稀释，并将稀释后的溶液加入羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球颗粒溶液中，再加入1～5mg的EDC，在4℃搅拌反应6～10小时，加入0.2mL甘氨酸溶液终止反应，离心去上清，并用1mL pH7.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中分散，既得包被抗体的胶乳微球颗粒溶液。
4.根据权利要求1所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液以及2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中的一种或任意两种的混合；所述防腐剂为叠氮化钠、Proclin300、硫柳汞、苯酚以及乙基汞硫代硫酸钠中的一种或任意几种的混合；所述表面活性剂为吐温20、吐温40、司盘40以及司盘60的一种或任意几种的混合；所述助悬剂为乙二醇、丙三醇、海藻酸钠、乳糖以及麦芽糖中的一种或任意两种的混合。
5.根据权利要求1所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：缓冲剂5～80g，防腐剂0.1～10g，表面活性剂0.1～5mL，余量为水。
6.根据权利要求5所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：缓冲剂15～30g，防腐剂1～5g，表面活性剂1～3mL，余量为水。
7.根据权利要求1所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳微球颗粒0.5～3.5g，缓冲剂5～80g，助悬剂5～50g，防腐剂0.1～10g，表面活性剂0.1～5mL，余量为水。
8.根据权利要求7所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳微球颗粒0.8～3g，缓冲剂10～30g，助悬剂10～30g，防腐剂1～5g，表面活性剂1～3mL，余量为水。
9.根据权利要求1所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的的pH值范围为6.0～9.0。
10.一种权利要求1至9任一项所述的肝型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，调整pH值，定容得到试剂Ⅰ；
（2）制备试剂Ⅱ：通过化学交联法制备包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体包被的胶乳微球颗粒，将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液，将混合溶液于胶乳颗粒混匀，调整pH值，定容得到试剂Ⅱ。
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