CN108226519A

CN108226519A - 一种基于双分子荧光互补技术的rbp检测试剂盒、制备及使用方法

Info

Publication number: CN108226519A
Application number: CN201711271922.6A
Authority: CN
Inventors: 徐林
Original assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Tianzong Yikang Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的RBP诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的RBP诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒、制备及使用方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内RBP的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol binding protei，RBP)是一种低分子量的亲脂载体蛋白，属 Lipocalin蛋白超家族成员。其功能是从肝脏转运维生素A至上皮组织，并能特异性地与视网膜上皮细胞结合为视网提供维生素A。RBP广泛存在于人体血液、尿液及其他体液中，由于其具有分子量小和半衰期短的特点，在肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察中有重要临床意义，又因RBP可特异地反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。

血清中90％的RBP与视黄醇结合形成复合物当RBP与靶细胞表面的受体结合时复合物解离，游离的RBP由肾小球滤出，大部分由近端小管上皮细胞重吸收，并被分解成氨基酸，供体内合成利用。急性肾功能衰竭或透析治疗时，体内RBP会发生一定的改变。急性肾功能衰竭时RBP患者血清RBP明显升高，可能与RBP的结构变化有关。RBP在体内有多种形式，分别为多肽链C末端失去1个残基的RBP1和失去2个残基的RBP2。正常人体内多为RBP1，而RBP2在体内一旦形成，即通过肾脏排出体外。当肾功能衰竭时，无法及时清除体内的RBP2，从而导致体内的RBP含量升高。85％的RBP与AP结合，形成复合物，不能被肾小球滤过，而剩下的15％可自由通过肾小球，正常情况下被肾小管重吸收。当肾脏疾患或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，尿中RBP浓度升高，血清RBP浓度下降。因此尿中RBP测定是诊断早期肾功能损伤和疗效判定的敏感指标。

RBP的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。其中单向免疫扩散法一般用于定性检测；酶免疫测定法操作时间长，且较繁琐，对实验员的要求较高；基于免疫层析的时间分辨荧光免疫法虽然灵敏度较高，但是CV较大，目前尚无解决的可行办法；放射免疫法因为放射污染，逐渐被淘汰；目前较多采用的颗粒增强免疫比浊法，技术已趋于成熟，操作简便，干扰因素少，但液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。

为解决上述问题，如果能利用RBP的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对肾脏疾病诊断的RBP快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测RBP的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术RBP检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗RBP体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗RBP抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗RBP抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗RBP抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗RBP抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(RBP)，5-抗RBP抗体， 6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗RBP抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗RBP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN 蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗RBP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC 蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

8)4℃放置2h。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、240μg/ml的RBP标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量RBP标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算RBP的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入RBP浓度(μg/ml)	测量RBP的浓度(μg/ml)	回收率(％)
				1	50	48.2	96.4
2	100	104.0	104.0
				3	150	142.6	95.1
4	200	205.0	102.5

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.7μg/ml。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到RBP阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到RBP阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到RBP阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25μg/ml、 50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的RBP阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在96.0％-102.3％之间。表明基于双分子荧光互补技术的 RBP试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与重庆中元RBP试剂盒的相关性为：y＝0.999x+0.055，R²＝0.999。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗RBP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗RBP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗RBP抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗RBP抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与RBP抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的RBP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗RBP抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与RBP抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。