CN112979803B - 特异性结合pct的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒 - Google Patents

特异性结合pct的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性结合PCT的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的针对PCT的结合蛋白其包括抗原结合结构域所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个：CDR‑VH1、CDR‑VH2、CDR‑VH3、CDR‑VL1、CDR‑VL2和CDR‑VL3。该结合蛋白可以特异性结合PCT，具有较好的结合活性和亲和力，使用本发明的结合蛋白检测PCT，可以提高检测的灵敏度和特异性，为PCT的检测以及为PCT作为标志物的疾病的诊断提供更多蛋白选择。

Description

特异性结合PCT的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂 和试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及特异性结合PCT的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒。
背景技术
降钙素原(英文名称为procalcitonin，简写PCT)编码基因定位于人类第11号染色体，该基因由6个外显子和5个内含子组成，总长7600bp，其中编码区长度为2800bp，基因转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体，进而在内源多肽酶的作用下修饰加工，生成116个氨基酸的终产物PCT。
在严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、系统炎性反应综合征(SIRS)、多器官功能衰竭综合征(MODS)的诊断方面，PCT是一个具有高灵敏度、特异性的新指标。PCT主要是在细菌毒素和炎性细胞因子的刺激下产生，而在非感染性炎症状态下血清PCT一般不升高，感染性炎症过程中，PCT的生成非常快，对内毒素刺激反应2～6小时内即升高，严重全身感染者血PCT在24h内可高达1000倍。PCT作为一种新的感染性炎症标记物目前已经被广泛认可。
PCT检测炎症的方法已获得美国食品药品管理局(FDA)的许可。早期，检测PCT主要使用凝胶层析方法和高效液相色谱法，这两种方法不仅费时，且操作要求高，不易自动化。近年来，PCT的检测多才采用免疫学方法进行，具有特异性强、灵敏度高和容易操作等优点，包括双抗夹心免疫化学法、胶体金法和放射免疫法等。所有这些免疫学方法的前提都是制备针对PCT的特异性单克隆抗体，在健康人血浆中PCT含量极低，在0.2ng/mL以下，因此，对所制备抗体的亲和力等参数要求很高。制备PCT特异性抗体，为PCT的免疫检测提供关键原料，对扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。
目前国内用于检测PCT的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，因此，本领域针对检测PCT的单克隆抗体仍然存在着强烈需求。
发明内容
本发明的目的在于提供特异性结合PCT的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒。本发明提供的结合蛋白可以特异性结合PCT，具有较好的结合活性和亲和力，使用本发明的结合蛋白检测PCT，可以提高检测的灵敏度和特异性，该结合蛋白可以用于诊断以PCT作为标志物的疾病。
名词定义
术语“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码:Ala，单字母密码:A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。
在本文中，肽、多肽、蛋白质不作严格区分，在一些情形中可以相互替代使用，一般指通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不管是天然产生的还是合成的。多肽也可以包含非氨基酸成分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表达所述多肽的细胞所加入的，并且可以随细胞类型而不同。多肽在本文中关于其氨基酸骨架结构或编码其的核酸而限定。如碳水化合物基团的添加通常没有规定，但是，是可以存在的。所有的多肽序列按照通常接受的惯例书写，其中α-N-端氨基酸残基在左侧，且α-C-端氨基酸残基在右侧。当用于本文时，术语“N-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-氨基基团，术语“C-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-羧酸端。在N-端以某基团结束的多肽是指在N-端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。在N-端以某基团结束的氨基酸是指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。
“保守”氨基酸置换是其中氨基酸残基被带有具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基置换的那些置换。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域中是已知的，并且包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，带有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸置换的特殊形式包括用不在由遗传密码编码的正常的20个氨基酸中的氨基酸置换的那些。本发明的实施方案包括使用合成肽，因此在本文公开的肽中可以使用这种“非天然存在的”氨基酸残基，并且可以将氨基酸残基侧链中的天然饱和碳链交换为更短或更长的饱和碳链。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HRP-II抗原或其片段。“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。
通常情况下，抗体的重链和轻链的可变区VH/VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本发明的示例性实施方案：
第一方面，本发明实施例提供一种能够特异性结合PCT的结合蛋白，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性的相似互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-X1-S-X2-T-S-D-Y-X3-W-H，其中：X1是F或Y，X2是L、V或I，X3是F、S或Y；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为Y-X1-D-F-X2-G-S-T-D-Y-X3-P-S-X4-R-S，其中：X1是L、V或I，X2是R或K，X3是Q或N，X4是I、V或L；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-X1-R-G-S-X2-D，其中：X1是K或R，X2是S、F或Y；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-X1-S-X2-H-S-N-G-X3-T-Y-X4-F，其中：X1是R或K，X2是II、IL、LL或LI，X3是L或I，X4是I、V或L；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为Q-M-X1-N-X2-A-S，其中：X1是S或T，X2是I、V或L；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为A-X1-N-X2-E-X3-P-W，其中：X1是Q或N，X2是I或L，X3是I或L。
