CN108872616B - 基于单粒径胶乳颗粒的检测ngal的免疫胶乳比浊法试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于单粒径胶乳颗粒的检测NGAL的免疫胶乳比浊法试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中，所述试剂R1包含缓冲液、表面活性剂、促凝剂、螯合剂、防腐剂、还原剂、电解质和水，所述试剂R2包含缓冲液、稳定剂、电解质、包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒，其中，所述还原剂为β‑巯基乙醇，所述抗人NGAL多克隆抗体是生物素标记的抗人NGAL多克隆抗体，所述胶乳颗粒是链霉亲和素标记的单粒径胶乳颗粒。本发明的试剂盒可以同时检测血液与尿液样本中的NGAL，不仅具有提高的检测灵敏度和线性范围，还可以克服干扰因子的影响，检测到NGAL同源二聚体和异源二聚体，避免NGAL检测结果偏低导致医生的误判。

Description

基于单粒径胶乳颗粒的检测NGAL的免疫胶乳比浊法试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单粒径胶乳颗粒并可同时检测血清和尿液中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒。

背景技术

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又称人脂质运载蛋白2(lipocalin 2，Ln2)或噬铁蛋白(siderocalin)，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。近年来，NGAL作为一种新的肾损伤标志物而倍受关注。

NGAL是1993年Kjeldsen等发现的，与明胶酶B即基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)密切相关。人类NGAL基因的全长为25000bp，其蛋白有三种存在形式：分子量为25kDa的单体、自身聚合46kDa同源二聚体或与MMP-9聚合形成135kDa异源二聚体。NGAL可能参与不同的生理、病理过程。NGAL是急性肾损伤的标志物。早期诊断急性肾功能损伤(AKI)时，血、尿中的NGAL浓度通常会迅速升高，2h最为明显(比临界值升高几十至几百倍)，而血清肌酐(sCr)、尿酶等传统指标往往要在24～72h才后明显升高，因而NGAL可用于AKI的早期诊断。同时，NGAL还可以反映肾功能损伤的严重程度，因而血和尿中的NGAL可以反映AKI严重程度，并且预后NGAL可作为AKI的预后指标之一。

NGAL也是反映肾脏慢性损害的一种有潜力的新标记物，在慢性肾脏病(chronickidney disease，CKD)患者中，NGAL能确切反映肾脏损害的程度，是CKD进展的一个强力和独立的风险指标。

研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布在0.7-9.6ng/ml之间，平均值为5.3ng/ml，而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，NGAL水平将迅速陡增。随机检测重病患者，尿液NGAL的浓度为110ng/ml到40000ng/ml不等，而他们的EDTA抗凝血浆检测结果为25ng/ml到3491ng/ml。当尿液中的NGAL含量超过350ng/ml，或者血浆中的NGAL含量达到400ng/ml以上时发生肾功能衰竭的阳性预测值为90％。

已知测定NGAL的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法，然而，这些方法存在着操作繁琐、需要特殊的装备、样本需要预处理、不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。胶乳增强免疫比浊法也是测定人尿液或血浆中NGAL浓度的常用方法，与其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点，因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值。胶乳增强免疫比浊法(PETIA)的基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。

目前市售的各种NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒存在诸多缺点：用单一粒径胶乳颗粒和抗体偶联，往往存在着分析灵敏度低和线性范围窄的缺点，检测灵敏度只能到10ng/ml，远不能检测正常人的数值；另外，很少有试剂盒能够避开NGAL同源二聚体和异源二聚体的干扰，从而造成检测结果假阴性。因此，目前急需一种能够排除NGAL同源二聚体和异源二聚体的干扰、检测灵敏度高、检测线性范围宽的一种NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒。

发明内容

针对以上现有技术的缺陷，本发明的第一个目的是提供具有高灵敏度和宽线性范围的NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，为此，本发明的发明人创造性地将生物素-链霉亲和素结合系统引入NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒中，通过生物素与链霉亲和素之间的高亲合力的牢固结合以及多级放大效应大大增加了抗体与乳胶颗粒的结合效力，进而提高抗原抗体结合率，从而达到提高检测灵敏度和线性范围的目的。本发明的第二个目的是提供能够检出NGAL同源二聚体和异源二聚体而避免造成检测结果假阴性的NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，为此，本发明的发明人在试剂盒组分中加入还原剂β-巯基乙醇，通过与NGAL同源二聚体和异源二聚体反应生成NGAL单体，从而实现NGAL同源二聚体和异源二聚体的检出。本发明的第三个目的是提供生产成本低廉、生产工序简化且利于市场推广的NGAL胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，通过使用单粒径胶乳颗粒与成本更低且制备工艺简单的多克隆抗体偶联来实现。

