CN114075280B

CN114075280B - 抗ngal的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒

Info

Publication number: CN114075280B
Application number: CN202010837341.XA
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 季红斌; 游辉
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN114075280A

Abstract

本发明公开了一种抗NGAL的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段具有重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗NGAL的单克隆抗体具有较好的灵敏度、特异性和亲和力等性能，可用于NGAL的检测以及以NGAL作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断，为检测NGAL提供新的更优的抗体选择。

Description

抗NGAL的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗NGAL的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒。

背景技术

脂质运载蛋白(lipocalin，LCN)家族是一群由小分子量的细胞外分泌性蛋白组成的超家族，最早于1987年被Pervaiz和Brew发现并命名。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-assocliated lipocalin，NGAL)是lipocalin家族的新成员。1993年，Kjeldesen等人在研究中性粒细胞中的基质金属蛋白酶9(MMP-9)时发现的一种25KD的蛋白，既NGAL。近年来，对NGAL的结构研究进一步明确了其生物学功能，大量动物及临床实验已证实NGAL与炎症、感染、缺血、细胞分化与凋亡、免疫反应及多种肿瘤的发生、发展等密切相关，因此，NGAL作为一种临床疾病标志物，越来越受到人们的关注。

1999年，Coles等研究表明的NGAL的蛋白空间结构，是由178个氨基酸残基组成的多肽链，属分泌型糖蛋白。NGAL在中性粒细胞和尿液中主要是以单体(25kDa)存在，小部分通过自身聚合形成的同源二聚体(45kDa)以及与MMP-9通过分子间二硫键形成共价的异源二聚体(135kDa)分子形式存在。大量研究表明，NGAL在人体内广泛存在，如髓、前列腺、肝脏、结肠、胃、支气管、胰腺及胸腺等，但是量非常低。炎症、缺血、肾损伤、感染、烧伤、外科手术等都能诱导NGAL表达增加，尤其是急性肾损伤中，表达量显著性的增加。当肾脏发生损伤时，肾小管上皮细胞能产生和分泌一些与免疫炎性反应有关的生物物质，NGAL即是其中之一。一些小鼠实验中发现，在肾脏缺血2h以后尿液中即可检测到高含量得NGAL。

最早对于血尿标本中的NGAL检测方法是用酶联免疫吸附试验(Elisa)或者免疫印迹法来检测的。但这些都是靠人工操作，无法标准化，检测周期较长而且费用昂贵，因此较少用于临床实践，仅仅用于科学研究。目前多用于检测NGAL的方法有：免疫层析法、乳胶免疫比浊法等，目前市面上大多数是乳胶免疫比浊法等，该方法检测虽然灵敏度高，但是操作繁琐，不适合于快速检测。免疫层析法操作简单，快速检测，适合于POCT，满足AKI快速诊断的需求。

不同的免疫检测方法优缺点各尽不同，但是都是基于抗体与抗原的反应，优质的抗体对于临床检测NGAL至关重要。目前针对NGAL的单克隆抗体来源少，只能依靠进口价格贵，且灵敏度、亲和力以及特异性都存在缺陷。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗NGAL的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒。本发明提供的抗NGAL的单克隆抗体具有较好的灵敏度、特异性和亲和力等性能，该单克隆抗体较现有抗体有明显优势，可用于NGAL的检测以及以NGAL作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，所述单克隆抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：

CDR-VH1(重链互补决定区1)：G-X1-S-X2-T-S-Y-S-X3-S，其中：X1是A或F，X2是I、V或L，X3是I、V或L；

CDR-VH2(重链互补决定区2)：R-M-X1-Y-X2-G-D-T-X3-Y-N-S-V-X4-K-S，其中：X1是W或Y，X2是D或N，X3是L、I或V，X4是I、V或L；