本发明实施例提供的结合蛋白含有抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括上述互补决定区中的至少一个，上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该结合蛋白特异性结合PCT抗原的能力，且该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，使用本发明的结合蛋白检测PCT，可以提高检测的灵敏度和特异性，该结合蛋白可以用于诊断以PCT作为标志物的疾病，本发明为PCT的检测以及为PCT作为标志物的疾病的诊断提供更多蛋白选择。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；所述互补决定区CDR-VH2中，X2是R；所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；所述互补决定区CDR-VL1中，X1是K；所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是F。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是Y。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是Q。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是N。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是S。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是F。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Y。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是II。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是IL。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是LL。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是LI。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是L。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I。
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L。
在可选的实施方式中，所述相似互补决定区与上述互补决定区的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与PCT蛋白具有KD≤8.89×10-10mol/L的亲和力。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与PCT蛋白具有KD≤8×10-10mol/L、7×10-10mol/L、6×10-10mol/L、5×10-10mol/L、4×10-10mol/L、3×10-10mol/L、2×10-10mol/L、1×10-10mol/L、9×10-11mol/L、8×10-11mol/L、7×10-11mol/L、6×10-11mol/L、5×10-11mol/L、4×10-11mol/L或3×10-11mol/L的亲和力。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与PCT蛋白具有3.04×10-11≤KD≤8.89×10-10mol/L的亲和力。
KD的检测参考本发明实施例中的方法进行。
在可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即Xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合1-56中的任一种：
Figure BDA0002323611190000041
Figure BDA0002323611190000051
在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是Y；所述互补决定区CDR-VH2中，X2是K；所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；所述互补决定区CDR-VL1中，X1是R；所述互补决定区CDR-VL2中，X1是T；所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N。
在可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即Xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合57-64中的任一种：
Figure BDA0002323611190000052
Figure BDA0002323611190000061
在可选的实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个互补决定区(例如重链的3个互补决定区，或者轻链的3个互补决定区)；或者，所述结合蛋白包括至少6个互补决定区(如：重链的3个互补决定区以及轻链的3个互补决定区)；
在可选的实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白为抗体的功能性片段，例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种；
上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
需要说明的是，基于本发明揭示的内容，所述结合蛋白的重链或轻链骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区来源于小鼠。
在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:1-10的序列如下表所示：
Figure BDA0002323611190000062
Figure BDA0002323611190000071
第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断感染性炎症的试剂或试剂盒中的应用。
在可选的实施方式中，所述感染性炎症选自严重全身性细菌、真菌、寄生虫或急性疟疾感染、系统炎性反应综合征、多器官功能衰竭综合征和败血症中的任意一种。
第三方面，本发明实施例提供一种用于诊断感染性炎症的试剂或试剂盒，其含有如上所述的结合蛋白；
在可选的实施方式中，所述感染性炎症选自严重全身性细菌、真菌、寄生虫或急性疟疾感染、系统炎性反应综合征、多器官功能衰竭综合征和败血症中的任意一种。
第四方面，本发明实施例提供一种检测PCT的方法，其包括：将前述实施方式任一项所述的结合蛋白与待测样本混合。
在可选的实施方式中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。
需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的PCT蛋白进行定性或定量检测。基于抗体抗原结合形成免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括：
(1)通过沉淀反应实现检测目的，包括：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等；
(2)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的，包括：免疫荧光法、放射免疫分析法、化学发光免疫分析法以及酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)等；
指示剂可以根据不同的检测方法合理选择，包括但不限于如下描述的指示剂：
(1)免疫荧光法中，指示剂可以是荧光染料，例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料(包括红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料(包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料(包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)；