为此，本发明的提供了一种基于单粒径胶乳颗粒的检测NGAL的免疫胶乳比浊法试剂盒，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包含缓冲液、表面活性剂、促凝剂、螯合剂、防腐剂、还原剂、电解质和水，试剂R2包含缓冲液、稳定剂、电解质、防腐剂、包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒，其中，还原剂为β-巯基乙醇，抗人NGAL多克隆抗体是生物素标记的抗人NGAL多克隆抗体，胶乳颗粒是链霉亲和素标记的单粒径胶乳颗粒。

根据本发明的一种实施方案，其中，抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1％～1.5％。

根据本发明的一种实施方案，其中，抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为1.0％。

根据本发明的一种实施方案，其中，β-巯基乙醇占试剂R1的体积百分比为0.01％～0.2％。

根据本发明的一种实施方案，其中，β-巯基乙醇占试剂R1的体积百分比为0.1％。

根据本发明的一种实施方案，其中，胶乳颗粒的粒径为80-240nm。

根据本发明的一种实施方案，其中，胶乳颗粒的粒径为198nm。

根据本发明的一种实施方案，其中，生物素标记的NGAL多克隆抗体与链霉亲和素标记的单粒径胶乳颗粒的比例为100μg:1mg。

上述试剂R1和试剂R2中的缓冲液是能够用于维持一定PH值的各种生物缓冲液，例如选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液等的一种或多种缓冲液，试剂R1中的缓冲液优选使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸，试剂R2中的缓冲液优选使用2-吗啉乙磺酸。

上述试剂R1中的表面活性剂主要起到促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的。本领域技术人员可根据实际情况选用本领域常用的表面活性剂，例如Tween系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂等，本发明优选使用吐温-20。

上述试剂R1中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明优选使用PEG20000。

试剂R1中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明优选使用乙二胺四乙酸二钠。

上述试剂R1和R2中的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明，例如选自山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300等的一种或多种化合物，本发明试剂R1和R2中的防腐剂优选使用Proclin 300，该产品毒性小，使用剂量小，杀菌谱广。

上述试剂R1中的还原剂β-巯基乙醇的主要作用是将测试样品中的NGAL同源二聚体和异源二聚体还原为单体，进而与本发明的包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒结合而被检测，从而避免因NGAL同源二聚体和异源二聚体的干扰而造成的检测结果假阴性。

上述试剂R1和R2中的电解质可选用本领域常用的电解质，例如选自氯化钠、氯化钾、氯化钙等的一种或多种电解质，本发明优选使用氯化钠。

上述试剂R2中的稳定剂，主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性可选用本领域常用的稳定剂，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA等的一种或多种稳定剂，本发明优选使用BSA。

根据本发明的一种实施方案，其中，试剂R1的组成为100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、1.5mM吐温-20、100mM氯化钠、5.0mM PEG20000、3.0mM Proclin 950，3.0mM乙二胺四乙酸二钠，0.1％～2％(v/v)的β-巯基乙醇，其余为水，pH为7.0；和试剂R2的组成为150mM2-吗啉乙磺酸、100mM氯化钠、3.0mM Proclin 950，0.1g/L牛血清白蛋白，0.1wt％～1.5wt％的包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒，其余为水，pH为7.0。

根据本发明的一种实施方案，其中，包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为1.0％，β-巯基乙醇占试剂R1的体积百分比为0.1％。

根据本发明的一种实施方案，试剂R1中的缓冲液为羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，表面活性剂为吐温-20，促凝剂为PEG20000，螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，防腐剂为Proclin950，电解质为氯化钠，还原剂为β-巯基乙醇。

根据本发明的一种实施方案，试剂R1包含100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、1.5mM吐温-20、100mM氯化钠、5.0mM PEG20000、3.0mM Proclin 950，3.0mM乙二胺四乙酸二钠，0.1％～2％(v/v)的β-巯基乙醇，其余为水，pH为7.0。在本发明优选的实施方案中，β-巯基乙醇占试剂R1的体积百分比为0.01％～0.2％。在本发明更为优选的实施方案中，β-巯基乙醇占试剂R1的体积百分比为0.1％。