CDR-VH3(重链互补决定区3)：X1-R-D-P-X2-X3-P-P-Y，其中：X1是T或A，X2是I或L，X3是I或L；

CDR-VL1(轻链互补决定区1)：K-X1-S-K-S-X2-S-N-Y-X3-A，其中：X1是F或A，X2是I、V或L，X3是I、V或L；

CDR-VL2(轻链互补决定区2)：S-X1-S-T-X2-Q-S，其中：X1是G或A，X2是I、V或L；

CDR-VL3(轻链互补决定区3)：Q-Q-X1-Y-E-X2-P-Y，其中：X1是Y或H，X2是Q、N或K。

具有上述的互补决定区结构的单克隆抗体或其功能性片段，其能够特异性结合NGAL，对NGAL具有较高的亲和力，用于检测NGAL，具有较好的灵敏度和特异性，该单克隆抗体可用于NGAL的检测以及以NGAL作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X1是F；CDR-VH2中，X1是W；CDR-VH3中，X1是T；CDR-VL1中，X1是A；CDR-VL2中，X1是G；CDR-VL3中，X1是Y。

本发明的发明人发现，在各互补决定区中，当CDR-VH1中，X1是F，CDR-VH2中，X1是W，CDR-VH3中，X1是T，CDR-VL1中，X1是A，CDR-VL2中，X1是G以及CDR-VL3中，X1是Y是，该单克隆抗体对NGAL表现出更优异的亲和力。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X2是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X2是V。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X2是L。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X3是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X3是V。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X3是L。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X2是D。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X2是N。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X3是L。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X3是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X3是V。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X4是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X4是V。

在可选的实施方式中，CDR-VH2中，X4是L。

在可选的实施方式中，CDR-VH3中，X2是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH3中，X2是L。

在可选的实施方式中，CDR-VH3中，X3是I。

在可选的实施方式中，CDR-VH3中，X3是L。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X2是I。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X2是V。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X2是L。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X3是I。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X3是V。

在可选的实施方式中，CDR-VL1中，X3是L。

在可选的实施方式中，CDR-VL2中，X2是I。

在可选的实施方式中，CDR-VL2中，X2是V。

在可选的实施方式中，CDR-VL2中，X2是L。

在可选的实施方式中，CDR-VL3中，X2是Q。

在可选的实施方式中，CDR-VL3中，X2是N。

在可选的实施方式中，CDR-VL3中，X2是K。

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-44中的任意一种：

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体或其功能性片段与NGAL以K_D≤1.95×10^- ⁸mol/L的亲和力结合。

在可选的实施方式中，K_D≤1×10^-8mol/L、K_D≤9×10^-9mol/L、K_D≤8×10^-9mol/L、K_D≤7×10^-9mol/L、K_D≤6×10^-9mol/L、K_D≤5×10^-9mol/L、K_D≤4×10^-9mol/L、K_D≤3×10^-9mol/L或K_D≤2×10^-9mol/L。

在可选的实施方式中，2.35×10^-9mol/L≤K_D≤7.08×10^-9mol/L。

K_D的检测参考本发明实施例中的方法进行。

在可选的实施方式中，CDR-VH1中，X1是A；CDR-VH2中，X1是Y；CDR-VH3中，X1是A；CDR-VL1中，X1是F；CDR-VL2中，X1是A；CDR-VL3中，X1是H。

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合45-52中的任意一种：

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

通常情况下，重链可变区(VH)和轻链的可变区(VL)可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的单克隆抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为绵羊、山羊、牛、马、乳牛、猪、大鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、小鼠、鹿、貂、鸭、鹅、火鸡、斗鸡、鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。

在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab、scFv、Fab’和Fv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段在制备用于以NGAL作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供的单克隆抗体可以特异性结合NGAL，可用于以NGAL为标志物的相关疾病诊断或辅助诊断，这些疾病的包括但不限于炎症、缺血、肾损伤、感染、肿瘤和烧伤等。

在可选的实施方式中，所述疾病为急性肾损伤。

急性肾损伤(AKI)原称急性肾功能衰竭(ARF)。它是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合征，目前在临床上通常根据血肌酐及尿量的测定来诊断AKI，但血清肌酐敏感性较低，通常情况下，肾功能下降50％以上时，血肌酐浓度才会有所改变。在一项研究中，51％的患者术后发生了AKI，如果用血肌酐诊断要延迟到术后2～3d。与之相比，尿NGAL平均水平术后2h内增加了15倍，术后4和6h增加了25倍。NGAL不仅存在于尿液中，也存在于血浆中，血浆中NGAL浓度的测定AKI的早期诊断优于血肌酐及尿量的测定。急性肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭。

