糖尿病肾病早期检测试纸盒、生物标志物检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其是涉及一种糖尿病肾病早期检测试纸盒、生物标志物检测方法及应用。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病最严重的慢性微血管并发症之一,并最终引起终末肾衰竭,是糖尿病患者死亡的主要原因。据世界卫生组织2013年统计,全世界约有3.47亿人患有糖尿病,其中超过80%的糖尿病死亡病例发生在发展中国家。同时,世界卫生组织预测到2030年,全球因糖尿病死亡的人数将翻一番,其中30%~40%的2型糖尿病人将发展为糖尿病肾病,20%~40%的1型糖尿病患者在15~30年后也将发展为糖尿病肾病,造成了巨大且沉重的社会经济负担。
然而,糖尿病肾病早期很难发现,且临床糖尿病肾病诊断黄金标准肌酐和蛋白尿也只能间接反映肾脏实质性病变(肾小球系膜细胞扩增、基底膜加厚、足细胞损伤、肾小管上皮细胞及间质细胞损伤等),无法诊断早期糖尿病肾病(正常蛋白尿期,见下表1)。
表1:糖尿病肾病临床分期(基于Mogensen分期法)
肾穿刺活检技术虽可以辅助临床糖尿病肾病早期诊断,但该技术的创伤性较大,术后会引起并发症,且技术难度较高,不能作为糖尿病肾病患者检查的常规项目。通常当临床确诊时,糖尿病肾病患者错过了最佳的治疗时机,致使疾病急剧恶化,不可逆转。因此,积极寻找糖尿病肾病早期诊断标志物及其检测试剂盒,并进行早期干预具有重要的现实意义。
蛋白生物标志物(biomarker)是反映疾病存在和状态的一种可测量的指示物。在疾病、应激和康复的过程中,任何的生理变化最终都能在蛋白水平上得到体现,是疾病研究最直观的手段。当前蛋白分子标志物的检测已成为临床疾病早期诊断、疾病分型、药物靶标筛选及药物研发等最有效的方法。尿液是血液在经过肾小球过滤,肾小管及集合管重吸收、排泄及分泌而产生的代谢终产物,尿液中的蛋白种类及含量的高低直接反映了泌尿系统,尤其是肾脏的健康状态,可以用于预测糖尿病肾病发生、发展及预后的情况。同时,大量的研究发现,多个蛋白生物标志物组群与慢性病患者的临床及预后密切相关,表明同步联合测定多个蛋白因子有助于更全面的了解疾病进程。
发明内容
基于此,有必要提供一种可以用于区分早期糖尿病肾病的糖尿病肾病早期检测试纸盒、生物标志物检测方法及应用。
一种糖尿病肾病早期检测试纸盒,包括检测试剂和捕获试剂;
所述检测试剂包括第一检测试剂、第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂中的二个或三个,所述第一检测试剂的溶质为第一足糖萼蛋白抗体,所述第二检测试剂的溶质为第一Ⅳ型胶原蛋白抗体,所述第三检测试剂的溶质为第一肝型脂肪酸结合蛋白抗体,所述第四检测试剂的溶质为第一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体;
所述捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体、结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体中的二种或三种;
所述检测试剂与所述捕获试剂相互匹配。
在一个实施例中,所述检测试剂包括所述第一检测试剂和所述第四检测试剂;
所述捕获试剂的溶质包括所述结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体和所述结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
在一个实施例中,所述检测试剂包括所述第二检测试剂、所述第三检测试剂和所述第四检测试剂;
所述捕获试剂的溶质包括所述结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、所述结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和所述结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
在一个实施例中,所述检测试剂包括所述第一检测试剂、所述第二检测试剂、所述第三检测试剂和所述第四检测试剂;
所述捕获试剂的溶质包括所述结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体、所述结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、所述结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和所述结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
在一个实施例中,所述糖尿病肾病早期检测试纸盒还包括足糖萼蛋白标准品、Ⅳ型胶原蛋白标准品、肝型脂肪酸结合蛋白标准品和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。
在一个实施例中,所述第一足糖萼蛋白抗体为单克隆抗体,所述第二足糖萼蛋白抗体为多克隆抗体;
所述第一Ⅳ型胶原蛋白抗体为单克隆抗体,所述第二Ⅳ型胶原蛋白抗体为多克隆抗体;
所述第一肝型脂肪酸结合蛋白抗体为单克隆抗体,所述第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体为多克隆抗体;