(2)放射免疫分析法中，指示剂可以是放射性同位素，例如：212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F等。
(3)酶联免疫分析法中，指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。
(4)化学发光免疫分析法中，指示剂可以是化学发光液，例如吖啶酯、辣根过氧化物酶和鲁米诺/异鲁米诺、碱性磷酸酶和AMPPD，电化学发光剂三联吡啶钌和三丙胺等。
基于此，在本发明公开了上述结合蛋白基础上，本领域技术人员容易想到采用上述的任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法，以实现对待测样本中PCT的定量或定性检测，无论选用何种方法，只要是利用了本发明公开的结合蛋白来检测PCT，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂，以使所述结合蛋白与PCT蛋白结合的复合物被检测。
第五方面，本发明实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施方式任一项所述的结合蛋白；
在可选的实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。
在本发明公开了上述结合蛋白的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述结合蛋白的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述结合蛋白的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述结合蛋白，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式所述的核酸。
第七方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施方式所述的载体。
第八方面，本发明实施例提供一种生产前述实施方式任一项所述的结合蛋白的方法，其包括：
培养前述实施方式所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。
所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。
构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的PCT单克隆抗体进行还原性的SDS-PAGE。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。
下文参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不限于展示的活动或事件排序，因为一些活动可以以不同的顺序和/或与其它活动或者事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的活动或事件。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
本实施例提供了一种制备抗PCT的重组抗体的方法
1重组质粒的构建
(1)引物
扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：
Figure BDA0002323611190000091
(2)抗体可变区基因克隆及测序
从分泌抗PCT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACEcDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.8KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，送Invitrogen公司进行测序。
(3)抗PCT的单克隆抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为339bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为345bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(4)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4
Figure BDA0002323611190000092
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计抗PCT抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：
Figure BDA0002323611190000093
通过PCR扩增方法扩出0.75KB的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液稀释重组PCT蛋白(自产，141220)到1μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min-1h；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对重组PCT蛋白都有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度，相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体(即为PCT单克隆抗体)进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(即重链，SEQ ID NO:14)，另一条Mr为28KD(即轻链，SEQ ID NO:12)。
实施例2
抗体的性能检测
(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
进一步分析，实施例1的PCT单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ ID NO:13所示，其中，重链的各互补决定区的氨基酸序列如下：
CDR-VH1：G-Y(X1)-S-V(X2)-T-S-D-Y-Y(X3)-W-H；
CDR-VH2：Y-L(X1)-D-F-K(X2)-G-S-T-D-Y-Q(X3)-P-S-L(X4)-R-S；
CDR-VH3：A-K(X1)-R-G-S-Y(X2)-D；
其轻链可变区如SEQ ID NO:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：
CDR-VL1：R-S-S-R(X1)-S-IL(X2)-H-S-N-G-L(X3)-T-Y-V(X4)-F；
CDR-VL2：Q-M-T(X1)-N-V(X2)-A-S；
CDR-VL3：A-N(X1)-N-I(X2)-E-L(X3)-P-W。
在实施例1的PCT单克隆抗体基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。见下表1。
表1与抗体活性有关的突变位点
Figure BDA0002323611190000111
结合活性检测：
包被液(PBS)稀释重组PCT蛋白(购自菲鹏，141220)到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(PBS)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的表1中的PCT单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-1h；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H2SO4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见表2。
表2抗体及其突变体的活性数据
抗体浓度(ng/ml) 4.115 1.372 0.457 0.152 0.051 0.000
WT 1.857 0.958 0.362 0.229 0.143 0.002
突变1 2.248 1.363 0.561 0.264 0.138 0.005