基于此，本发明提供的单克隆抗体或其功能性片段也可以用于急性肾损伤的诊断或辅助诊断，为该疾病的诊断或辅助诊断提供更多、高灵敏度和高特异性的抗体选择。

另一方面，本发明提供用于以NGAL作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段。

另一方面，本发明提供一种检测NGAL的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段。

在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述单克隆抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。

另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。

另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。

另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养能够重组表达如上任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述单克隆抗体或其功能性片段。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1的抗NGAL单克隆抗体的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1重组质粒的构建

(1)抗体基因制备

从分泌抗NGAL抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆，送基因测序公司进行测序。

(2)抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为324bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为354bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液(主要成分NaHCO₃)稀释NGAL抗原至3μg/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na₂HPO₄+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50μL/孔，含柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(50μL/孔，含EDTA·2Na+浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对NGAL抗原有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如下图1所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链，SEQ ID NO:14)，另一条Mr为28KD(轻链，SEQ ID NO:13)。

实施例2

抗体的性能检测

(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测

分析通过实施例1的抗体(WT)，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，其中，各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR-VH1：G-A(X1)-S-V(X2)-T-S-Y-S-I(X3)-S；

CDR-VH2：R-M-Y(X1)-Y-N(X2)-G-D-T-L(X3)-Y-N-S-V-I(X4)-K-S；

CDR-VH3：A(X1)-R-D-P-I(X2)-L(X3)-P-P-Y；

其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR-VL1：K-F(X1)-S-K-S-L(X2)-S-N-Y-V(X3)-A；

CDR-VL2：S-A(X1)-S-T-V(X2)-Q-S；

CDR-VL3：Q-Q-H(X1)-Y-E-N(X2)-P-Y。

在实施例1的抗NGAL单克隆抗体(WT)基础上，通过大量的分析，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。见下表1。

表1与抗体活性有关的突变位点

对表1中的抗体结合活性检测：

包被液(主要成分NaHCO₃)稀释NGAL抗原至1μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na₂HPO₄+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100μl/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表2。

表2 WT抗体及其突变体的活性数据

抗体浓度(ng/ml)	375	187.5	93.75	46.875	23.4375	0
							WT	1.834	1.180	0.640	0.350	0.166	0.076
突变1	2.125	1.295	0.867	0.498	0.215	0.084
							突变2	1.783	1.268	0.874	0.435	0.242	0.062
突变3	1.794	1.256	0.843	0.426	0.238	0.078
							突变4	1.723	1.213	0.854	0.477	0.252	0.086
突变5	0.238	0.078	0.025	-	-	-
							突变6	0.252	0.086	0.013	-	-	-

从表1数据可以看出，相较于突变5和突变6，WT、以及突变1-突变4对NGAL抗原的结合活性更好，其中，突变1的结合活性更优。

(2)抗体及其突变体的亲和力检测

(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10μg/ml，NGAL抗原用PBST进行梯度稀释：20μg/ml、6.66μg/ml、2.22μg/ml、0.74μg/ml、0.24μg/ml、0.082μg/ml、0.027μg/ml、0.0091μg/ml；

运行流程：缓冲液1(PBST，主要成分Na₂HPO₄+NaCl+TW-20)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。K_D表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。结果见下表4。

表4亲和力检测数据

从表4数据可以看出，突变1及其系列突变体对NGAL抗原均具有较高的亲和力。表明在突变1的基础上，按表3中所示突变方式进行突变可以获得对NGAL抗原具有较高亲和力的抗体。

(b)在WT的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。

表5以WT为骨架进行的突变

表6 WT抗体及其突变体的亲和力检测结果

	K<sub>D</sub>(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
				WT	1.48E-08	2.12E+04	3.13E-04
WT 1-1	8.17E-09	3.89E+04	3.18E-04
				WT 1-2	1.10E-08	2.27E+04	2.50E-04
WT 1-3	1.33E-08	2.58E+04	3.43E-04
				WT 1-4	1.95E-08	2.36E+04	4.60E-04
WT 1-5	8.79E-09	3.05E+04	2.68E-04
				WT 1-6	1.11E-08	3.69E+04	4.09E-04
WT1-7	1.32E-08	2.66E+04	3.52E-04