所述第一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为单克隆抗体,所述第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为多克隆抗体。
一种生物标志物检测方法,采用如上述的糖尿病肾病早期检测试纸盒,其特征在于,包括如下步骤:
提供设有检测位点的基板,将检测试剂滴加在检测位点上,充分反应后将所述检测位点洗涤干净;
将洗涤干净后的所述检测位点封闭,封闭完成后将所述检测位点洗涤干净;
将待检测样本滴加在封闭完成并洗涤干净的所述检测位点上,充分反应后将所述检测位点洗涤干净;
将捕获试剂滴加在所述检测位点上,充分反应后将所述检测位点洗涤干净;以及
检测所述检测位点是否含有所述第一可检测标记成分、所述第二可检测标记成分、所述第三可检测标记成分和所述第四可检测标记成分,并且根据检测结果得到所述待检测样本中足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量。
在一个实施例中,将得到的所述待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量与截断值进行对比,当所述待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量均在截断值以上时判定为阳性,此外则判定为阴性。
在一个实施例中,将得到的所述待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量与截断值进行对比,当所述待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量至少有一个在截断值以上时判定为阳性,此外则判定为阴性。
在一个实施例中,所述待检测样本包括治疗前样本和治疗后样本;
将得到的治疗前样本中足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量与治疗后样本中的足糖萼蛋白抗体、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量进行对比,根据比对结果评估治疗方法的有效性。
足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中的二个或三个,作为生物标志物在制备肾损伤诊断试剂或肾损伤诊断装置中的应用。
这种糖尿病肾病早期检测试纸盒通过足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中的二种或三种作为生物标志物,可以根据实际检测结果,为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
附图说明
图1为一实施方式的生物标志物检测方法的流程图;
图2a为足糖萼蛋白在糖尿病肾病早期尿液中的验证图,*表示P<0.05;
图2b为Ⅳ型胶原蛋白在糖尿病肾病早期尿液中的验证图,*表示P<0.05;
图2c为肝型脂肪酸结合蛋白在糖尿病肾病早期尿液中的验证图,*表示P<0.05;
图2d为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在糖尿病肾病早期尿液中的验证图,*表示P<0.05;
图3a为足糖萼蛋白的ROC曲线图;
图3b为Ⅳ型胶原蛋白的ROC曲线图;
图3c为肝型脂肪酸结合蛋白的ROC曲线图;
图3d为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的ROC曲线图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对糖尿病肾病早期检测试纸盒、生物标志物检测方法及应用作进一步详细的说明。
足糖萼蛋白(podocalyxin)是O连接的跨膜糖蛋白,位于肾脏足细胞足突顶膜区,是肾小球基底膜电荷屏障的主要成分,保证肾小球滤过膜电荷屏障的完整性,在肾脏滤过功能中发挥着重要作用。
Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)是肾小球基底膜及系膜基质的重要组称成分,在肾小球基底膜滤过完整性中发挥着重要作用。糖尿病人高血糖刺激产生Ⅳcollagen,若增加的Ⅳ collagen沉积到糖尿病人肾脏肾小球系膜基质上,会产生弥散性肾小球硬化症;若沉积到肾小球基底膜或肾小管上,会导致系膜扩增、肾小球间质化和肾小管损伤。
肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)在肾近端小管细胞内表达,参与肾小管间质细胞能量产生及代谢过程。在糖尿病肾病并发过程中,尿液中L-FABP表达水平与尿白蛋白浓度成正相关,预示着尿液中L-FABP是肾小管间质细胞损伤的生物标志物。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是一种铁离子结合蛋白,在肾小管内皮细胞中表达,参与多种生物学功能,如细胞凋亡、天然免疫、肾脏生长发育等。在糖尿病肾病早期,NGAL在尿液中出现高表达,且NGAL表达量的增加与肾小管近端小管的损伤呈正比,预示着尿液中NGAL是肾小管间质细胞损伤的生物标志物。
因此,足糖萼蛋白(podocalyxin)和Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)可以作为肾小球损伤的生物标志物,肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)可以作为肾小管损伤的生物标志物。
