CN108136051A

CN108136051A - 检测不良局部组织反应(altr)坏死的方法

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Publication number: CN108136051A
Application number: CN201680058885.8A
Authority: CN
Inventors: C·戴尔曼吉安; K·卡多斯; J·W·斯特夫; T·若阿金; T·K·费林
Original assignee: Cd Diagnosis Of Ltd By Share Ltd
Current assignee: Cd Diagnosis Of Ltd By Share Ltd; CD Diagnostics LLC
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2018-06-08
Also published as: CA2994416A1; EP3331572A4; US20180045737A1; EP3331572A1; WO2017023929A1; AU2016301231A1

Abstract

本发明涉及接受关节置换的对象中不良局部组织反应(ALTR)的筛选和诊断领域，通过测量患有ALTR的患者、甚至没有症状的那些患者中升高的核酸或蛋白质生物标志物水平进行。ALTR的早期诊断可导致对其进行治疗，从而预防由ALTR引起的植入失败。升高的蛋白质和基因也是治疗ALTR的基础，并为药物开发和基础研究提供靶位。

Description

检测不良局部组织反应(ALTR)坏死的方法

相关申请的交叉参考

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2015年8月4日提交的美国临时申请62/200,885的优先权，其全部内容并入本发明作参考。

发明背景

在具有植入体如全髋关节置换术和髋关节面置换术的患者中可以发生不良局部组织反应(ALTR)。随着时间的推移，一些植入体周围的金属颗粒会对植入体和关节周围的骨和/或软组织造成损伤，导致ALTR。在具有金属对聚乙烯(metal-on-polyethylene，MOP)以及具有金属对金属(MOM)假体患者中可以发生ALTR，虽然MOM假体比MOP假体产生显著更少的磨屑。尽管磨损率降低，但例如在关节处的磨损、在锥形接头处的侵蚀和松散成分的磨损而产生的这些微粒碎屑产生可在血液中测量的可溶性金属离子。MOM髋关节基于承诺降低磨损率、增加假体的寿命并减少脱臼率而重新进入市场，因为这些设计可以解决全髋关节置换术中的磨损相关失败及允许更大直径的股骨头，其已被证明可以提高稳定性并降低脱臼率。

表示植入体的离子产生和肾排泄之间平衡的血液离子水平基于活动水平以及肾功能的变化而变化。功能良好的MOM植入体已示出增加血液中血清钴和铬(CoCr)离子水平。British Orthopedic Association提供的有关MOM植入体的医疗器械警告选择钴离子和铬离子水平为7ppb作为相关阈值。金属碎屑和长时间的全身暴露于增高的金属离子水平的细胞毒性尚不清楚。患者对金属碎屑具有可变的超敏反应，并且还可能具有可变金属离子暴露阈值水平，导致ALTR。发现在头颈锥度处缝隙腐蚀的酸性环境可能是除CoCr轴承磨损之外的一个因素。因此，增加的轴承磨损加上锥度增加的磨损和离子释放可能导致更多的细胞毒性碎屑和增加的血清离子水平。

目前的证据提示测量血液中的离子水平作为MOM植入体患者的ALTR的量度是不可靠的，并且增加离子水平与组织损伤不相关。Fehring et al.,2015,Journal ofArthroplasty,30:107-109。有症状或无症状MOM植入体患者的临床评估和治疗很困难。Lombardi et al.(J Bone Joint Surg Br.,2012,94(11Suppl A):14-8)确定了七种临床表现情境和一种复杂算法用于指导医疗决策。这个决策树中的关键因素包括植入体追踪记录、放射成像植入体位置、骨溶解的放射成像证据以及血液中的金属离子水平是否高于或低于7ppb。

除了测量血液和滑液金属离子水平外，超声和MRI以及金属伪影减少序列(MARS)已被用于评估继发于金属磨损碎屑的关节周围反应。尽管有金属减少软件，但是这些扫描往往难以说明。尽管这些测试中的每一个都具有优点，但目前还没有描述需要紧急手术干预的关键问题即组织坏死的单一诊断测试可用。此外，尽管其具有良好的追踪记录，但是MOM植入体并发症仍具有相对较低的发生率并包括感染和ALTR。严重ALTR中的组织破坏可能非常广泛，难以修正。与ALTR相关的组织学观察包括巨噬细胞和淋巴细胞的浸润、组织坏死、骨溶解、巨大细胞、肉芽肿和假瘤。

相比之下，假体周围关节感染(PJI)几乎完全由中性粒细胞浓度的增加所致，这是机体对侵入微生物的主要反应。α防御素(AD)是由中性粒细胞产生的抗微生物蛋白质，因此AD浓度升高是PJI的生物标志物。PJI是单一疾病过程，即感染。相反，ALTR是由巨噬细胞和淋巴细胞介导的多种疾病机制所表现。因此，预计ALTR的生物标志物与PJI不同并是大量巨噬细胞和淋巴细胞而不是中性粒细胞的反映。

能够早期诊断、监测和区分ALTR和PJI的生物标志物的鉴别对整形外科界具有重要价值。

因此，本领域需要可靠的测试以在何时需要治疗性干预以防止致残性组织损伤的共同决策过程中指导外科医生和患者。本发明解决了这个需求。

发明简述

本发明提供了治疗具有植入体的测试对象中的不良局部组织反应(ALTR)的方法，所述方法包括：

a.请求测试以确定测试对象在得自测试对象的体液样品中是否具有至少一种ALTR生物标志物；

b.将所述测试对象的体液样品中的所述至少一种生物标志物的水平与对照水平进行比较，其中与所述对照水平相比，测试对象的体液样品中的所述至少一种生物标志物的水平的差异是测试对象ALTR的指示；及

c.其中当检测到ALTR时，测试对象经历治疗性干预。

本发明进一步提供了诊断和治疗具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

a.分析测试对象的体液样品中至少一种生物标志物的存在或不存在，其中如果检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断为患有ALTR；及

b.对诊断的测试对象进行诊断的治疗干预。

在本发明方法的某些实施方案中，所述生物标志物是选自如下的至少一种：中性粒细胞防御素1，C-反应蛋白，生长调节α蛋白，中性粒细胞弹性蛋白酶，白介素1-α，白介素6，白介素8，白介素12-β，白介素15，C-X-C基序趋化因子10，乳酸，瘦素，单核细胞趋化蛋白1，单核细胞趋化蛋白3，C-C基序趋化因子22，肿瘤坏死因子受体超家族成员11B，骨桥蛋白；血小板衍生生长因子B亚基，正五聚蛋白-3，肿瘤坏死因子α，血管内皮生长因子，肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1。

