CN112940130B - 能够特异性结合mpo的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测mpo的方法 - Google Patents

能够特异性结合mpo的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测mpo的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够特异性结合MPO的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测MPO的方法，涉及抗体技术领域，本发明公开的结合蛋白包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个：CDR‑VH1、CDR‑VH2、CDR‑VH3、CDR‑VL1、CDR‑VL2和CDR‑VL3。本发明提供的结合蛋白可以特异性结合MPO，具有较好的结合活性和亲和力，可用于MPO的检测，提高检测特异性和灵敏度。

Description

能够特异性结合MPO的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测 MPO的方法
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种能够特异性结合MPO的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测MPO的方法。
背景技术
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些巨噬细胞分泌的一种含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。相对分子质量为150KD，由2个亚单位通过二硫键聚合而成，每个亚单位又由一条重链和一条轻链组成。纯化的人MPO活性为25～351U/mg，水溶性好，反应最适pH为4.5～5.5， pH≥10或≤2时，失活。MPO在髓系细胞中以MPOⅠ、Ⅱ和Ⅲ3种亚型存在。这3种亚型的重链有所差异，功能上的差异尚不明确，有待继续研究。
MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志。MPO在宿主对抗微生物入侵早期免疫系统激活机制中起重要作用。其不仅能在吞噬细胞内杀灭微生物，而且可释放到细胞外，破坏多种靶物质，如肿瘤细胞、血小板、NK细胞、原虫和毒素等，其还对机体产生和调节炎症反应等方面发挥作用。在中心粒细胞活化后被释放出来，MPO形成多种氧自由基形式，氧化低密度脂蛋白和降低NO的生物利用度来促进动脉粥样硬化斑块形成。因此，循环中MPO水平升高可能预示炎症的发生。
冠心病是心血管系统中常见的疾病，而动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是形成冠心病的重要基础。MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS病变形成，进而引发并发症如急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)。在急性冠脉综合征复杂的病理生理过程中，炎症相关生物标志物中超敏C反应蛋白(Hypersensitive C-reactive protein，Hs-CRP)是最具代表性的指标，然而，Hs-CRP在其他因素导致的感染、炎症中也会升高，诊断特异性差，容易出现误诊。
目前，心肌损伤标志物肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac TroponinⅠ，cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及纤维蛋白原(Fibrinogen，Fib)等是临床常用来评价病情的指标。相对于肌cTnⅠ、CK-MB及Hs-CRP在患者出现症状后开始升高，而MPO在冠状动脉炎症反应和心脏时间发生前即可对ACS做出评估的生物学标志物。
MPO对ACS的诊断尤其是对急性心肌梗死的诊断具有一定价值。大量的研究表明：急性心梗患者的血浆MPO的表达显著高于不稳定心绞痛患者和正常人，而MPO缺陷的个体，罹患心血管疾病的危险性明显下降。血清MPO水平与冠脉病变严重程度呈正相关，反映冠脉炎症活动性状况。因此，MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。
有试验证实：MPO在ACS中的早期诊断价值，在患者出现症状1h内既有诊断价值，而此时cTnⅠ、CK-MB还处于基线水平。MPO可作为一种新的预测ACS的炎症标志物，能识别cTnⅠ阴性的ACS患者未来发生不良心血管事件的危险性。最近的研究证实，MPO结合超敏C反应蛋白检测大大提高了对冠脉验证反应和远期预后的诊断价值。此外，MPO对于心肌重构有一定作用，因此它也可能是潜在的心衰标志物。
MPO可作为冠心病的预测因子和急性冠脉综合征预后判断指标：MPO升高提示患者存在冠状动脉炎症、斑块不稳定，所以MPO可早期识别不稳定斑块，是ACS早期诊断的炎症标记物之一。
2013年8月9日中国国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2012》，报告中指出，我国心血管病现患病人数为2.9亿，位列第一，且患病人数呈快速增长态势，远远超过了癌症等其他疾病。在2015中国研究型医院高峰论坛中突出和强调了MPO在心脑血管当中的前瞻性和重要性。
临床上用于检测MPO的方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)，需要MPO的特异性单克隆抗体，对MPO进行定性和定量检测。
目前国内用于检测MPO的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，因此，本领域针对检测MPO的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够特异性结合MPO的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测MPO的方法。本发明提供的结合蛋白可以特异性结合MPO，具有较好的结合活性和亲和力，可用于MPO的检测，提高检测特异性和灵敏度，也可用于制备急性冠脉综合征诊断试剂或试剂盒，为MPO的检测和相关肿瘤的诊断提供更多的蛋白选择。
名词定义
术语“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
当在本文中使用时，“骨架区”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR 的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语“分离的”或“纯化的”是指所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
本发明的示例性实施方案：
第一方面，本发明实施例提供一种用于检测MPO的结合蛋白，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性的相似互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-M-N，其中：X1是 S或T，X2是D或G，X3是Y、N或GG；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为D-X1-D-P-X2-Y-G-X3-T-S-Y-N-X4-K-F-K-G，其中：X1是L或I，X2是N或Y，X3是 T、G或S，X4是Q或N；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-R-R-X1-Y-Y-G-N-Y-X2-Y-Y-P-X3-D，其中：X1是P或A，X2是I、V或L，X3是F、V或M；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-Q-X1-X2-V-H-S-X3-G-T-Y-X4，其中：X1是N、S或D，X2是I、V或L，X3是D或N，X4是I、V或L；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为K-V-S-X1-R-X2-S，其中：X1是N或D， X2是F或L；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为F-X1-G-X2-H-X3-P-F，其中：X1是Q或 K，X2是T或S，X3是I、V或L。