本申请中选择上述4种生物标志物用于糖尿病肾病早期诊断,检测这4种生物标志物,根据这4种生物标志物的含量,为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
一实施方式的糖尿病肾病早期检测试纸盒,包括基板、检测试剂和捕获试剂。
检测试剂包括第一检测试剂、第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂中的二个或三个。
第一检测试剂的溶质为第一足糖萼蛋白抗体,第二检测试剂的溶质为第一Ⅳ型胶原蛋白抗体,第三检测试剂的溶质为第一肝型脂肪酸结合蛋白抗体,第四检测试剂的溶质为第一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体、结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体中的二种或三种。
检测试剂与捕获试剂相互匹配。这里,检测试剂与捕获试剂相互匹配的意思具体为:检测试剂包括第一检测试剂(或第二检测试剂,或第三检测试剂,或第四检测试剂)时,捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体(或结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体,或结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体,或结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体)。
优选的,检测试剂包括第一检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
优选的,检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
基板上设有检测位点,基板可以为硝酸纤维素膜、尼龙膜或玻璃基片。本实施方式中,基板选择硝酸纤维素膜。基板可以省略,在上述糖尿病肾病早期检测试纸盒使用时,搭配其他公司售卖的基板即可。
本实施方式中,检测位点包括第一检测位点、第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点,第一检测位点对应第一检测试剂,第二检测位点对应第二检测试剂,第三检测位点对应第三检测试剂,第四检测位点对应第四检测试剂。
本实施方式中,第一检测位点、第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点均为4个,通过重复试验避免误差。
这种糖尿病肾病早期检测试纸盒可以根据实际检测结果,为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
糖尿病肾病早期检测试纸盒还包括足糖萼蛋白标准品、Ⅳ型胶原蛋白标准品、肝型脂肪酸结合蛋白标准品和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品,这四种标准品均购自北京傲锐东源生物科技有限公司。对应的,基板上还需要设有第一阳性对照位点、第二阳性对照位点、第三阳性对照位点和第四阳性对照位点,足糖萼蛋白标准品对应第一阳性对照位点,Ⅳ型胶原蛋白标准品对应第二阳性对照位点,肝型脂肪酸结合蛋白标准品对应第三阳性对照位点,中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品对应第四阳性对照位点。
第一可检测标记成分可以为酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。第二可检测标记成分可以为酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。第三可检测标记成分可以为酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。第四可检测标记成分可以为酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质。
本实施方式中,第一可检测标记成分、第二可检测标记成分、第三可检测标记成分和第四可检测标记成分均为辣根过氧化物酶(HRP)。
本实施方式中,糖尿病肾病早期检测试纸盒还包括检测液。检测液的溶质为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。
本实施方式中,第一足糖萼蛋白抗体(购自Sigma公司,货号:AMAB90667)为单克隆抗体,第二足糖萼蛋白抗体(购自Sigma公司,货号:SAB2500809)为多克隆抗体。
本实施方式中,第一Ⅳ型胶原蛋白抗体(购自Sigma公司,货号:C1926)为单克隆抗体,第二Ⅳ型胶原蛋白抗体(购自Abcam公司,货号:ab6586)为多克隆抗体。
本实施方式中,第一肝型脂肪酸结合蛋白抗体(购自Sigma公司,货号:WH0002167M1)为单克隆抗体,第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体(Abcam公司,货号:ab101837)为多克隆抗体。