在其它实施方案中，所述至少一种生物标志物选自：白介素15，血小板衍生生长因子亚基B，骨桥蛋白，肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1。在其它实施方案中，所述至少一种生物标志物选自白介素15、血小板衍生生长因子亚基B和骨桥蛋白。

在其它实施方案中，所述至少一种生物标志物选自：白介素8，C-反应蛋白，白介素12-β，白介素15，单核细胞趋化蛋白1，单核细胞趋化蛋白3，正五聚蛋白-3和肿瘤坏死因子配体超家族成员6。

本发明进一步提供了诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过评定得自植入部位的体液样品中选自白介素15和肿瘤坏死因子配体超家族成员6的至少一种T细胞活性生物标志物的存在，评估测试对象的植入部位T细胞的存在与否，其中如果在所述样品中检测到所述至少一种生物标志物，则所述测试对象被诊断为具有ALTR；及

b.建议对测试对象进行治疗性干预。

本发明进一步提供了在具有植入体的测试对象中诊断ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过评定得自植入部位的体液样品中选自单核细胞趋化蛋白1和单核细胞趋化蛋白3的至少一种巨噬细胞的生物标志物的存在，评估巨噬细胞是否存在于测试对象的植入部位，其中如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

b.建议对测试对象进行治疗性干预。

本发明进一步提供了一种在具有植入体的测试对象中诊断ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过测量得自植入部位的体液样品中选自骨桥蛋白和血小板衍生生长因子亚基B的至少一种骨生长生物标志物的水平，分析测试对象的植入部位骨生长的存在，其中如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

b.建议对测试对象进行治疗性干预。

a.通过测量包括正五聚蛋白-3的至少一种生物标志物的水平，分析得自测试对象植入部位的体液样品的局部炎症反应的存在情况，

b.将测试对象体液样品中正五聚蛋白-3的水平与对照水平进行比较，其中当与对照水平相比，检测到来自植入部位的体液样品中正五聚蛋白-3水平的升高时，测试对象被诊断为具有ALTR；及

c.建议对测试对象进行治疗性干预。

a.通过测量包括C-反应蛋白的至少一种生物标志物的水平，分析得自对象植入部位的体液样品的全身炎症反应的存在情况；

b.将测试对象体液样品中C-反应蛋白的水平与对照水平进行比较，其中当与对照水平相比时，检测到来得自植入部位的体液样品中C反应蛋白的降低或相似水平及所述对象不具有表示感染的生物标志物水平升高，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

c.建议对测试对象进行治疗性干预。

a.通过使用特异于生物标志物的单克隆抗体分析测试对象的体液样品中所述生物标志物的存在，其中所述生物标志物的存在产生生物标志物-抗体复合物，该复合物使用检测剂检测；

b.当检测到所述检测剂时，为测试对象提供ALTR诊断；及

c.提供建议对测试对象进行治疗性干预。

本发明进一步提供一种在具有植入体的测试对象中区分ALTR与假体周围关节感染(PJI)的方法，所述方法包括：

a.请求测试以确定测试对象在得自测试对象关节的体液样品中是否具有ALTR或PJI的至少一种生物标志物；

b.将所述测试对象体液样品中至少一种生物标志物的水平与对照水平进行比较，其中与所述对照水平相比，测试对象体液样品中所述至少一种生物标志物的水平的差异是测试对象具有ALTR和PJI至少一种的指示；及

c.其中当指示ALTR和PJI之间有区别时，推荐适合于诊断的测试对象状况的治疗干预。

本发明进一步提供了一种在具有植入体的测试对象中区分ALTR与PJI的方法，所述方法包括：

b.使用算法分析测试对象体液样品中所述至少一种生物标志物的存在或水平，其中所述算法有助于区分测试对象中的ALTR与PJI；

c.使用另外的生物标志物使用所述算法进行进一步分析检测以确认(b)；及

d.其中当指示ALTR和PJI之间有差别时，推荐对诊断的测试对象进行治疗性干预。

在某些实施方案中，所述至少一种生物标志物包括IL-6、CRP、PDGF或OPN中的一或多种。在其它实施方案中，所述至少一种生物标志物包含IL-8和/或OPN。在某些实施方案中，另外的生物标志物包括PDGF。在多种实施方案中，PDGF AB/BB。

在本发明任何方法的某些实施方案中，所述治疗性干预是修正手术。

在本发明任何方法的某些实施方案中，所述体液样品包括选自血液、血清和滑液中的至少一种。

在本发明任何方法的某些实施方案中，所述植入体是假体。

在本发明任何方法的某些实施方案中，所述植入体是选自髋、器、肩、踝和腕中的至少一个。

在本发明任何方法的某些实施方案中，ALTR是选自超敏性、金属超敏性和组织坏死中的至少一种状况。

在本发明任何方法的某些实施方案中，具有植入体的测试对象中ALTR的指示或诊断具有至少45％的灵敏性和至少90％的特异性。

在本发明任何方法的某些实施方案中，所述对象是人。

本发明进一步提供了包含针对选自如下的至少一种生物标志物的抗体或寡核苷酸探针组及其使用说明的试剂盒：中性粒细胞防御素1，C-反应蛋白，生长调节α蛋白，中性粒细胞弹性蛋白酶，白介素1-α，白介素6，白介素8，白介素12-β，白介素15，C-X-C基序趋化因子10，乳酸，瘦素，单核细胞趋化蛋白1，单核细胞趋化蛋白3，C-C基序趋化因子22，肿瘤坏死因子受体超家族成员11B，骨桥蛋白；血小板衍生生长因子亚基B，正五聚蛋白-3，肿瘤坏死因子α，血管内皮生长因子，肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1，其中所述说明包括：

a.测量得自测试对象的体液样品中所述生物标志物的水平；

b.提供ALTR或PJI存在或不存在的指示；及

c.提供关于对象是否应该接受治疗干预的建议。

附图简述

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了举例说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而应该理解的是，本发明不限于附图中所示的实施方案的精确安排及手段。