本发明实施例提供的结合蛋白含有抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括上述互补决定区中的至少一个，上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该结合蛋白特异性结合MPO抗原的能力，且该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，使用本发明的结合蛋白检测MPO，可以提高检测MPO的灵敏度和特异性，该结合蛋白可以用于诊断以MPO作为标志物的相关疾病，例如急性冠脉综合征，本发明为MPO的检测以及为MPO作为标志物的相关疾病的诊断提供更多蛋白选择。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是G；所述互补决定区 CDR-VH2中，X4是Q；所述互补决定区CDR-VH3中，X1是A；所述互补决定区CDR-VL1 中，X3是N；所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是Y。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是N。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是GG。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Y。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是T。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是G。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是F。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是M。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是N。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是D。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是N。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是D。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是F。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是T。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L。
在可选的实施方式中，所述相似互补决定区与上述互补决定区的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与MPO蛋白具有KD≤4.85×10-9mol/L的亲和力；
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与MPO蛋白具有KD≤4×10-9mol/L、 3×10-9mol/L、2×10-9mol/L、1×10-9mol/L、9×10-10mol/L、8×10-10mol/L、7×10-10mol/L、 6×10-10mol/L、5×10-10mol/L、4×10-10mol/L、3×10-10mol/L、2×10-10mol/L、1×10-10mol/L或9×10-11mol/L的亲和力；
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与MPO蛋白具有 9.14×10-11mol/L≤KD≤4.85×10-9mol/L的亲和力。
KD的检测参考本发明实施例中的方法进行。
在可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即Xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合1-61中的任一种：
Figure BDA0002311400710000041
Figure BDA0002311400710000051
Figure BDA0002311400710000061
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；所述互补决定区 CDR-VH2中，X4是N；所述互补决定区CDR-VH3中，X1是P；所述互补决定区CDR-VL1 中，X3是D；所述互补决定区CDR-VL3中，X1是K。
可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即Xn位点，n＝1，2，3 或4)选自下述突变组合62-67中的任一种：
Figure BDA0002311400710000062
在可选的实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个互补决定区(例如重链的3个互补决定区，或者轻链的3个互补决定区)；或者，所述结合蛋白包括至少6个互补决定区(如：重链的3个互补决定区以及轻链的3个互补决定区)；
在可选的实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白为抗体的功能性片段，例如纳米抗体、F(ab’)2、 Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种；
上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
需要说明的是，基于本发明揭示的内容，所述结合蛋白的重链或轻链骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、 IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区来源于小鼠。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:1-10的序列如下表所示：
Figure BDA0002311400710000071
第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的结合蛋白在制备急性冠脉综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。
在可选的实施方式中，急性冠脉综合征包括急性心肌梗死、不稳定心绞痛、稳定型心绞痛和心肌缺血中的一种或几种。
第三方面，本发明实施例提供一种急性冠脉综合征诊断试剂或试剂盒，其含有如上所述的结合蛋白。
在可选的实施方式中，急性冠脉综合征包括急性心肌梗死、不稳定心绞痛、稳定型心绞痛和心肌缺血中的一种或几种。
第四方面，本发明实施例提供一种检测MPO的方法，其包括：将前述实施方式任一项所述的结合蛋白与待测样本混合。
在可选的实施方式中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。
需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的MPO蛋白进行定性或定量检测。基于抗体抗原结合形成免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括：
(1)通过沉淀反应实现检测目的，包括：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等；
(2)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的，包括：免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)以及化学发光免疫分析法等。
指示剂可以根据不同的检测方法合理选择，包括但不限于如下描述的指示剂：