从表6数据可以看出，WT及其突变体对NGAL抗原也具有不错的亲和力，在WT的基础上，按表5中所示突变方式进行突变，可以获得对NGAL抗原具有较好亲和力的抗体。

(3)裸抗稳定性考核

将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表7突变1抗体为考核21天的酶免活性检测OD结果。

表7

抗体浓度(ng/ml)	375	93.75	0
				4℃，21天样品	1.855	0.824	0.076
-80℃，21天样品	1.835	0.836	0.082
				37℃，21天样品	1.867	0.818	0.082

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 抗NGAL的单克隆抗体及其应用和检测试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Tyr Lys Leu Leu Thr His

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ile Pro Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro Glu Glu Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Ile Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg

35 40 45

Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser

65 70 75 80

His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro

85 90 95

Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser

35 40 45

Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Thr Ser Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

85 90 95

Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr Cys

100 105 110

His Lys Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala Lys

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val Gln

145 150 155 160

Phe Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu

180 185 190

Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Pro Lys Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro

225 230 235 240

Thr Glu Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser

245 250 255

Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His

260 265 270

Ile Glu Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly

275 280 285

Ser Phe Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp

290 295 300

Ser Arg Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn

305 310 315 320

His His Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly

325 330

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Phe Ser Lys Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Tyr Lys Leu Leu Thr

35 40 45

His Ser Ala Ser Thr Val Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Ile Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Glu Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Glu Asn Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Ile Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Val Thr Ser Tyr

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Met Tyr Tyr Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asn Ser Val Ile Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Pro Ile Leu Pro Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Phe Ser Lys Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Tyr Lys Leu Leu Thr

35 40 45

His Ser Ala Ser Thr Val Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Ile Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Glu Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Glu Asn Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile

130 135 140

Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu

145 150 155 160

Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 14

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gln Ile Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Val Thr Ser Tyr

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Met Tyr Tyr Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asn Ser Val Ile Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Pro Ile Leu Pro Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro

180 185 190

Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

210 215 220

Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu

245 250 255

Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu

260 265 270

Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val

275 280 285

His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu

370 375 380

Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro

385 390 395 400

Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val

405 410 415

Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val

420 425 430

His Glu Gly Leu His Asn His His Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro

