CN108226523A - 一种基于双分子荧光互补技术的kim-1检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的KIM‑1诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗KIM‑1抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗KIM‑1抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的KIM‑1诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗KIM‑1抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗KIM‑1抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作快速、特异性好、精密度好、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于急性肾损伤的监测，可以提高急性肾损伤诊断的准确率，具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒、制备及使 用方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内KIM-1的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)临床常见而严重，在美国，社区获得的AKI占总住院患者的1％，住院患者的AKI发生率0.15％～7.5％之间，远高于社区，而ICU病房的 AKI发生率高达5％～20％。我国没有大宗的流行病学调查，但各地报道的发生率均较高，例如北京大学医院报道冠状动脉搭桥术后的病人AKI发生率为27.94％。尽管临床治疗水平不断提高，但是AKI的发病率还在增长，其病死率也居高不下。而动物实验证明AKI是可以预防或通过多种措施治疗的，因此考虑AKI的高死亡率与缺乏广为接受的定义和标准，缺乏早期诊断的指标有关。目前应用最多的AKI定义是ADQI(acute dialysis qualithinitiative，ADQI) 组织于2002年制定的：肾功能在48h内急剧下降，表现为尿液肌酐(serum creatinine，Scr) 上升＞0.3mg/dl(26.4μmol/L)或Scr上升＞50％(达到基线的1.5倍)或尿量减少(＜0.5 ml·kg-1·d-1)超过6h，并将AKI分为5级(RIFLE分级)。可见Scr仍然是经典的诊断AKI 的指标，但Scr常受一些非肾脏因素影响，其数值变化常晚于早期肾损伤，不能准确、敏感地反映肾功能情况，使得一些可以恢复的AKI贻误了最佳治疗时机。因此，近年来众多的研究致力于寻找稳定敏感、能早于Scr和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)反应肾功能的具有诊断价值的生物标志物，希望对AKI进行早期干预，降低病死率。

近年来有研究发现，一些早期生物学标志物如胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(liverfatty acid binding protein， L-FABP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin， NGAL)、胱抑素C(cystatin C，Cys C)、肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)、白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)、神经轴突导向因子(netrin-1)，对于AKI的早期诊断、病情评估和预后判断，较血肌酐和尿量有明显的优势。

近年来发现334个氨基酸残基组成的跨膜蛋白肾损伤分子-1(kideny injurymolecule -1， KIM-1)存在于近端小管上皮细胞，其属于免疫球蛋白超家族。KIM-1是一种I型跨膜糖蛋白，表达于近曲小管，在正常肾组织和尿液中不表达。当肾损伤时，裂解释放在尿液中，使KIM-1 升高，Scr、BUN、NAG、尿糖、尿蛋白均未有明显改变时，尿中就很容易检测到KIM-1。在检测缺血及肾毒性物质引起的AKI时，KIM-1灵敏度很高，明显早于其他传统的标志物(如血肌酐、尿素氮)。在肾毒素损害肾小管的第1天，尿液中即可检测出KIM-1，而血肌酐及尿素氮3天后才会升高。心脏手术后发生AKI时，术后数小时即可出现KIM-1升高，并且不受慢性肾脏疾病和尿路感染的影响。由于其在肾小管损伤时升高明显，而在肾小球损伤时不表达，因此，尿KIM-1还可用于肾脏损伤病因学的鉴别诊断。此外研究还发现KIM-1是肾细胞癌的生物指标及肿瘤患者伽玛刀治疗中AKI的早期指标。

常用的KIM-1检测方法主要有酶联免疫吸附试验。该方法具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但该法的检测灵敏度较低，且操作时间长，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，KIM-1检测要求灵敏度很高，该法检测效果不佳。

为解决上述问题，如果能利用KIM-1的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对急性肾损伤诊断的KIM-1快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作快速、灵敏度高、检测快速、精密度高等优点；将其应用于急性肾损伤的监测，可以提高急性肾损伤诊断的准确率，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测KIM-1的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术KIM-1检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗KIM-1抗体为针对KIM-1不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗KIM-1抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗KIM-1抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗KIM-1 抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗KIM-1抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(KIM-1)，5-抗KIM-1抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗KIM-1抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗KIM-1抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗KIM-1 抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000 ng/ml的KIM-1标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10 分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量KIM-1标准品加入到正常人的标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算KIM-1的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入KIM-1浓度(ng/ml)	测量KIM-1的浓度(ng/ml)	回收率(％)
				1	1.0	1.05	105
2	10	10.2	102.0
				3	50	49.3	98.6
4	500	499.1	99.8

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01ng/ml。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到KIM-1阳性标本中，使标本中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到KIM-1阳性标本中，使标本中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到KIM-1阳性标本中，使标本中胆红素的含量分别为25μg/ml、50 μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的KIM-1阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在96.3％-104.2％之间。表明基于双分子荧光互补技术的 KIM-1试剂在检测样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与R&D公司KIM-1试剂盒的相关性为：y＝0.9905x+1.1876，R²＝0.998。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗KIM-1抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗KIM-1抗体为针对KIM-1不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与KIM-1抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的KIM-1检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗KIM-1抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与KIM-1抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。