本实施方式中,第一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(购自Abcam公司,货号:ab23477)为单克隆抗体,第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(Abcam公司,货号:ab166677)为多克隆抗体。
这种糖尿病肾病早期检测试纸盒通过足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白作为生物标志物,可以根据实际检测结果,为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
如图1所示的一实施方式的生物标志物检测方法,采用上述的糖尿病肾病早期检测试纸盒,包括如下步骤:
S10、提供设有检测位点的基板,将检测试剂滴加在检测位点上,充分反应后将检测位点洗涤干净。
检测试剂包括第一检测试剂、第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂中的二个或三个。
第一检测试剂的溶质为第一足糖萼蛋白抗体,第二检测试剂的溶质为第一Ⅳ型胶原蛋白抗体,第三检测试剂的溶质为第一肝型脂肪酸结合蛋白抗体,第四检测试剂的溶质为第一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体、结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体中的二种或三种。
检测试剂与捕获试剂相互匹配。这里,检测试剂与捕获试剂相互匹配的意思具体为:检测试剂包括第一检测试剂(或第二检测试剂,或第三检测试剂,或第四检测试剂)时,捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体(或结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体,或结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体,或结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体)。
优选的,检测试剂包括第一检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第一可检测标记成分的第二足糖萼蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
优选的,检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
本实施方式中,检测位点包括第一检测位点、第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点,第一检测位点对应第一检测试剂,第二检测位点对应第二检测试剂,第三检测位点对应第三检测试剂,第四检测位点对应第四检测试剂。
以检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为例,S10具体为:将第二检测试剂滴加在第二检测位点,将第三检测试剂滴加在第三检测位点,将第四检测试剂滴加在第四检测位点,充分反应后分别将第一检测位点、第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点洗涤干净。
洗涤的操作可以采用传统PBS稀释液,具体可以为0.01mol/L PBS(pH=7.4)+0.05%吐温-20。
S20、将洗涤干净后的检测位点封闭,封闭完成后将检测位点洗涤干净。
以检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为例,S20具体为:分别将洗涤干净后的第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点封闭,封闭完成后分别将第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点洗涤干净。
封闭液可以将脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶于PBS(pH=7.4,0.01mol/L)得到。
S30、将待检测样本滴加在封闭完成并洗涤干净的检测位点上,充分反应后将检测位点洗涤干净。
以检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为例,S30具体为:将待检测样本分别滴加在封闭完成并洗涤干净的第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点上,充分反应后分别将第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点洗涤干净。
本实施方式中,待检测样本选择尿液样本。
一般来说,尿液样本在进行检测前,需要进行稀释,稀释倍数可以为100倍。
S40、将捕获试剂滴加在检测位点上,充分反应后将检测位点洗涤干净。
以检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为例,S40具体为:将捕获试剂分别滴加在第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点上,充分反应后分别将第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点洗涤干净。