突变2 2.155 1.352 0.558 0.258 0.123 0.000
突变3 2.041 1.139 0.462 0.261 0.136 0.001
突变4 2.052 1.168 0.542 0.245 0.127 0.007
突变5 1.958 1.052 0.458 0.258 0.123 0.000
突变6 1.996 1.039 0.362 0.261 0.136 0.001
突变7 0.255 0.124 0.007 - - -
突变8 0.212 0.125 - - - -
突变9 0.245 0.131 - - - -
从表2数据可以看出，相较于突变7-9，WT以及突变1-6的结合活性更好，表明按表1中所示突变位点的突变方式进行突变提到的抗体其结合活性不具有可预期性。
(2)实施例1抗体及其突变体的亲和力检测
在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
Figure BDA0002323611190000121
Figure BDA0002323611190000131
亲和力检测：
以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml；抗体从100ng/ml开始2倍梯度稀释至0.195ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2*(n*Ab`-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后对所有K取平均数值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。结果见表4(KD表示平衡解离常数即亲和力)。
表4亲和力检测数据
Figure BDA0002323611190000132
Figure BDA0002323611190000141
Figure BDA0002323611190000151
表4数据显示，突变1，以及突变1-1至突变1-55的KD都比较低，说明这些抗体对抗原的亲和力都比较好，也表明表3所示的突变位点的突变方式对抗体亲和力没有负面影响，能够提高抗体的亲和力，也说明，按表3所示的突变位点的突变方式进行突变后得到的抗体具有较好的亲和力。
(b)在WT的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
表5以WT为骨架进行的突变
Figure BDA0002323611190000152
表6以WT为骨架进行的突变的亲和力检测结果
K<sub>D</sub>(M)
WT 3.21E-10
WT 1-1 2.15E-10
WT 1-2 5.69E-10
WT 1-3 4.58E-10
WT 1-4 6.33E-10
WT 1-5 5.24E-10
WT 1-6 6.21E-10
WT 1-7 8.89E-10
表6数据显示，WT 1，以及WT 1-1至WT 1-7的KD较低，也具有较好的亲和力，说明按表5所示的突变位点的突变方式进行突变，可以取得具有较好的亲和力的抗体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 特异性结合PCT的结合蛋白、其应用、诊断感染性炎症的试剂和试剂盒
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Trp Ile Arg Asn Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Leu Thr Tyr Val Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Gln Met Thr Asn Val Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Asn
85 90 95
Ile Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Leu Thr Tyr Val Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Gln Met Thr Asn Val Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Asn
85 90 95
Ile Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Val Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Asn Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Leu Asp Phe Lys Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Val Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Asn Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Leu Asp Phe Lys Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly
435

Claims (17)

1.一种能够特异性结合PCT的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-X1-S-X2-T-S-D-Y-X3-W-H；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为Y-X1-D-F-X2-G-S-T-D-Y-X3-P-S-X4-R-S；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-X1-R-G-S-X2-D；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-X1-S-X2-H-S-N-G-X3-T-Y-X4-F；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为Q-M-X1-N-X2-A-S；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为A-X1-N-X2-E-X3-P-W；
所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；
所述互补决定区CDR-VH2中，X2是R；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；
所述互补决定区CDR-VL1中，X1是K；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q；
所述抗原结合结构域的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-56中的任一种：
突变组合 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X1/X3/X4 CDR-VH3 X2 CDR-VL1 X2/X3/X4 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X2/X3 突变组合 1 V/Y L/Q/L Y IL/L/V V I/L 突变组合 2 I/S V/N/V S LI/I/L L I/I 突变组合 3 L/F I/N/I F IL/L/V I L/L 突变组合 4 V/S I/N/L S LL/I/L L L/I 突变组合 5 I/F V/Q/V F II/I/V I L/L 突变组合 6 L/Y L/N/L Y LI/L/L V I/L 突变组合 7 V/F I/N/I F IL/I/V I I/I 突变组合 8 I/Y V/N/I Y LL/L/L V L/I 突变组合 9 L/S L/Q/V S II/L/I L I/I 突变组合 10 L/F I/Q/L F LI/I/I I L/I 突变组合 11 V/S L/N/V S IL/L/I L I/L 突变组合 12 I/Y V/Q/I Y LL/I/I V L/L 突变组合 13 I/S I/N/V S II/I/I L I/I 突变组合 14 L/Y V/N/L Y LI/L/I V I/L 