图1A-1C是描述在初步筛选活动中用于分析滑液样品的99种ALTR生物标志物的测定法的一组表格。

图2是描绘关于ALTR生物标志物初步筛选活动中使用的个体样品的信息的表格。

图3是列出选择用于二次筛选的生物标志物的表格。

图4A-4B是示出初步筛选结果的一系列表格。图4A：在集合的对照样品如骨关节炎(OA)样品集合、无菌样品集合及假体周围关节感染(PJI)滑液样品集合以及5个测试样品(其为个体MOM滑液样品)中的99个独特生物标志物的结果。图4B：针对正五聚蛋白-3的初步筛选数据。使用来自Biorad的Luminex免疫测定试剂盒(Cat#171BL033M)进行分析。除非另有说明，单位以pg/ml表示。

图5A-5C是描述在二次生物标志物验证测定中分析的MOM样品的特征的一组表格。

图6A-6B是概括了涉及更少生物标志物(23)和更多数量样品(68个个体MOM，无菌，OA和PJI样品)的二次分析结果的一系列表格。图6A：生物标志物1-11的列表。图6B：生物标志物12-23的列表。在此二次分析中，使用2种不同的试剂盒进行两次IL-6测定。组间截断浓度值以及临床灵敏性和特异性通过对数据进行对象操作特征(ROC)曲线分析确定。相对于截断值的阳性反应以红色表示。S/CO-信号-截断值。除非另有说明，单位为pg/ml。

图7A-7P是一系列点图，示出在无菌、MOM、OA和PJI样品中分析15种生物标志物，其中虚线指示ROC截断值。

图8是列出了16种独特MOM生物标志物的截断浓度值以及临床灵敏性和特异性的表格。这些值是通过使用无菌样品或所有对照(无菌、OA和PJI)的接受者操作特征(ROC)曲线分析确定的。AUC表示曲线下面积。

图9A-9H示出对MOM样品中PDGFB和IL-15生物标志物进行ROC分析的一系列点图。

图10A-10D是示出在无菌样品对MOM样品中及在所有对照样品对MOM样品中的PDGFB和IL-15生物标志物进行ROC分析的一系列点图。

图11A-11C是示出在无菌样品对MOM样品及所有对照样品对MOM样品中IL-6(1)和IL-8生物标志物进行ROC分析的一系列点图。

图12是描绘在不同截断值诊断MOM样品的生物标志物C-反应蛋白(CRP)的灵敏性和特异性的表格。

图13是描绘诊断ALTR的由多种蛋白质组成的生物标志物的灵敏性和特异性的表格。

图14是示出在ALTR、MOP、无菌和PJI样品中IL-8生物标志物的点图，ROC截断值用虚线表示

图15是在ALTR、MOP、无菌和PJI样品中IL-6、CRP、PDGF和OPN生物标志物的一系列点图，其中用虚线表示ROC截断值。这些生物标志物可用于区分ALTR和PJI。

图16是示出在ALTR、无菌、MOP和PJI样品中作为ALTR和PJI的生物标志物组合的IL-8和OPN的散点图，其中每个相应的ROC截断值以虚线表示。

图17概述了在ALTR、无菌、MOP、PJI、类风湿性关节炎(RA)和创伤/损伤样品中IL-8和OPN生物标志物的反应。IL-8和OPN可用于筛选ALTR。

图18概述了ALTR确证试验并包括展示在ALTR、无菌、MOP和PJI样品中PDGF生物标志物的ROC分析的点图。

发明详述

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的测试实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。在对本发明进行描述和权利要求中，将使用以下术语。

还应该理解的是，这里使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。

冠词“一个”在本文中用于指一个或超过一个(即至少一个)对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素。

当涉及如数量、时间距等可测量值时，本文所用术语“大约”意指涵盖特定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％及还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所揭示的方法。

当在生物体、组织、细胞或其组分的语境中使用时，术语“异常”是指与展示“正常”(预期的)相应特征的生物体、组织、细胞或其组分在至少一种可观察或可检测特征(例如年龄、治疗、时间天数等)不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型是正常或预期的特征可能对于不同的细胞或组织类型是异常的。

本文使用的术语“不良局部组织反应”或“ALTR”意指与植入体相关的不良事件，包括但不限于与异常磨损相关的软组织肉眼可见色素沉着(金属沉着病)、巨噬细胞浸润(先天免疫性)、无菌性淋巴细胞主导的血管炎相关病变(ALVAL)、假体周围骨质溶解/无菌性松动、组织坏死和某些形式的超敏反应。术语“对金属碎屑的不良反应(ARMD)”是一种ALTR，是指假体周围局部软组织和/或骨炎症和组织损伤，包括炎性细胞浸润，伴有或不伴有广泛软组织坏死，及血管变化。

如本文所用，术语“改变”、“缺陷”、“变异”或“突变”是指细胞中基因的影响其编码的多肽的功能、活性、表达(转录或翻译)或构象的突变。本发明涵盖的突变可以是细胞中基因的任何突变，其导致编码多肽的功能、活性、表达或构象的增强或破坏，包括编码蛋白完全不存在表达，且可以包括例如错义和无义突变、插入、缺失、移码和不成熟终止。不受此限制，本发明涵盖的突变可改变mRNA剪接(剪接位点突变)或者引起读框的移位(移码)。

术语“扩增”是指样品中存在的靶核苷酸序列的拷贝数倍增的操作。

如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883；Birdet al.,1988,Science,242:423-426)。

如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有天然发生构象的抗体分子中的两种类型多肽链中的较大的链。

如本文所用，“抗体轻链”是指存在于所有天然发生构象的抗体分子中的两种多肽链中较小的链，κ和λ轻链是指两种主要抗体轻链同种型。

如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应该解释为已经通过合成编码抗体的DNA分子产生的抗体，该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列使用本领域可用且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