(1)免疫荧光法中，指示剂可以是荧光染料，例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料 (包括红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料(包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、 Alexa系列染料(包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、 33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)；
(2)放射免疫分析法中，指示剂可以是放射性同位素，例如：212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、 68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、 161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F等。
(3)酶联免疫分析法中，指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。
(4)化学发光免疫分析法中，指示剂可以是化学发光试剂，例如吖啶酯、辣根过氧化物酶和鲁米诺、碱性磷酸酶和AMPPD，电化学发光剂三联吡啶钌和三丙胺等。
基于此，在本发明公开了上述结合蛋白基础上，本领域技术人员容易想到采用上述的任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法，以实现对待测样本中MPO的定量或定性检测，无论选用何种方法，只要是利用了本发明公开的结合蛋白来检测MPO，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂，以使所述结合蛋白与MPO蛋白结合的复合物被检测。
第五方面，本发明实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施方式任一项所述的结合蛋白；
在可选的实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。
在本发明公开了上述结合蛋白的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述结合蛋白的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述结合蛋白的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述结合蛋白，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式所述的核酸。
其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是核酸序列以允许表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，调节序列包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。
在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。
本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的还包括编码使所述蛋白表达产物分泌或整合到膜上的信号肽序列，以及可选的还包括编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
第七方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施方式所述的载体。
本发明的表达载体可用于转化宿主细胞。这种转化后的宿主细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的结合蛋白的培养细胞或细胞系。本发明的宿主细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽孢杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如CHO细胞。
第八方面，本发明实施例提供一种生产前述实施方式任一项所述的结合蛋白的方法，其包括：
培养前述实施方式所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。
所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。
构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的MPO的单克隆抗体进行还原性的SDS-PAGE。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编， 1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(AcademicPress，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell 编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》 (J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
下文参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不限于展示的活动或事件排序，因为一些活动可以以不同的顺序和/或与其它活动或者事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的活动或事件。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor -RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
本实施例提供了一种制备抗MPO的重组抗体的方法
1重组质粒的构建
(1)引物
扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：
Figure BDA0002311400710000101
(2)抗体可变区基因克隆及测序
从分泌抗MPO的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACEcDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和 5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.8KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，送 Invitrogen公司进行测序。
(3)抗MPO的单克隆抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为339bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为369bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(4)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM 3.4
Figure BDA0002311400710000111
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入 HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计抗MPO抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：
Figure BDA0002311400710000112