根据本发明的一种实施方案，试剂R2中的缓冲液为2-吗啉乙磺酸，稳定剂为BSA，电解质为氯化钠，生物素标记的人NGAL多克隆抗体为生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体。

根据本发明的优选的一种实施方案，试剂R2包含150mM 2-吗啉乙磺酸、100mM氯化钠、3.0mM Proclin 950，0.1g/L牛血清白蛋白，0.1％-1.5％(v/v)的包被有生物素标记的兔抗人抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒，其余为水，pH为7.0。

根据本发明的更优选的一种实施方案，抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1％～1.5％。根据本发明的最优选的一种实施方案，抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为1.0％。

根据本发明的一种实施方案，胶乳颗粒的粒径为80-240nm。

根据本发明的优选的一种实施方案，胶乳颗粒的粒径为198nm。

上述试剂R2中的胶乳颗粒采用链霉亲和素标记，在该链霉亲和素标记的胶乳颗粒上包被有用生物素标记的抗人β2-微球蛋白多克隆抗体，所述多克隆抗体可以是羊抗人β2-微球蛋白多克隆抗体、兔抗人β2-微球蛋白多克隆抗体、鸡抗人β2-微球蛋白多克隆抗体或鼠抗人β2-微球蛋白多克隆抗体等，本发明优选使用兔抗人β2-微球蛋白多克隆抗体。

本发明所用胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒，可市售获得，其平均粒径范围选择在180-240nm之间，优选粒径为198nm。同样质量的胶乳颗粒，粒径越小可吸附的抗体越多，精密度和线性范围相对较好；而粒径越大试剂的检测灵敏度越高，但线性范围则会相应有所损失。粒径过小时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，检测灵敏性下降，并且对试剂制备流程要求高，导致生产成本上升。而粒径过大时，其聚集产生的光密度变化容易超过检测限，且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低，稳定性下降。

目前，PETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。

本发明的胶乳颗粒采用生物素-链霉亲和素系统技术，生物素与链霉亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使生物素-链霉亲和素免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。

生物素(biotin，B)广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分子有两个环状结构(如下图)，其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖、脂类等。

链霉亲和素(streptavidin，SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种四聚体蛋白质，分子量为65kDa，等电点6.0。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，一个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子，二者亲和常数(K)为1015mol/L，是目前已知强度最高的非共价作用，远高于抗原与抗体间的亲和力(K＝10.5～11L/mol)。链霉亲和素的活性单位以结合1μg生物素所需的量来表示，1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。

生物素-链霉亲和素系统具有多级放大作用，可极大地提高检测方法的灵敏度，且其高度专一的结合特性使其在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂的高度稀释而受影响，在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

链霉亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性，而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，链霉亲和素-生物素系统在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。

此外，由于生物素与链霉亲和素的结合具高速、高效的特性，因此所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。

本发明提供的基于单粒径胶乳和多克隆抗体开发的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，具有血尿同测、操作简单、灵敏度高、线性范围宽、成本低且利于市场推广的优点，能够达到现有技术中需要双粒径胶乳和至少一种单克隆抗体开发的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的检测效果。同时该检测试剂盒兼容市场上大多数生化检测设备，可直接进入市场。

本发明检测试剂盒还可以克服干扰因子的影响，可以检测到NGAL同源二聚体和异源二聚体，避免NGAL检测结果偏低导致医生的误判；同时本发明检测试剂盒还具有检测灵敏度高、检测线性范围宽等优点。

附图说明

通过参照以下附图结合对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更加明显：

图1示出不同配比的试剂R1对不同浓度的NGAL蛋白进行检测而绘制的标准曲线比较结果。

图2示出用不同粒径胶乳颗粒配制的试剂R2对不同浓度的NGAL蛋白进行检测而绘制的标准曲线比较结果。

图3示出不同链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体比例标准曲线比较结果。

图4示出本发明的试剂盒对血清和尿液样本的线性范围检测结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施方式将有助于本领域技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例

本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。

NGAL蛋白购自武汉华美生物工程有限公司(货号CSB-DP001A)。

多克隆抗体(兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)购自武汉华美生物工程有限公司(货号CSB-DA001ARN)。