如本文关于抗体所用术语“特异性结合”是指抗体识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其它分子。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的该抗原。但是，这种交叉物种反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合一种抗原的抗体也可以结合所述抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二个化学物种的相互作用，意指所述相互作用取决于在所述化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合特定蛋白质结构而不是蛋白质。如果一种抗体特异于表位“A”，则在含有标记的“A”的反应中存在含有表位“A”(或者游离的未标记的A)的分子和所述抗体将减少与所述抗体结合的标记的A的量

术语“施药器”在本文中使用时表示用于将本发明组合物给予对象的任何装置，包括但不限于皮下注射器、移液管、离子透入装置、贴片等。

“聚集”是指将独立但相似的单位如蛋白质、颗粒、部分或机体集合或簇集在一起。

如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为结合免疫系统受体并引起免疫应答的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生，或者特定的免疫活性细胞的激活或者这二者。本领域技术人员将会理解任何大分子包括几乎所有蛋白质或肽都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解任何DNA包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以激发期望的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或者可以衍生自生物样品。这样的生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学液体。

根据本发明，术语“自身抗原”是指被免疫系统错误识别为外来抗原的任何自身抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

如本文所用，“生物样品”或“样品”是指分离自个体的生物材料。生物样品可以含有适于检测希望的生物标志物的任何生物材料，且可以包含得自个体的细胞和/或非细胞材料。生物样品可以是任何生物组织或液体。样品通常是“临床样品”，是得自患者的的样品。典型的临床样品包括但不限于体液样品如滑液、痰液、血液、尿液、血浆、血清、汗液、粘液、唾液、淋巴液、支气管抽吸液、腹膜液、脑脊液和胸膜液，及组织样品例如血细胞(例如白细胞)、组织或细针活检样品及来自其中的脓液或细胞。生物样品还可以包括组织切片，例如为了组织学目的而获取的冷冻切片或福尔马林固定切片。

如本文所用，本发明上下文中的“生物标志物”包括但不限于蛋白质、核酸和代谢物，以及其多态性、突变、变体、修饰、亚基、片段、蛋白质-配体复合物，及降解产物、蛋白质-配体复合物、元件、相关代谢物，及得自其它分析物或样品的测量。生物标志物还可以包括突变的蛋白质或突变的核酸。生物标志物还包括健康状态的非血源性因素或非分析物生理标志物，例如临床参数，以及传统的实验室风险因素。根据美国食品和药物管理局(FDA)的定义，生物标志物是一种特征(如可测量的DNA和/或RNA)，“其作为正常生物过程、致病过程或者对治疗干预及其它干预的药理反应的指标而被客观地测量和评估”。生物标志物还包括以数学方式创建的任何计算指数或者任何一个或多个前述测量的组合，包括时间趋势和差异。

如本文所用，“生物传感器”是用于检测样品中的分析物的分析装置。生物传感器可包括可识别或捕获特定分析物的识别元件以及将分析物的存在或不存在传送为可检测信号的传感器。

如本文所用，与一或多种生物标志物相关的术语“数据”或者术语“生物标志物数据”通常是指反映样品中生物标志物的产物的绝对和/或相对丰度(水平)的数据。如本文所用，与一或多种生物标志物相关的术语“数据集”是指表示参考对象群体中一组生物标志物的一或多种生物标志物产物的每一种的水平的一组数据。数据集可用于生成本发明的公式/分类器。根据一个实施方案，数据集不需要包括所述参考群体所述组的每个个体的每个生物标志物产物的数据。例如，当数据集用于公式中时，“数据集”可以是指表示在一个或多个参考群体中每个个体的每个生物标志物的产物水平的数据，但是正如所理解的还可以是指表示所述一个或多个参考群体每个中99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或更少的个体的每个生物标志物的水平的数据并且仍然可以用于应用于公式的目的。

如本文所用术语“对照水平”是指来自不具有被测试状况的对象样品中的生物标志物水平。术语“对照水平”在本文中也被解释为是指得自超过一个不具有正在测试的状况的对象的样品中的内源性生物标志物的平均水平。因此，如本文所用，术语“内源性生物标志物”涉及在对照样品例如在对照/正常/健康个体中天然存在的生物标志物的水平。术语“对照水平”在本文中也被解释为指通过计算来自不具有被测试状况的假设对象组的样品中这种生物标志物水平而获得的参考生物标志物水平。“对照水平”在本文中也应解释为指在例如受感染的假体关节(假体周围关节感染，PJI)中的生物标志物水平，在这种情况下对照水平与具有例如来自MOM联合植入体的ALTR的对象中的生物标志物水平比较。因此，对照水平仅仅是对其测量测试水平的生物标志物的水平。其水平可以测量的对照生物标志物的例子包括但不限于可以在任何体液样品中测量的生物标志物，其中样品包括但不限于来自对象关节的体液样品，其中所述对象没有植入体，例如所述对象未经历关节置换(原生关节)，来自对象具有植入体的关节即假体关节但其中该关节未被感染(无菌关节)的体液，来自对象具有植入体的关节即假体关节其中该关节被感染(脓毒性关节或PJI)的体液等。对照生物标志物水平因此作为比较水平，可以将测试样品与其对比。

如本文所用，“检测分子”是可用于检测感兴趣化合物的分子。检测分子的非限制性实例是特异性结合感兴趣的化合物的分子，例如但不限于抗体、同源受体和小分子。

短语“确定标志物(或生物标志物)表达水平”是指使用本领域技术人员可用于检测任何标记足够部分的技术在核酸或蛋白质水平评定样品中标志物的表达程度。

“差异增加的表达”或“上调”是指与对照相比增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更高，和/或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更高以及其之间任何全部或部分增量。

“差异降低的表达”或“下调”是指与对照相比生物标记产物水平降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％、或50％、60％、70％、80％、90％或更低，和/或2.0倍、1.8倍、1.6倍、1.4倍、1.2倍、1.1倍或更低，以及其之间的任何全部或部分增量。