S50、检测位点是否含有第一可检测标记成分、第二可检测标记成分、第三可检测标记成分和第四可检测标记成分,并且根据检测结果得到待检测样本中足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量。
以检测试剂包括第二检测试剂、第三检测试剂和第四检测试剂,捕获试剂的溶质包括结合了第二可检测标记成分的第二Ⅳ型胶原蛋白抗体、结合了第三可检测标记成分的第二肝型脂肪酸结合蛋白抗体和结合了第四可检测标记成分的第二中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为例,S50具体为:分别检测第二检测位点、第三检测位点和第四检测位点上是否含有第二可检测标记成分、第三可检测标记成分和第四可检测标记成分,并且根据检测结果确定待检测样本中是否含有Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。
这种肾损伤检测方法可以为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
具体的,可以先设置截断值,接着可以将得到的待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量与截断值进行对比。
(1)当待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量均在截断值以上时判定为阳性,此外则判定为阴性。这种判定方法适用于对初步筛查结果的进一步确认。
(2)当待检测样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量至少有一个在截断值以上时判定为阳性,此外则判定为阴性。这种判定方法适用于大人群样本的初步筛查。
上述二种判定方法各有优点,可以单独使用,也可以结合使用。
在一个优选的实施例中,用血肌酐(creatinine,Cr)校正后,Podocalyxin的浓度截断值为67.15ng/g Cr,CollagenⅣ的浓度截断值为2.945μg/g Cr,L-FABP的浓度截断值为4.75μg/g Cr,NGAL的浓度截断值为56.8μg/g Cr。
这种生物标志物检测方法还可以用于评估肾损伤治疗方法的有效性,具体为:待检测样本包括治疗前样本和治疗后样本;将得到的治疗前样本中足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量与治疗后样本中的足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量进行对比,根据比对结果评估治疗方法的有效性。
上述治疗方法的有效性的具体评估过程为:如果治疗后样本中的生物标志物的浓度与治疗前样本相比发现下降或者维持不变,则表明治疗有效;如果发现升高,且具有统计学显著意义,则表明无效。
这种采用上述的糖尿病肾病早期检测试纸盒的生物标志物检测方法,通过足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白作为生物标志物,可以根据实际检测结果,为肾损伤提供辅助判断,从而为区分早期糖尿病肾病提供辅助。
本申请发明人结合文献报道及研究试验,发现足糖萼蛋白(podocalyxin)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)与糖尿病肾病早期疾病的发生发展密切相关,同时利用蛋白芯片检测发现,在糖尿病肾病患者尿液中这4种标志物的含量显著高于正常对照(p<0.05),且随着疾病的发展而增加。
足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白还可以作为生物标志物在制备肾损伤诊断试剂或肾损伤诊断装置中得到应用。
同时检测Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)三种生物标志物,利用其联合变化对糖尿病肾病进行预测,可灵敏、特异的筛查早期糖尿病肾病,拥有较为广阔的市场应用前景。
同时检测Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)具有以下优点:1)从肾脏结构功能角度看,糖尿病肾病早期损伤可能发生于肾小球,亦可能发生于肾小管,本试剂盒选用的三种生物标志物既包含肾小球损伤特异生物标志物(Ⅳ型胶原蛋白),又包含肾小管损伤特异标志物(肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白),因此利用这三种生物标志物组合同时检测,有助于避免漏诊,实现糖尿病肾损伤早发现、早诊断;2)从糖尿病肾病分子通路上看,糖尿病肾病损伤机制涉及到多个分子通路,如肾脏纤维化(Ⅳ型胶原蛋白)、炎症反应(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)、氧化应激(肝型脂肪酸结合蛋白)等,从多个分子通路预测疾病,有助于糖尿病早发现;因此,同时检测Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白这三种生物标志物,并且通过选择合理的判定方法,大大提高了肾功能损伤检测的灵敏度和特异度。
以下为具体实施例,实施例中出现的各种仪器和试剂如果没有特别说明,均采用本领域常规仪器或试剂。
下面结合具体实施例对本申请的4种生物标志物的筛选、分析和应用做进一步的详细说明。
实施例1:糖尿病肾病早期诊断生物标志物的筛选及验证
