CN108254567A

CN108254567A - 一种基于双分子荧光互补技术的ngal检测试剂盒、制备及使用方法

Info

Publication number: CN108254567A
Application number: CN201711272364.5A
Authority: CN
Inventors: 徐林
Original assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的NGAL诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的NGAL诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有检测快速、特异性好、操作方面、免清洗、精密度好等优点，便于临床检测使用，其应用于急性肾损伤的监测，可以提高急性肾损伤诊断的准确率，具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒、制备及使用方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内NGAL的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)临床常见而严重，在美国，社区获得的AKI占总住院患者的1％，住院患者的AKI发生率0.15％～7.5％之间，远高于社区，而ICU病房的 AKI发生率高达5％～20％。我国没有大宗的流行病学调查，但各地报道的发生率均较高，例如北京大学医院报道冠状动脉搭桥术后的病人AKI发生率为27.94％。尽管临床治疗水平不断提高，但是AKI的发病率还在增长，其病死率也居高不下。目前应用最多的AKI定义是ADQI (acute dialysis qualith initiative，ADQI)组织于2002年制定的：肾功能在48h内急剧下降，表现为血清肌酐(serum creatinine，Scr)上升＞0.3mg/dl(26.4μmol/L)或Scr上升＞50％(达到基线的1.5倍)或尿量减少(＜0.5ml·kg-1·d-1)超过6h，并将AKI分为5级(RIFLE分级)。可见Scr仍然是经典的诊断AKI的指标，但Scr常受一些非肾脏因素影响，其数值变化常晚于早期肾损伤，不能准确、敏感地反映肾功能情况，使得一些可以恢复的AKI贻误了最佳治疗时机。因此，近年来众多的研究致力于寻找稳定敏感、能早于Scr和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)反应肾功能的具有诊断价值的生物标志物，希望对AKI进行早期干预，降低病死率。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL) 是一种相对分子质量25×10³的小分子分泌型蛋白。经鉴定，这种相对分子质量为25×10³的蛋白质由198个氨基酸组成，前20个氨基酸为前导序列，易自身聚合形成相对分子质量为46×10³的同源二聚体，也可以与基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)形成相对分子质量为135×10³的异源二聚体。

NGAL是一种小分子蛋白，可以直接检测尿液，样本的获取比较简便。在有关急性肾损伤的动物模型中，小鼠在被诱导肾脏受损后一个小时后，检测排出的尿液NGAL浓度水平，发现受诱导的小鼠的NGAL的浓度显著高于正常小时，而且即使是轻微的“亚临床”型肾缺血， NGAL也可检测到其浓度的变化。NGAL不仅存在于尿液中，也存在于血浆中。血浆中NGAL浓度的测定AKI的早期诊断将更加有利，因为它能避免因少尿带来的麻烦，也能减轻因治疗而使用利尿药等带来的干扰。急性肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭，急性肾功能衰竭(ARF)是心脏手术、肾毒性、肾移植常见的并发症。NGAL 在以下情况下可作为早期监测AKI的指标：儿童和成人心肺搭桥手术，冠心病介入治疗(PCI)，在急诊科或加护病房的重症患者(心脏衰竭，败血症，多器官功能衰竭)，肾移植，慢性肾病患者。NGAL在造影剂对肾损伤方面的检测也得到研究者的证实，在小儿心导管插入手术后，部分患者2h后就能在血液和尿液中检测到有NGAL升高，与之后2-3天血肌酐的升高密切相关。在成人患者中，造影后4h可以在患者尿液中检测到有NGAL异常升高，而在血液中2h就可发现NGAL异常升高。

目前，检测NGAL的方法主要有胶乳免疫比浊法、酶联免疫吸附法、免疫层析法等。胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。酶联免疫吸附法的酶容易失活，导致灵敏度不高，被标记物的空间结构易受到酶的大分子标记影响，使得灵敏度的提高受到限制；免疫层析方法操作简便，但其一方面其灵敏性不高；另一方面由于结合垫上标记物释放不均一、 NC膜的差异大、样品层析速度不可控等原因导致检测结果精密度不高。

为解决上述问题，如果能利用NGAL的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对急性肾损伤诊断的NGAL快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于急性肾损伤的监测，可以提高急性肾损伤诊断的准确率，则会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测NGAL的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术NGAL检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗NGAL抗体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗NGAL抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗NGAL抗体为针对NGAL不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗NGAL抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗NGAL抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗NGAL抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗NGAL抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗NGAL抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(NGAL)，5-抗NGAL 抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗NGAL抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗NGAL抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗NGAL抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗NGAL抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

8)4℃放置2h。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、3000ng/ml、5000ng/ml 的NGAL标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量NGAL标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算NGAL的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入NGAL浓度(ng/ml)	测量NGAL的浓度(ng/ml)	回收率(％)
				1	30	29.1	97.0
2	200	203.8	101.9
				3	1000	992.3	99.2
4	3000	3011.7	100.4

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为1ng/ml。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到NGAL阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到NGAL阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到NGAL阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25 μg/ml、50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的NGAL阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在96.0％-102.3％之间。表明基于双分子荧光互补技术的NGAL试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与九强NGAL乳胶免疫比浊试剂盒的相关性为：y＝0.993x-0.395，R²＝0.998。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗NGAL抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗NGAL抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗NGAL抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗NGAL抗体为针对NGAL不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗NGAL抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与NGAL抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的NGAL检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗NGAL抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与NGAL抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。