“疾病”是其中动物不能维持内稳态的动物健康状态，及其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康持续恶化。

如本文所用，术语“超敏性”或“超敏反应”涉及由正常免疫系统产生的一系列免疫反应，包括过敏和自身免疫性。这些反应可能会对宿主不利，导致损害、不舒服或偶尔致命。超敏反应需要宿主的预敏化(免疫)状态。植入体的存在可能会引发超敏性(例如金属超敏性)，并被定义为免疫反应，该反应由机体免疫系统的特定细胞应答某些植入体特别是金属(例如镍、钴和铬)而触发。虽然金属超敏性可以被认为是一种过敏类型，但它不会诱发当暴露于季节性或家庭过敏原如花粉、动物皮屑、霉菌等时发生的即时过敏症状。金属超敏性从暴露于这些材料会有延迟发作，且不是由导致常见过敏的典型症状(例如瘙痒、流泪或打喷嚏)的特定抗体或组胺释放导致。金属超敏性需要第一步致敏阶段，其中在与敏化剂如金属接触时，T细胞识别、激活、增殖并形成免疫记忆。与即时类型超敏性(通常来自食物过敏或蜜蜂螫伤)相比，一旦形成免疫记忆，则二次暴露于金属导致迟发型超敏性的所有典型炎症症状。由金属植入装置引起的一般金属超敏性症状可以是疼痛、肿胀、受累关节的范围和运动受损、关节渗出物、炎症和金属装置周围的过早骨质溶解(骨流失)。

如本文所用，“免疫测定”是指使用抗体与其同源抗原反应例如抗体与蛋白质的特异性结合来测量样品例如生物样品中物质的存在或浓度的生物化学测试。可以测量抗原的存在或者抗原存在的量这二者。

如本文所使用的，术语“植入体”是指插入或移植到机体中的任何材料，其维持支撑和组织轮廓，包括但不限于假关节、螺钉和板材。

如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其它表达媒介，其可用于表述试剂盒中本发明的组分在检测本发明揭示的生物标志物中的用途。例如，本发明试剂盒的指导说明材料可以贴在含有本发明组分的容器上，或者与含有该组分的容器一起装运。或者，这个说明材料可以与容器分开装运，有意图该说明材料与所述组分可以由接受者联合使用。

当在本文中使用时，术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合于探针以产生“标记的”探针。标记可以是测定的组分，且可以通过自身检测(例如放射性同位素标记、荧光标记或胶体金)，或者在酶标记的情况中可以催化可检测的底物化合物或组合物(例如辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺，HRP-TMB)的化学改变。在一些情况下，可以标记引物以检测PCR产物。术语“标签”与术语“标记”可互换使用。

一种或多种生物标志物的“水平”是指样品中生物标志物的绝对或相对量或浓度。

如本文所用，术语“生物标志物”或“标志物”是指可被检测到的分子。因此，根据本发明的生物标志物包括但不限于核酸、多肽、碳水化合物、脂质、无机分子、有机分子，其各自的大小和性质可以广泛地变化。“生物标志物”可以是与机体状况或疾病相关机体物质。“生物标志物”可以使用本领域已知的任何方式或通过先前未知的方式检测，所述未知方式仅在技术人员考虑标志物后变得显而易见。

本文使用的术语“生物标志物(或标志物)表达”包括基因的转录、翻译、翻译后修饰和表型表现，包括将在基因中编码的信息转化成RNA或蛋白质的所有方面。作为非限制性实例，标志物表达包括转录成信使RNA(mRNA)及翻译成蛋白质，以及转录为例如不被翻译成蛋白质的转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)的RNA类型。

术语“微阵列”和“阵列”广泛地指“DNA微阵列”(或“DNA芯片”)、“RNA微阵列”、“蛋白质微阵列”和“抗体阵列”涵盖本领域认可的所有固体支持物，以及本领域认可的所有用于将核酸分子附着于其上或用于在其上合成核酸和抗体的方法。优选的阵列通常包含多个不同的核酸探针，其在不同的已知位置与底物表面偶联。这些阵列，也被描述为“微阵列”或俗称“芯片”，在本领域中已经有一般性描述，见例如美国专利5,143,854、5,445,934、5,744,305、5,677,195、5,800,992、6,040,193、5,424,186及Fodoret al.,1991,Science,251:767-777所述，出于所有目的将所述专利和论文的全部内容并入本文作参考。使用高通量筛选小型化、多重化和并行处理和检测方法，阵列可用于评估大量生物材料。阵列通常可以使用各种技术生产，例如机械合成法或光导合成法，其包括光刻法和固相合成法的组合。使用机械合成方法合成这些阵列的技术在例如美国专利5,384,261和6,040,193中描述，出于所有目的将其全部内容并入本文中作参考。虽然优选平面阵列表面，但阵列可以制造在几乎任何形状表面或甚至多个表面上。阵列可以是在珠、凝胶、聚合物表面及纤维如光学纤维、玻璃或任何其它合适基质上的核酸或抗体。(见美国专利5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992，出于所有目的在此以其全部内容并入本文作参考)。阵列可以以允许诊断使用的方式包装，或者可以是全包装置；例如出于所有目的在此并入本文作参考的美国专利5,856,174和5,922,591所述。阵列可商购自例如Affymetrix(Santa Clara,Calif.)和Applied Biosystems(FosterCity,Calif.)，并且涉及多种目的，包括基因分型、诊断、突变分析、标志物表达，及针对各种真核生物和原核生物进行监测的基因表达。通过改变个体特征尺寸，可以改变固体支持物上探针的数量。在一个实施方案中，特征尺寸是20×25微米正方形，在其它实施方案中，特征可以是例如8×8、5×5或者3×3平方微米，从而导致约2,600,000、6,600,000或18,000,000个单独探针特征。

“测量”或者“检测”是指确定临床样品或对象衍生样品中指定物质的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包括这些物质的定性或定量浓度水平的推导，或以其它方式确定对象临床参数的值或分类。