一、实验方法
1、病理筛选
选取已知身体状况的受试者共205例,其中健康对照50例,2型糖尿病患者155例(其中所有患者患糖尿病年限均大于2年);并按照蛋白尿情况对155例糖尿病患者进行划分,其中正常蛋白尿患者61例,微量蛋白尿患者52例,大量蛋白尿患者42例。MDRD GRF公式估算肾小球滤过率(eGFR)。
注:本研究已被伦理审核机构批准,所有受试者均签署知情同意书。
2、尿标本的收集和处理
用无菌容器收集受试者清晨第一次排出的尿液样本(30mL),4℃8000g离心30min,取上清,储存于-80℃用于蛋白组学实验。所有尿液标本均在未使用任何药物治疗前收集。在进行蛋白组学实验时,将同一分期来自不同患者的尿液样本混合,用于蛋白组学研究。
3.iTRAQ定量蛋白组学技术
利用ProteoMinerTM蛋白富集试剂盒(Bio-Rad,货号:163-3006)去除高丰度蛋白,冷丙酮/三氯乙酸法提取尿液总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。按照iTRAQ标记试剂盒(Applied Biosystem Inc.货号:MS10016)操作步骤处理、标记不同组尿蛋白样本。操作步骤简述如下:取各组尿蛋白样本各100μg,每管分别加入预冷的丙酮(丙酮:样本体积比=6:1),-20℃沉淀1小时,12000rpm超速离心15min后将沉淀重悬于20μL溶解缓冲液中。还原、封闭尿蛋白中的半胱氨酸,胰酶消化,然后利用iTRAQ标记试剂114、115、116、117分别标记正常蛋白尿患者、微量蛋白尿患者、大量蛋白尿患者和正常对照的尿蛋白。等量混合标记后的尿蛋白肽,依次利用强离子交换层析、反向层析进行分离,质谱技术进行分析(SCX-RPLC-MS/MS),Mascot软件鉴定尿液中的蛋白,寻找疾病组和对照以及疾病组之间差异表达蛋白。
4、ELISA法验证差异表达蛋白
利用ELISA技术确认寻找到的差异蛋白(足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)在正常对照和各疾病组尿液中的表达量,旨在验证质谱技术结果的准确性及这些差异蛋白作为糖尿病肾病早期生物标志物(Biomarker)的准确性。具体地说,利用稀释缓冲液将尿液1:100稀释,然后利用针对不同蛋白生物标志物的ELISA板测量不同疾病组尿液中生物标志物的含量,每个样本重复测量三次。
5、统计分析
数据用SPSS 14.0软件(Statistical Product and Service Solutions,“统计产品与服务解决方案”软件)处理,以平均值±标准差表示。用方差分析(Analysis ofVariance,ANOVA)进行正态分布数据的组间比较;用受试者工作特性曲线(ROC)分析各种生物标志物预测的准确性、特异性及灵敏性。P<0.05表示具有显著统计学差异。
6、4种生物标志物综合检测早期糖尿病肾病
糖尿病肾病是一种复杂并发症,在糖尿病肾病初期可能会导致肾小管损伤,或者导致肾小球损伤。本申请中的4种生物标志物,其中足糖萼蛋白和Ⅳ型胶原蛋白主要反映肾小球损伤;肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白主要反映肾小管损伤。为准确的诊断早期糖尿病肾病,本实验组合使用二种或二种以上生物标志物,采用(1)和(2)的判定方法进行综合判定。
(1)组合中所含的所有生物标志物均为阳性(截断值以上)时判定为阳性,除此以外判定为阴性。这种判定方法适用于对初步筛查结果的进一步确认。
(2)组合中所含的生物标志物有一个为阳性(截断值以上)时即判断为阳性,除此以外判断为阴性。这种判定方法适用于大人群样本的初步筛查。
本研究发现,生物标志物组合的种类和数量的差异,会导致疾病诊断灵敏度和特异度不同。因此可以选择最佳的生物标志物组合来诊断早期糖尿病肾病。
二、结果
1、受试者基本信息
如下表2所示。
表2:质谱实验受试者身体状况及生化指标
注:ND:No Difference;*p<0.001vs.健康对照;#p<0.001vs正常蛋白尿患者;§p<0.001vs微量蛋白尿患者,HbA1C为糖化血红蛋白,Serum Cr指血肌酐;UACR指尿白蛋白与肌酐比值。
2、尿液蛋白组学结果描述
前期筛选阶段,蛋白组学实验2次重复分别鉴定到465和478个蛋白,在两次实验中共同鉴定到322个蛋白。在两次实验中114/117(正常蛋白尿组/正常对照)、115/117(微量蛋白尿组/正常对照)及116/117(大量蛋白尿组/正常对照)iTRAQ比值均显示出差异表达的蛋白共62个(ratio<0.667或ratio>1.5)。因本发明旨在寻找糖尿病肾病早期(正常蛋白尿期或Ⅰ和Ⅱ期)生物标志物,对发生差异表达的62个蛋白进行进一步分析,结果发现有15个蛋白在糖尿病肾病组的不同分期发生差异表达(ratio<0.667或ratio>1.5)。
通过文献报道和生物信息学分析(Gene Ontology和KEGG Pathway分析)对15个鉴定到的差异表达蛋白进行进一步分析,发现足糖萼蛋白(podocalyxin)、Ⅳ型胶原蛋白(CollagenⅣ)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在糖尿病引起的肾病并发症病发过程中发挥着非常重要的作用。
3、ELISA法验证差异表达蛋白
利用ELISA法验证尿液蛋白组学实验筛选出的差异表达蛋白:足糖萼蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、肝型脂肪酸结合蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,得到下表3。