通过PCR扩增方法扩出0.75KB的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A 载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl 质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液稀释MPO蛋白到指定浓度，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min-1h；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm) 处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对MPO蛋白都有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl 质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度，相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7 天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养 72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为 100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的 3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg 纯化的抗体(即为MPO单克隆抗体)进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(即重链，SEQ ID NO:14)，另一条 Mr为28KD(即轻链，SEQ ID NO:12)。
实施例2
抗体的性能检测
(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
进一步分析，实施例1的MPO单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ ID NO:13 所示，其中，重链的各互补决定区的氨基酸序列如下：
CDR-VH1：G-Y-S(X1)-F-T-D(X2)-Y-Y(X3)-M-N；
CDR-VH2：D-I(X1)-D-P-N(X2)-Y-G-G(X3)-T-S-Y-N-N(X4)-K-F-K-G；
CDR-VH3：A-R-R-P(X1)-Y-Y-G-N-Y-I(X2)-Y-Y-P-V(X3)-D；
其轻链可变区如SEQ ID NO:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：
CDR-VL1：R-S-S-Q-D(X1)-V(X2)-V-H-S-D(X3)-G-T-Y-L(X4)；
CDR-VL2：K-V-S-N(X1)-R-L(X2)-S；
CDR-VL3：F-K(X1)-G-T(X2)-H-V(X3)-P-F。
在实施例1的MPO单克隆抗体基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。见下表1。
表1与抗体活性有关的突变位点
Figure BDA0002311400710000131
结合活性检测：
包被液(PBS)稀释MPO蛋白到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(PBS)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl， 37℃，1h，拍干；加入稀释后的表1中的单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗 5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L 乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、 0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H2SO4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见表2。
表2抗体及其突变体的活性数据
抗体浓度(ng/ml) 333 111 37 12 4 0
WT 2.202 1.932 1.025 0.486 0.257 0.039
突变1 2.517 2.139 1.865 1.054 0.455 0.080
突变2 2.441 2.131 1.882 1.004 0.523 0.054
突变3 2.328 2.115 1.842 1.116 0.487 0.076
突变4 2.435 2.018 1.921 1.089 0.429 0.049
突变5 0.066 - - - -
突变6 0.032 - - - - -
根据表2数据可以看出，WT，以及突变1-4的结合活性更好，而突变5-6的结合活性较差，由此说明，表1中所列突变位点的氨基酸突变方式具有不可预期性。
(2)实施例1抗体及其突变体的亲和力检测
(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
Figure BDA0002311400710000132
Figure BDA0002311400710000141
Figure BDA0002311400710000151
亲和力检测：
利用AMC传感器，将纯化出来的抗体(表3中的各突变抗体)用PBST从50μg/ml 开始进行2倍梯度稀释，重组MPO蛋白用PBST进行梯度稀释；
运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。)
表4亲和力检测数据
Figure BDA0002311400710000152
Figure BDA0002311400710000161
Figure BDA0002311400710000171
从表4的亲和力数据可以看出，突变1，以及突变1-1至突变1-60的KD都比较低，说明这些抗体的亲和力比较好，也说明表3中所例突变位点的突变方式对抗体亲和力不具有负面影响，有足够理由预期按表3中所例突变位点的突变方式进行突变后的其他抗体也可以取得较好的亲和力。
(b)在WT的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
表5以WT为骨架进行的突变
Figure BDA0002311400710000172
表6以WT为骨架进行的突变的亲和力检测结果
K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
WT 2.38E-09 6.72E+04 1.60E-04
WT 1-1 3.20E-09 8.02E+04 2.57E-04
WT 1-2 3.16E-09 8.66E+04 2.74E-04
WT 1-3 1.35E-09 9.75E+04 1.32E-04
WT 1-4 4.85E-09 6.16E+04 2.99E-04
WT 1-5 9.82E-10 1.09E+05 1.07E-04
从表6数据可以看出，WT，以及WT1-1至WT1-5也具有较低的KD值，说明按表5中所列突变位点的突变方式突变后，所得抗体可以取得较好的亲和力。
(3)裸抗稳定性考核
将上述实施例中的抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7 天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降越势，说明自产抗体稳定。下表为突变1抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。
表7
抗体浓度(ng/ml) 111 12 0
4℃，21天样品 2.227 1.229 0.054
-80℃，21天样品 2.298 1.190 0.049
37℃，21天样品 2.236 1.254 0.067
从表7可以看出，在不同温度下存放21天后，本发明实施例的抗体依然可以将抗原检测出，说明本发明实施例提供的抗体具有较好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 菲鹏生物股份有限公司