术语“金属对金属”或“MOM”在本文中可互换使用，是指用于关节置换的一种植入体类型(例如全髋关节置换术或髋关节表面置换术)，其可以包含金属杆、颈、头、内衬和外壳(轴承表面)。在某些情况下，患有MOM症状的患者是指有症状/疼痛的关节植入体的患者。

术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可互换使用，是指适合于本文所述方法的任何动物或其无论是体外还是原位的细胞。在某些非限制性实施方案中，所述患者、对象或个体是人。

如本文所用，“多肽”是指其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-异构体。如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”是指涵盖任何氨基酸序列及包括修饰的序列如糖蛋白。术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”特别是指涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。应该指出，术语“多肽”或“蛋白质”包括蛋白质的天然存在的修饰形式，如糖基化形式。

生物标志物的“参考水平”是指表示特定疾病状态、表型或者无特定疾病状态、表型以及疾病状态、表型或者无特定疾病状态、表型的组合的生物标志物的水平。生物标志物的“阳性”参考水平是指表示特定疾病状态或表型的水平。生物标志物的“阴性”参考水平是指表示无特定疾病状态或表型的水平。

如本文所使用的术语“固体支持物”、“支持物”和“基质”可互换使用，是指具有一或多个刚性或半刚性表面的材料或材料组。在一个实施方案中，固体载体的至少一个表面基本上是平的，但是在一些实施方案中，可希望用例如孔、凸起区域、针(pins)，刻槽等物理地分隔不同化合物的合成区域。根据其它实施方案，固体支持物采用珠、树脂、凝胶、微球体、微板或其它几何构型的形式。参见美国专利5,744,305示例的基质。

如本文所用，术语“治疗性干预”是指目的在于减轻患者症状的治疗。该术语应该被解释为包括手术干预。

如本文所用，术语“手术干预”意指对对象进行手术以移除或替换植入体，例如移除或更换板或螺钉，或者及进行假体关节的手术修正。

如本文所用，术语“全髋关节置换术”或“THR”意指将植入体或装置植入对象中以替换现有的患病或受伤的髋。

如本文所用，术语“野生型”是指分离自天然来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常见的基因，因此被任意指定为该基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变体”是指与野生型基因或基因产物相比，示出修饰的序列和/或功能特性(即改变的特征)的基因或基因产物。注意到天然存在的突变体可以被分离；这些是通过与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征(包括改变的核酸序列)的事实鉴别的。

范围：在本发明揭示中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应该理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明范围的不可变的限制。因此，范围的描述应被视为具体特定揭示所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，如1至6的范围描述应该被认为特定揭示子范围如从1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管该范围的宽度如何都适用。

发明描述

本发明涉及在测试对象中诊断和/或治疗不良局部组织反应(ALTR)的方法。该方法包括监测关节体液或者其它体液样品中生物标志物的存在与或不存在，以及确定关节体液或其它体液中生物标志物的水平。本发明还包括区分测试对象中ALTR和PJI的方法。

发明方法

本发明提供了在具有植入体(例如假体，如MOM关节置换)的测试对象中诊断和/或治疗ALTR的一系列方法。

在一个实施方案中，本发明的方法包括请求测试以确定测试对象在得自测试对象的植入部位的体液样品中是否具有至少一种生物标志物。该测试可以分辨测试样品中所述生物标志物的存在与否，或者可以鉴定测试样品中生物标志物的水平，其与在本文定义的生物标志物的对照水平不同。测试样品优选来自测试对象的关节，即滑液，但也可以是任何体液，例如血液、血浆或血清。评估来自测试对象的至少一种生物标志物的水平并与对照水平比较，其中与对照水平相比，测试对象的体液样品中所述生物标志物的存在、不存在、水平增加或减少是测试对象中ALTR的指示。当检测到这种存在、增加或降低时，建议对测试对象进行治疗性干预(例如修正手术)。在一个实施方案中，本发明提供了用于在具有植入体(例如金属假体)的测试对象中诊断ALTR的方法。本发明的方法包括使用特异于生物标志物的多克隆(例如兔)和/或单克隆抗体分析测试对象的体液样品中是否存在生物标志物，其中生物标志物的存在产生生物标志物-抗体复合物，使用检测剂检测该复合物。当检测到检测剂时，诊断该测试对象具有ALTR，并建议对患者进行治疗，可包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了通过评估在植入部位T细胞的存在与否在具有植入体的测试对象中诊断ALTR超敏性或组织坏死的方法。本发明的方法包括评估得自植入部位的体液样品中是否存在选自白介素15和肿瘤坏死因子配体超家族成员6的至少一种T细胞活性生物标志物。如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断患有ALTR，因此推荐进行治疗性干预，可包括或不包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了通过评估在植入部位是否存在巨噬细胞而在具有植入体的测试对象中诊断ALTR的方法。本发明的方法包括评估得自植入部位的体液样品中选自单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白3和巨噬细胞炎性蛋白1-α的至少一种巨噬细胞生物标志物的存在。如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断患有ALTR，因此推荐进行治疗性干预，可包括或不包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了通过分析植入部位处的骨生长的存在而在具有植入体的测试对象中诊断ALTR的方法。本发明的方法包括测量得自植入部位的体液样品中选自骨桥蛋白和血小板衍生生长因子亚基B的骨生长、重塑、修复或伤口愈合的至少一种生物标志物的存在。如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断患有ALTR，因此推荐进行治疗性干预，可包括或不包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了通过分析得自植入部位的体液样品的局部炎症反应的存在以在具有植入体的对象中诊断ALTR的方法。本发明的方法包括测量得自植入部位的体液样品中正五聚蛋白-3的水平。如果与对照水平相比，在得自植入部位的体液样品中检测到正五聚蛋白-3水平增加，并且没有感染迹象，则测试对象被诊断患有ALTR，因此建议进行治疗性干预，可包括也可不包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了通过分析得自植入部位的体液样品的全身炎症反应的存在以在具有植入体的对象中诊断ALTR的方法。本发明方法包括测量得自植入部位的体液样品中C-反应蛋白的水平。如果与对照水平相比，在得自植入部位的体液样品中检测到C-反应蛋白水平降低或正常，并且对象具有表示ALTR的其它标志物的组合，则测试对象被诊断为具有ALTR，因此建议治疗性干预，可包括或不包括手术干预。在一些实施方案中，对象呈现的ALTR与选自超敏性、金属超敏性和组织坏死的至少一种状况有关。