链霉亲和素购自北京索莱宝科技有限公司(货号S9170)。

生物素标记试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司(货号E-LK-B002)。

实施例1试剂的配制

1.1试剂R1的配制

在试剂配制过程中，按照下表浓度进行配制，配制好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。

1.2试剂R2的配制

在试剂配制过程中，按照下表浓度进行配制，配制好后过0.22μm滤膜，置于4℃备用。

组分	浓度
		2-吗啉乙磺酸缓冲液	150mM
氯化钠	100mM
		Proclin 950	3mM
牛血清白蛋白	0.1g/L
		纯化水	补足
pH	7.0

1.3链霉亲和素标记胶乳

1)分别将粒径为80nm、198nm、240nm的胶乳颗粒(购自JSR Life Science，货号分别为P0014/P0113/P0220)用50mM硼酸缓冲液(pH 9.0)稀释到终浓度为1％(质量百分比)，室温反应5min；

2)分别在1)所得各体系中加入EDC，使EDC/胶乳＝50μg/1mg，室温反应30min；

3)在2)中加入链霉亲和素，使链霉亲和素/胶乳＝80μg/1mg，混合搅拌，室温反应1h；

4)在3)中加入BSA，使BSA终浓度为1％，室温封闭2h；

5)用离心机在室温以15,000rpm离心，去除上清；

用试剂R2缓冲液溶解5)中沉淀，使其终浓度为8mg/ml，用超声波分散器(美国Sonics型号VCX750)进行超声分散后，得到以链霉亲和素标记的粒径分别为80nm、198nm、240nm的胶乳颗粒，置于4℃备用。

上述所得样品中，经分析比较，胶乳颗粒的优选粒径为198nm。

1.4生物素标记多克隆抗体

用生物素标记兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体，具体操作按照试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-DA001ARN)说明书操作。

链霉亲和素标记的胶乳和生物素标记的多克隆抗体混合

先将生物素标记的兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体与链霉亲和素标记的胶乳的按照100μg:1mg的比例进行混合；

然后室温15,000rpm离心去除上清，得到链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体；

最后使用试剂R2缓冲液将链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体按照0.1％-1.5％(质量百分比)重悬，优选地为1％。

实施例2试剂盒检测过程

2.1试验条件：

主波长	546nm	反应方向	向上
				反应温度	37℃	反应方法	两点终点法

2.2操作过程：

在AU680读点为11～27。

实施例3标准曲线的测定

3.1试剂R1不同配比的比较

使用试剂R1(1.1中配方，但不含β-巯基乙醇)稀释NGAL蛋白，使其浓度分别为0、150、600、1800、3600、7200ng/ml。按照1.1中的配比一、配比二、配比三配方配制试剂R1和1.2-1.5的最优条件配制试剂R2，并按照实施例2的检测方法在AU680上面对不同浓度的NGAL蛋白进行检测，结果如图1所示。从图中可以看出，其中配比二的NGAL蛋白浓度与△A值的线性关系更好，拟合的标准曲线斜率将更大，准确度和灵敏度均有较大的提升。

3.2不同胶乳粒径的比较

使用试剂R1(1.1中配方，但不含β-巯基乙醇)稀释NGAL蛋白，使其浓度分别为0、150、600、1800、3600、7200ng/ml。按照1.1中的配比二配制试剂R1和1.2中不同粒径(80nm、198nm、240nm)、1.3-1.5的最优配制试剂R2，并按照实施例2的检测方法在AU680上面对不同浓度额NGAL蛋白进行检测，结果如图2所示。从图中可以看出，其中198nm粒径配制的试剂R2的NGAL蛋白浓度与△A值的线性关系更好，拟合的标准曲线斜率将更大，准确度和灵敏度均有较大的提升。

3.3不同比例链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体的比较(试剂R1以实施例1中配比2配制，试剂R2其他条件均为最优)

使用试剂R1(1.1中配方，但不含β-巯基乙醇)稀释NGAL蛋白，使其浓度分别为0、150、600、1800、3600、7200ng/ml。按照1.1中的配比二配制试剂R1和1.2-1.4最优配制、1.5中不同比例(0.1％、1.0％、1.5％)配制试剂R2，并按照实施例2的检测方法在AU680上面对不同浓度的NGAL蛋白进行检测，结果如图3所示。从图中可以看出，其中链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL多克隆抗体按照1.0％(质量百分比)重悬配制的试剂R2的NGAL蛋白浓度与△A值的线性关系更好，拟合的标准曲线斜率将更大，准确度和灵敏度将有较大的提升。