<120> 能够特异性结合MPO的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测MPO的方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asn Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Trp Val Lys Gln Ser Glu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Val Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asn Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Lys Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Val Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asn Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Lys Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Glu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Asn Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Tyr Tyr Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Pro Val Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Glu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Asn Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Tyr Tyr Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Pro Val Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
115 120 125
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser
130 135 140
Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
195 200 205
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
210 215 220
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
225 230 235 240
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
245 250 255
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
275 280 285
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
290 295 300
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
305 310 315 320
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
340 345 350
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
355 360 365
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
385 390 395 400
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
405 410 415
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
420 425 430
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
435 440 445

Claims (21)

1.一种能够特异性结合髓过氧化物酶的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-M-N；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为D-X1-D-P-X2-Y-G-X3-T-S-Y-N-X4-K-F-K-G；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-R-R-X1-Y-Y-G-N-Y-X2-Y-Y-P-X3-D；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-Q-X1-X2-V-H-S-X3-G-T-Y-X4；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为K-V-S-X1-R-X2-S；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为F-X1-G-X2-H-X3-P-F；
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是G；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是Q；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是A；
所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q；
所述抗原结合结构域的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-61中的任一种：
突变组合 CDR-VH1 X1/X3 CDR-VH2 X1/X2/X3 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X1/X2/X4 CDR-VL2 X1/X2 CDR-VL3 X2/X3 突变组合 1 S/Y I/N/G I/V D/V/L N/L T/V 突变组合 2 T/Y L/N/G V/F D/V/V D/F S/V 突变组合 3 T/N I/Y/G L/M D/V/I N/F T/I 突变组合 4 S/N L/Y/G I/F N/V/L D/L S/I 突变组合 5 S/GG LY/S V/M N/V/V D/L T/L 突变组合 6 T/GG I/Y/S L/V N/V/I D/F S/L 突变组合 7 S/N L/N/S I/M S/V/L N/L S/I 突变组合 8 T/Y I/N/S V/V S/VV N/F T/L 突变组合 9 S/GG I/N/T L/F S/V/I D/L S/V 突变组合 10 T/N L/N/T I/V D/I/L N/L T/I 突变组合 11 T/GG I/Y/T L/M D/I/V D/F S/L 突变组合 12 S/Y L/Y/T V/F D/I/I N/F T/V 突变组合 13 T/GG I/Y/S V/M N/I/L D/F S/V 突变组合 14 S/N L/N/G L/V N/I/V N/F T/V 突变组合 15 S/GG L/N/T I/F N/I/I D/L T/I 突变组合 16 T/Y I/Y/T L/F S/I/L N/L S/L 突变组合 17 S/N L/N/S I/M S/I/V N/L S/I 突变组合 18 S/GG I/Y/G V/V S/I/I D/F T/L 突变组合 19 T/N I/N/S V/F D/L/L N/F T/V 突变组合 20 T/N L/Y/T L/M D/L/V D/L S/V 突变组合 21 T/Y L/Y/G I/V D/L/I D/L T/I 突变组合 22 T/GG I/N/T I/M N/L/L D/F S/I 突变组合 23 S/Y LY/S V/V N/L/V N/L T/L 突变组合 24 S/Y I/N/G L/F N/L/I N/F S/L 突变组合 25 S/N L/Y/G L/V S/L/L D/L S/I 突变组合 26 T/Y I/N/S I/F S/LV N/L T/L 突变组合 27 S/GG L/Y/T V/M S/L/I D/F S/V 突变组合 28 T/N L/N/S I/F D/V/L N/F T/I 突变组合 29 T/GG