在一个实施方案中，本发明提供了在具有植入体的测试对象中(例如已接受MOM关节置换的对象)诊断或预测ALTR的方法。所述方法包括检测得自测试对象关节的体液样品中至少一种核酸或蛋白质生物标志物的存在。在一些实施方案中，将得自测试对象的体液样品中的至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平与所述至少一种核酸或蛋白质生物标志物的对照水平进行比较，其中测试对象体液样品中体液样品中至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平与对照水平相比有差异，表示测试对象存在ALTR。在其它实施方案中，将在术前访视和修正手术之前期间的两或多个不同时间从测试对象采集的体液样品之间的至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平变化与所述至少一种核酸或蛋白质生物标志物的对照水平比较。在其它实施方案中，与对照水平相比，测试对象体液样品中至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平有差异表示测试对象存在ALTR。当检测到这种差异时，建议对对象进行手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了在具有植入体的测试对象中监测ALTR治疗有效性的方法。该方法包括检测得自测试对象关节的体液样品中至少一种核酸或蛋白质生物标志物的存在。在一些实施方案中，所述方法包括对比得自测试对象的体液样品中的至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平与所述至少一种核酸或蛋白质生物标志物的对照水平，其中与对照水平相比，测试对象的体液样品中所述至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平的差异表示测试对象中ALTR的治疗是有效的或无效的。

在一个实施方案中，本发明提供了在具有植入体的测试对象中区分ALTR和PJI的方法。本发明的方法包括请求测试以确定测试对象在得自测试对象的植入部位的体液样品中是否具有至少一种生物标志物。该测试可以区分测试样品中生物标志物的存在与否，或者可以鉴定测试样品中生物标志物的水平，其与如本文定义的生物标志物的对照水平不同。评估测试对象的至少一种生物标志物的水平并与对照水平比较，其中与对照水平相比，测试对象的体液样品中所述生物标志物的存在、不存在、水平增加或降低可以区分测试对象中的ALTR和PJI。当检测到这种存在、增加或降低时，其可以表示测试对象中的ALTR，并建议治疗性干预，可包括或不包括手术干预。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在具有植入体的测试对象中区分ALTR和PJI的算法。本发明的算法包括消除具有高阴性预测值的非ALTR/非PJI样品的第一测试，以及用于诊断ALTR和PJI的剩余样品的第二测试。当表明ALTR和PJI之间的区别时，推荐适合于诊断测试对象状况的治疗干预。在一些方面，第一测试可包括区分测试样品中一或多个生物标志物的存在与否，或者可鉴别其在测试样品中的水平与对照水平不同，其中所述一或多个生物标志物可包含IL-8和/或OPN。在一些方面，第二测试包括评估PDGF，及在一些方面包括评估PDFG AB/BB。(见图14-18)。

在其它实施方案中，所述方法包括对比在术前访视期间和修正手术前的两或多个不同时间收集的测试对象体液样品之间的至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平相对所述至少一种核酸或蛋白质生物标志物的对照水平的变化。

在其它实施方案中，与相同核酸或蛋白质生物标志物的对照水平相比，测试对象体液样品中至少一种核酸或蛋白质生物标志物的水平的差异表示在测试对象中ALTR的治疗有效或无效。

在进一步的实施方案中，当ALTR的治疗示出无效时，本发明的方法包括推荐选自以下的至少一种：治疗模式的改变、治疗类型的改变和/或对对象进行手术干预。

在一些实施例中，体液来自关节。在其它实施方案中，体液是血液、血清或滑液。

滑液的处理

滑液是在人体关节(例如膝、髋、肩、踝和腕)的滑膜腔中面向关节表面的软骨与滑膜之间发现的生物液。滑液为软骨提供营养，也可作为关节的润滑剂。软骨和滑膜的细胞(即滑膜细胞)分泌液体，液体润滑并减少关节表面之间的摩擦。

人体滑液由约85％的水组成。滑液来源于血浆的渗析液，血浆本身由水、溶解的蛋白质、葡萄糖、凝血因子、矿物质离子、激素等组成。蛋白质白蛋白和球蛋白存在于滑液中并被认为其在关节区域的润滑中起重要作用。其它蛋白质也存在于人体滑液中，包括糖蛋白如α-1-酸性糖蛋白(AGP)、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和lubricin。

存在于人滑液中的另一种化合物是透明质酸。透明质酸也被认为在润滑中起作用并且是导致滑液粘度的主要成分。

滑液可从期望的关节中抽取用于本发明的诊断系统。可以分析取出的滑液以确定关节中的局部状况。

滑液可以在没有任何预处理的情况下进行测试；然而，滑液具有固有的粘性，并且当样品被吸出或移液时存在显著问题。不希望受任何特定理论的束缚，理想的滑液的稀释剂能提取生物标志物和维持生物标志物处于可检测状态，并且包含能够将pH保持在6-8范围的缓冲剂。优选地，缓冲剂(例如磷酸盐，Tris)含有盐水作为基质(即NaCl)。在一个实施方案中，缓冲剂含有能够裂解滑液样品中细胞的洗涤剂。

洗涤剂是两性分子，意味着它们既含有具有脂肪族或芳香性质的非极性“尾部”，又含有极性“头部”。极性头部基团的离子性形成了洗涤剂广泛分类的基础；它们可以是离子型(带电荷，阴离子型或阳离子型)、非离子型(不带电荷)或两性离子型(带正电荷和负电荷基团但净电荷为零)。洗涤剂分子允许水不溶性疏水性化合物分散(混溶性)到水性介质中，包括膜蛋白质的提取和溶解。