突变组合 15 V/F L/Q/I F IL/I/I I L/I 突变组合 16 L/S V/Q/L Y LL/L/I V L/L 突变组合 17 I/F I/Q/V F II/L/L I L/L 突变组合 18 V/Y L/N/I S LI/I/V L I/L 突变组合 19 V/S L/Q/L S IL/L/L L I/I 突变组合 20 I/F V/N/V Y LL/I/V V L/I 突变组合 21 L/Y I/N/I F II/I/L I I/I 突变组合 22 V/Y V/Q/V F LI/L/V V L/I 突变组合 23 I/S L/N/L Y IL/I/L I I/L 突变组合 24 L/F I/Q/I S LL/L/V L L/L 突变组合 25 V/F L/Q/V Y LI/I/L I L/L 突变组合 26 I/Y V/N/I S II/L/V L I/L 突变组合 27 L/S I/Q/L F IL/L/V V I/I 突变组合 28 V/Y V/Q/I Y LL/I/L V L/I 突变组合 29 I/S I/N/L S LI/L/L L I/L 突变组合 30 L/F L/N/V F II/I/V I I/I 突变组合 31 V/S I/N/V S IL/L/L L L/L 突变组合 32 I/F V/N/L F LL/I/V I L/I 突变组合 33 L/Y L/Q/I Y LI/I/I V I/I 突变组合 34 V/F V/Q/L F II/L/I I L/I 突变组合 35 I/Y L/N/I Y IL/I/I V I/L 突变组合 36 L/S I/Q/V S LL/L/I L L/L 突变组合 37 L/F I/Q/I S LI/L/I I I/I 突变组合 38 V/S V/N/V Y II/I/I L I/L 突变组合 39 I/Y L/Q/L F IL/I/I V L/I 突变组合 40 I/S I/N/L F LL/I/I L L/L 突变组合 41 L/Y V/Q/V Y LI/I/V V I/I 突变组合 42 V/F L/N/L S II/L/L I L/I 突变组合 43 L/S I/N/I Y IL/I/V V I/L 突变组合 44 I/F V/N/I S LL/L/L I L/L 突变组合 45 V/Y L/Q/V F LI/L/V L L/L 突变组合 46 V/S I/Q/L F II/I/V L I/L 突变组合 47 I/F L/N/V S IL/L/V V I/I 突变组合 48 L/Y V/Q/I Y LL/I/L I L/I 突变组合 49 V/Y I/N/V S II/L/V V I/I 突变组合 50 I/S V/N/L Y LI/I/L I L/I 突变组合 51 L/F L/Q/I F IL/L/V L I/L 突变组合 52 V/F V/Q/L Y LL/I/L I L/L 突变组合 53 I/Y I/Q/V F II/I/L L I/I 突变组合 54 L/S L/N/I S LI/L/V V I/L 突变组合 55 V/Y I/Q/I Y IL/I/L V L/I 突变组合 56 I/S V/N/V S LL/L/V L L/L
。
2.一种能够特异性结合PCT的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-X1-S-X2-T-S-D-Y-X3-W-H；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为Y-X1-D-F-X2-G-S-T-D-Y-X3-P-S-X4-R-S；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-X1-R-G-S-X2-D；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为R-S-S-X1-S-X2-H-S-N-G-X3-T-Y-X4-F；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为Q-M-X1-N-X2-A-S；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为A-X1-N-X2-E-X3-P-W；
所述互补决定区CDR-VH1中，X1是Y；
所述互补决定区CDR-VH2中，X2是K；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；
所述互补决定区CDR-VL1中，X1是R；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是T；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N；
所述抗原结合结构域的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合57-64中的任一种：
突变组合 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X1/X3/X4 CDR-VH3 X2 CDR-VL1 X2/X3/X4 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X2/X3 突变组合 57 V/Y L/Q/L Y IL/L/V V I/L 突变组合 58 L/Y V/Q/V F LI/I/V I L/I 突变组合 59 L/Y I/N/V F II/L/L I L/I 突变组合 60 L/F L/Q/L S LL/L/I L I/L 突变组合 61 I/S L/Q/I Y II/L/I I I/L 突变组合 62 L/F V/Q/I F LI/L/L V I/I 突变组合 63 L/F L/Q/V F LL/I/L L L/I 突变组合 64 L/F V/N/L F LL/L/I I L/L
。
3.如权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为抗体或其功能性片段。
4.如权利要求3所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的任意一种。
5.如权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ IDNO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
6.如权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。
7.如权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
8.如权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
9.根据权利要求8所述的结合蛋白，其特征在于，所述牛选自乳牛；或，所述鸡选自火鸡或斗鸡。
10.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区来源于小鼠。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
12.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-11任一项所述的结合蛋白。
13.一种如权利要求1-11任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中PCT的试剂盒中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，将权利要求1-11任一项所述的结合蛋白与待测样本混合。
15.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1~11任一项所述的结合蛋白的核酸。
16.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求15所述的载体。
17.一种生产权利要求1~11任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，其包括：
培养权利要求16所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。
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