表3:ELISA验证4种糖尿病肾病早期标志物
注:ND:No Difference;*p<0.001vs.健康对照;★p<0.05vs健康对照;#p<0.001vs正常蛋白尿患者;§p<0.001vs微量蛋白尿。
由表3和图2a~图2d可以看出,糖尿病组尿液中足糖萼蛋白(podocalyxin)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的表达量显著高于健康对照,且随着患者病情的严重(蛋白尿增加)而增加。
对肾小球滤过率、蛋白尿与4种蛋白标志物的相关性分析,得到下表4。
表4:肾小球滤过率、蛋白尿与4种蛋白标志物的相关性分析
由表4可以看出,上述4种蛋白的表达量和尿蛋白呈显著正相关,与eGFR呈显著负相关。
利用受试者工作特性曲线(ROC)分析糖尿病肾病患者和健康对照尿液中的四种生物标志物,得到图3a~图3d。
由图3a~图3d可以得到下表5。
表5:四种生物标志物ROC曲线分析
由表5可以看出,podocalyxin、Collagen Ⅳ、L-FABP和NGAL曲线下面积(AUC)分别为0.892(p<0.01)、0.858(p<0.01)、0.907(p<0.01)和0.901(p<0.01)。敏感性和特异性分析显示,当选取最高“youden”指数时,尿液中四种生物标志物的灵敏度、特异度和浓度截断值分别为:podocalyxin(灵敏度89.8%;特异度为76.2%;浓度截断值为67.15ng/g creatinine)、Collagen Ⅳ(灵敏度71.2%;特异度为90.5%;浓度截断值为2.945μg/g creatinine)、L-FABP(灵敏度79.6%;特异度为95.2%;浓度截断值为4.75μg/g creatinine)和NGAL(灵敏度84.7%;特异度为85.8%;浓度截断值为49.85ng/mL)。
以上结果表明这4种蛋白分子可能参与了糖尿病肾病病发过程,为可信的早期糖尿病肾病生物标志物。
4、糖尿病肾病早期诊断方法
在进行糖尿病诊断时,可通过健康对照的测定结果及四种蛋白分子浓度截断值来确定这4种蛋白标志物相对含量参考正常范围,结合四种生物标志物测量结果,若其中任何一种蛋白浓度超出正常范围则可初步诊断为早期糖尿病肾病;同时结合GFR、蛋白尿等指标对早期糖尿病肾病进行综合评估。
5.多种生物标志物组合进行糖尿病肾病早期诊断
将尿中四种生物标志物进行组合来诊断早期糖尿病肾病的灵敏度和特异度。其中将NGAL测量值用Cr校正,通过ROC曲线分析其截断值。尿中NGAL浓度截断值为56.8μg/g Cr;尿中L-FABP浓度截断值为4.75μg/g Cr;尿中Collagen Ⅳ浓度截断值为2.945μg/g Cr;尿中podocalyxin浓度截断值为67.15ng/g Cr。
对各种组合进行统计处理,比较不同组合的灵敏度和特异度,得到下表6。其中,在符号“∩”表示的组合中,该组合所含的所有生物标志物均为阳性(截断值以上)时即判断为阳性,计算灵敏度和特异度。在符号“∪”表示的组合中,该组合所含的生物标志物有一个为阳性(截断值以上)时即判断为阳性,计算灵敏度和特异度。
表6:用于诊断早期糖尿病肾病蛋白生物标志物组合灵敏度和特异性
组合 |
灵敏度 |
特异度 |
IV Collagen∪NGAL |
0.933 |
0.665 |
IV Collagen∩NGAL |
0.55 |
0.942 |
IV Collagen∪Podocalyxin |
0.92 |
0.594 |
IV Collagen∩Podocalyxin |
0.547 |
0.983 |
NGAL∪Podocalyxin |
0.968 |
0.615 |
NGAL∩Podocalyxin |
0.527 |
0.941 |
L-FABP∪Podocalyxin |
0.923 |
0.505 |
L-FABP∩Podocalyxin |
0.541 |
0.969 |
IV Collagen∪NGAL∪L-FABP |
0.989 |
0.4707 |
IV Collagen∩NGAL∩L-FABP |
0.532 |
0.983 |
由表6可以看出,根据组合生物标志物种类和数量的变化,灵敏度和特异度也会发生变化。这表示根据实验目的选择生物标志物的组合,能高效、特异的用于疾病诊断。
灵敏度高的组合(IV Collagen∪NGAL;IV Collagen∪Podocalyxin;NGAL∪Podocalyxin;L-FABP∪Podocalyxin;IV Collagen∪NGAL∪L-FABP)适合于初次筛查;相反,特异度高的组合(IV Collagen∩NGAL;IVCollagen∩Podocalyxin;NGAL∩Podocalyxin;L-FABP∩Podocalyxin;IVCollagen∩NGAL∩L-FABP)适合二次检查或三次检查等需要进行可靠性更高的判断检查。例如,若在初次筛查时出现阳性,此时通过特异度较高的组合方法对初次检查结果进行二次判定,最终给出有效且可靠的早期糖尿病肾病诊断结果。
由表6可以看出,“NGAL和Podocalyxin”,“IV Collagen、NGAL和L-FABP”,这两个组合,可以通过选择合适的判定方法,获得较高的灵敏度和特异度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。