435 440 445

Pro Gly

450

Claims

1.一种抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：

CDR-VH1：G-X1-S-X2-T-S-Y-S-X3-S，其中：X1是F；

CDR-VH2：R-M-X1-Y-X2-G-D-T-X3-Y-N-S-V-X4-K-S，其中：X1是W；

CDR-VH3：X1-R-D-P-X2-X3-P-P-Y，其中：X1是T；

CDR-VL1：K-X1-S-K-S-X2-S-N-Y-X3-A，其中：X1是A；

CDR-VL2：S-X1-S-T-X2-Q-S，其中：X1是G；

CDR-VL3：Q-Q-X1-Y-E-X2-P-Y，其中：X1是Y；

所述单克隆抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-44中的任意一种：

CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X2/X3/X4 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X2/X3 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X2 突变组合 1 V/I N/L/I I/L L/V V N 突变组合 2 I/I D/V/I I/I V/V L K 突变组合 3 L/I D/I/V L/L I/V I Q 突变组合 4 V/V N/I/I L/I L/I L N 突变组合 5 I/V D/L/V I/I V/I I K 突变组合 6 L/V D/L/I L/I I/I V Q 突变组合 7 V/L N/L/V I/L L/L I K 突变组合 8 I/L D/L/I L/I V/L V N 突变组合 9 L/L D/V/I L/L I/L L Q 突变组合 10 V/I N/I/L L/L V/V V Q 突变组合 11 I/L N/V/V I/I L/L V K 突变组合 12 L/V D/L/L I/I I/I I K 突变组合 13 V/V D/L/V L/I V/I I N 突变组合 14 I/I D/L/L L/I L/V L N 突变组合 15 L/L N/I/L I/L I/L L N 突变组合 16 V/L N/L/I I/L V/L V K 突变组合 17 I/V D/L/L I/L L/I L N 突变组合 18 L/I N/L/V I/I I/V I Q 突变组合 19 I/V N/V/V L/L L/I L N 突变组合 20 L/V D/V/L L/I I/L V Q 突变组合 21 V/V N/V/V I/I V/V I K 突变组合 22 I/L N/V/V L/I L/V I Q 突变组合 23 L/L N/V/L I/L I/I L K 突变组合 24 V/L N/L/I L/I V/L V N 突变组合 25 I/I D/I/I L/L L/L I Q 突变组合 26 L/I N/V/V I/L I/V I N 突变组合 27 V/I N/V/L I/I V/I V K 突变组合 28 I/L D/I/I L/I L/V V N 突变组合 29 L/V D/V/L L/L I/L L K 突变组合 30 V/I N/V/I I/I V/I L Q 突变组合 31 I/L N/V/I I/I V/V V K 突变组合 32 L/V N/I/I L/L V/L L Q 突变组合 33 V/I N/I/I I/L L/I I N 突变组合 34 I/L N/V/L L/I I/V L K 突变组合 35 L/V D/L/V L/I L/L I K 突变组合 36 V/I D/I/L I/L I/I V Q 突变组合 37 V/I N/I/I I/I V/V I Q 突变组合 38 I/I D/L/V L/I L/L V N 突变组合 39 L/I N/L/L I/L I/I I N 突变组合 40 V/V D/I/I L/I V/I I Q 突变组合 41 I/V N/L/I L/L L/V V K 突变组合 42 L/V D/V/I I/L I/L V N 突变组合 43 V/L N/V/I I/I V/L L K 突变组合 44 I/L D/L/L L/I L/I L N

。

2.一种抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：

CDR-VH1：G-X1-S-X2-T-S-Y-S-X3-S，其中：X1是A；

CDR-VH2：R-M-X1-Y-X2-G-D-T-X3-Y-N-S-V-X4-K-S，其中：X1是Y；

CDR-VH3：X1-R-D-P-X2-X3-P-P-Y，其中：X1是A；

CDR-VL1：K-X1-S-K-S-X2-S-N-Y-X3-A，其中：X1是F；

CDR-VL2：S-X1-S-T-X2-Q-S，其中：X1是A；

CDR-VL3：Q-Q-X1-Y-E-X2-P-Y，其中：X1是H；

所述单克隆抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合45-52中的任意一种：

CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X2/X3/X4 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X2/X3 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X2 突变组合 45 V/I N/L/I I/L L/V V N 突变组合 46 L/L D/V/I L/L I/I I K 突变组合 47 V/I N/L/I L/I V/L I K 突变组合 48 V/L N/V/V L/I L/L L K 突变组合 49 L/I N/I/V I/I L/L L Q 突变组合 50 V/V D/I/L L/I L/I I Q 突变组合 51 I/I N/V/V I/I V/V L N 突变组合 52 L/L N/V/V L/L L/V V N

。

3.根据权利要求1-2任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述单克隆抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

4.根据权利要求1-2任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述单克隆抗体还包含恒定区。

5.根据权利要求4所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

6.根据权利要求4所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为绵羊、山羊、牛、马、猪、大鼠、狗、猫、兔、驴、小鼠、鹿、貂、鸭、鹅、鸡或人。

7.根据权利要求4所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。

8.根据权利要求4所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为斗鸡或火鸡。

9.根据权利要求4所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为小鼠。

10.根据权利要求9所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

11.根据权利要求1-2任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab、scFv、Fab’和Fv中的任意一种。

12.如权利要求1-11任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段在制备用于NGAL抗原检测试剂或试剂盒中的应用。

13.一种检测NGAL的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-11任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段。

14.根据权利要求13所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

15.根据权利要求14所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

16.根据权利要求15所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物。

17.根据权利要求15所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述催化底物显色的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

18.根据权利要求15所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述放射性同位素选自²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

19.根据权利要求15所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

20.根据权利要求15所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒和胶体。

21.根据权利要求20所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

22.根据权利要求20所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球、胶体硒和乳胶。

23.根据权利要求22所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述胶体金属选自胶体金和胶体银。

24.一种制备单克隆抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养能够重组表达如权利要求1-11任一项所述的抗NGAL的单克隆抗体或其功能性片段的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述单克隆抗体或其功能性片段。