I/Y/T V/M N/I/L D/F S/L 突变组合 30 S/Y I/Y/G L/V S/L/L N/F T/V 突变组合 31 S/Y L/N/T I/V N/V/L D/L S/V 突变组合 32 T/Y I/Y/S V/F S/I/L N/L T/V 突变组合 33 T/N L/N/G L/M D/L/L D/L T/I 突变组合 34 S/N LY/S I/M S/V/L D/F S/L 突变组合 35 S/GG I/N/T V/V D/I/L N/L S/I 突变组合 36 T/GG I/N/G L/F N/L/L N/F T/L 突变组合 37 T/GG LY/S I/V D/V/V D/L S/I 突变组合 38 S/N I/Y/S L/M N/I/V N/L T/L 突变组合 39 S/GG L/N/S V/F S/L/V D/F S/V 突变组合 40 T/Y I/N/S V/M N/V/V N/F T/I 突变组合 41 S/N I/N/G L/V S/I/V N/L S/L 突变组合 42 S/GG L/N/G I/F D/L/V D/F T/V 突变组合 43 T/N I/Y/G L/F S/V/V N/F T/V 突变组合 44 T/N L/Y/G I/M D/I/V D/L S/V 突变组合 45 T/Y I/N/T V/V N/L/V D/L T/I 突变组合 46 T/GG L/N/T V/F D/V/I N/L S/I 突变组合 47 S/Y I/Y/T L/M N/I/I D/F T/L 突变组合 48 S/Y L/Y/T I/V S/L/I N/F S/L 突变组合 49 T/N I/Y/S I/M N/V/I D/L S/V 突变组合 50 S/N L/N/G V/V S/I/I D/F T/V 突变组合 51 T/Y L/N/T L/F D/L/I N/L T/I 突变组合 52 S/Y I/Y/T L/V S/V/I N/F S/L 突变组合 53 T/GG L/N/S I/F D/I/I D/L S/I 突变组合 54 S/GG I/Y/G V/M N/L/I N/L T/L 突变组合 55 S/N I/N/S V/M S/V/L D/F S/I 突变组合 56 T/Y L/Y/T L/V S/V/V N/F T/L 突变组合 57 S/GG L/Y/G I/F S/V/I D/F S/V 突变组合 58 T/N I/N/T L/F D/I/L N/F T/I 突变组合 59 T/GG LY/S I/M D/I/V D/L S/L 突变组合 60 S/Y I/N/G V/V D/I/I N/L T/V 突变组合 61 S/N I/Y/S V/F N/I/L D/F S/V
。
2.一种能够特异性结合髓过氧化物酶的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-M-N；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为D-X1-D-P-X2-Y-G-X3-T-S-Y-N-X4-K-F-K-G；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-R-R-X1-Y-Y-G-N-Y-X2-Y-Y-P-X3-D；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-Q-X1-X2-V-H-S-X3-G-T-Y-X4；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为K-V-S-X1-R-X2-S；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为F-X1-G-X2-H-X3-P-F；
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是N；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是P；
所述互补决定区CDR-VL1中，X3是D；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是K；
所述抗原结合结构域的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合62-67中的任一种：
突变组合 CDR-VH1 X1/X3 CDR-VH2 X1/X2/X3 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X1/X2/X4 CDR-VL2 X1/X2 CDR-VL3 X2/X3 突变组合 62 S/Y I/N/G I/V D/V/L N/L T/V 突变组合 63 S/Y L/N/T L/F N/L/V N/F T/I 突变组合 64 T/Y I/Y/G V/M D/V/V N/L T/V 突变组合 65 S/GG I/Y/G I/F S/L/I D/F S/I 突变组合 66 T/N I/Y/S V/M S/L/V N/F S/L 突变组合 67 S/GG I/Y/S V/F S/L/L N/F S/I
。
3.如权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为抗体或其功能性片段。
4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体中的任意一种。
5.根据权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
6.根据权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
8.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
9.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。
10.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。
11.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区来源于小鼠。
12.根据权利要求11所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
13.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-12任一项所述的结合蛋白。
14.一种如权利要求1-12任一项所述的结合蛋白在制备检测髓过氧化物酶的试剂盒中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：
将权利要求1-12任一项所述的结合蛋白与待测样本混合；
通过沉淀反应实现髓过氧化物酶检测或者是通过标记显示信号强度的指示剂实现髓过氧化物酶检测。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述通过沉淀反应实现髓过氧化物酶检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、免疫电泳以及免疫印迹法；所述免疫电泳包括对流免疫电泳。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述通过标记显示信号强度的指示剂实现髓过氧化物酶检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述指示剂选自荧光染料、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
19.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1~12任一项所述的结合蛋白的核酸。
20.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求19所述的载体。
21.一种生产权利要求1~12任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，其包括：
培养权利要求20所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。
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