综合上述实施例3的结果可知，本发明的试剂R1优选的是配比二，胶乳粒径优选为198nm，链霉亲和素标记的胶乳-生物素标记的兔抗人NGAL蛋白多克隆抗体与试剂2之比优选为1.0wt.％。以下实施例对本发明试剂盒性能的评价均基于此优选条件实施。

实施例4灵敏度检测

4.1本试剂盒灵敏度检测结果

测定空白液和4个不同NGAL蛋白浓度含量样品，每个样品测10次，计算平均值(M)和标准差(SD)，以样品吸光度-3SD大于空白吸光度+3SD的样品浓度作为NGAL蛋白检测试剂盒的最低灵敏度。从下表可见，不同样本的本发明检测试剂盒的灵敏度均为1.0ng/ml。

4.2双粒径胶乳对照试剂盒比对结果对比

利用双粒径胶乳对照试剂盒(参见CN 102590524 B的发明专利制备)对4.1尿液样本进行检测，测定结果见下表，用4.1同样的方法计算灵敏度，得出该试剂盒的检测灵敏度还不能达到8ng/ml，远低于本试剂盒的检测灵敏度。

4.3单粒径试剂盒结果对比

利用单粒径胶乳对照试剂盒(参见CN 104198732B的发明专利制备)对4.1尿液样本进行检测，测定结果见下表，用4.1同样的方法计算灵敏度，得出该试剂盒的检测灵敏度还不能达到8ng/ml，远低于本试剂盒的检测灵敏度。

实施例5线性范围检测

用0.9％NaCl溶液按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0的稀释比例对高值NGAL样本(血清和尿液样本)进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图4，从中可知，在样本浓度小于7000ng/ml的范围内能够保持良好的线性，即R²大于0.99。

实施例6NGAL二聚体检测比较

参见CN106814193A的发明专利中制备NGAL二聚体的方法制备NGAL二聚体，并采用本发明的试剂盒对其进行检测，其中对比试剂盒中除试剂R1中不含有β-巯基乙醇之外，其他试剂均与本试剂盒一样。结果如下表所示，从表可知，本试剂盒检测值更接近于理论值，而对比试剂盒检测值在含有NGAL二聚体的样本的检测值均低于理论值。这说明本发明的试剂盒可以检测到NGAL同源二聚体和异源二聚体，避免检测结果偏低导致临床上医生的误判或误诊。

实施例7相关性检测

使用本发明的试剂盒和对照试剂盒(上海聚创医药科技有限公司，货号NGA-2070)对40份样本(其中1-20为尿液样本，20-40为血清样本，所有样本结果单位均为ng/ml)进行测定，对测定值进行相关性分析，测定结果见下表，结果显示本发明和对照试剂盒的相关性很高，即R²均大于0.99。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于单粒径胶乳颗粒的检测NGAL的免疫胶乳比浊法试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其特征在于，

所述试剂R1的组成为100 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、1.5 mM吐温-20、100 mM氯化钠、5.0 mM PEG20000、3.0 mM Proclin 950，3.0 mM乙二胺四乙酸二钠，0.1%（v/v）的β-巯基乙醇，其余为水，pH为7.0；

所述试剂R2的组成为150 mM 2-吗啉乙磺酸、100 mM氯化钠、3.0 mM Proclin 950，0.1g/L牛血清白蛋白，1.0wt%的包被有抗人NGAL多克隆抗体的胶乳颗粒，其余为水，pH为7.0；

所述抗人NGAL多克隆抗体是生物素标记的抗人NGAL多克隆抗体，所述胶乳颗粒是链霉亲和素标记的单粒径胶乳颗粒；

所述胶乳颗粒的粒径为198 nm；

所述生物素标记的NGAL多克隆抗体与链霉亲和素标记的单粒径胶乳颗粒的比例为100μg:1 mg；

所述链霉亲和素标记的单粒径乳胶颗粒的制备方法，包括以下步骤：

①、将乳胶颗粒用50 mM、pH为9.0的硼酸缓冲液稀释到终浓度为1%，室温反应5min；

②、在①体系中加入EDC，使EDC/胶乳=50μg/1mg，室温反应30min；

③、在②中加入链霉亲和素，使链霉亲和素/胶乳=80μg/1mg，混合搅拌，室温反应1h；

④、在③中加入BSA，使BSA终浓度为1%，室温封闭2h；

⑤、室温15000rpm离心去除上清；

⑥、用试剂R2缓冲液溶解⑤中沉淀，使其终浓度为8mg/mL，超声分散后置于4℃备用。