在一个实施方案中，本发明的缓冲剂包括一种或多种非离子去污剂，包括但不限于正辛基-p-D-吡喃葡糖苷、正辛基-p-D-麦芽糖苷、ZWITTERGENT 3.14、脱氧胆酸盐；正-十二烷基蔗糖；正十二烷基-p-D-吡喃葡萄糖苷；正十二烷基-p-D-麦芽糖苷；正辛基-p-D-吡喃葡萄糖苷；正辛基-p-D-吡喃麦芽糖苷；正辛基-(3-D-硫代吡喃葡糖苷；正癸酰蔗糖；正癸基-p-D-吡喃麦芽糖苷；正癸基-p-D-硫代麦芽糖苷；正庚基-(3-D-吡喃葡萄糖苷；正庚基-(3-D-硫代吡喃葡萄糖苷；正己基-p-D-吡喃葡萄糖苷；正壬基-p-D-吡喃葡萄糖苷；正辛酰蔗糖；正辛基-p-D-5-吡喃葡萄糖苷；正十一烷基-p-D-麦芽糖苷；APO-10；APO-12；BigCHAP；脱氧Big CHAP；35；C12E5；Ci2E₆；C^Es；C12E9；环己基-n-乙基-p-D-麦芽糖苷；环己基-正己基-p-D-麦芽糖苷；环己基-n-甲基-p-D-麦芽糖苷；洋地黄皂苷；ELUGENT^TM；C-100；X-080；X-100；HECAMEG；MEGA-10；MEGA-8；MEGA-9；NOGA；NP-40；10F-127；X-100；X-l14；20；或者80。此外，离子洗涤剂可用于本发明的方法中，包括但不限于BATC、十六烷基三甲基溴化铵、鹅脱氧胆酸、胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、甘脱氧胆酸、葡糖石胆酸、月桂酰肌氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氢胆酸，牛磺石胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，和TOPPA。两性离子去污剂也可以用于本发明的组合物和方法中，包括但不限于酰胺磺基甜菜碱、CHAPS、CHAPSO、羧基甜菜碱和甲基甜菜碱。阴离子洗涤剂也可以用于本发明的组合物和方法，包括但不限于例如SDS、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、烷基-芳基磺酸盐、长链(脂肪)醇硫酸盐、烯烃硫酸盐和磺酸盐、α-烯烃硫酸盐和磺酸盐、硫酸化单甘油酯、硫酸醚、磺基琥珀酸盐、链烷磺酸盐、磷酸酯、烷基羟乙基磺酸盐，和蔗糖酯。通常，任何合适的液体(例如水)都可以用作本发明缓冲剂中的溶剂。液体可以是有机的或无机的，并且可以是纯液体、液体的混合物或液体中物质的溶液，及可以包含额外的物质以增强溶剂的性质。适用于全部或部分溶解机体样品的细胞组分的任何液体可以被认为是本文所用的裂解缓冲液。

在一个实施方案中，设计溶剂，使得可能存在于样品中的细胞、细胞碎片、核酸、多肽、脂质和其它生物分子溶解。在本发明进一步的实施方案中，可以设计溶剂以确保机体样品的特定组分的不同裂解，而其它组分不溶解。

在一些情况下，本发明的裂解缓冲液包含一种或多种防止样品内组分降解的试剂。这种组分可以例如包含酶抑制剂如蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂、DNA酶抑制剂、核酸酶(例如核酸内切酶和核酸外切酶)抑制剂等。蛋白酶抑制剂可例如包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂、碱性蛋白酶抑制剂或中性蛋白酶抑制剂。

在一个实施方案中，用于处理滑液的理想稀释剂含有能够将pH维持在大约5-9、优选约6-8、更优选约7-8范围内的缓冲剂。合适的但非限制性的缓冲剂包括HEPES、PIPES、Tris-盐酸盐(Tris-HCl)和MOPS。

取决于进行的后续纯化程序，稀释剂的任选组分可作为组合物的一部分或作为佐剂单独加入。任选的组分包括浓度约1％的消泡剂；可以使用酶如透明质酸酶溶菌酶、溶细胞酶、藤黄节杆菌酶、神经氨酸酶、链球菌溶血素、cellulysin、变溶菌素、几丁质酶、glucalase或溶葡萄球菌酶等，浓度为约0.1-5mg/ml；一种或多种无机盐，例如浓度为约1mM-5M的氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锂或氯化镨；蛋白酶抑制剂(例如苯甲基磺酰氟、胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、胃酶抑素A)，浓度为0.-10mM的还原剂(例如2-巯基乙醇和二硫苏糖醇)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、EGTA、CDTA，最优选浓度约1mM或更低)；一种或多种浓度范围为1-400ug/ml的核糖核酸酶(RNA酶A、T1、T2等)或前述的任何组合。DNase I浓度范围可以从1-100单位(10,000单位/mg)。可以将如Proclin950的防腐剂加入稀释剂中以保护包含滑液的溶液免于降解。

稀释剂还可以包括加入异嗜性和Rf因子阻断剂以消除临床样品中可能存在的抗物种抗体和Rf因子的影响。本发明的试剂和方法通常抑制干扰物干扰分析特定分析物。因此，希望基本上抑制样品中由干扰物(如果存在)引起的假阳性或假阴性信号。一方面，这样的干扰物可以是例如异嗜性抗体、类风湿因子、脂蛋白、纤维蛋白、凝血因子、IgE、人过敏原抗体、人抗小鼠免疫球蛋白、人抗山羊免疫球蛋白、人抗牛免疫球蛋白、人抗犬免疫球蛋白和人抗兔免疫球蛋白等。

一般来说，干扰因素(干扰物)如异嗜性抗体可能源自医源性和非医源性因素。前者可能是由于人体免疫系统对给予的“外来”蛋白质抗原的正常反应。诊断试剂或药物试剂的使用可导致导入这种蛋白质，及随后产生此类抗体。例如，小鼠单克隆抗体在人体内是外源蛋白质，在体内其可以引发免疫反应以产生人抗小鼠抗体。在已将小鼠单克隆抗体给予对象的许多情况中，这些对象已经产生了人抗小鼠抗体应答。

因此，希望处理滑液及获得这样的测定缓冲液，其：1)稀释滑液样品以增强吸移/转移样品的能力，2)任选裂解滑液样品中的所有细胞组分，3)保存滑液样品并稳定其中生物标记物，及4)使滑液样品中的干扰物质成为惰性/复合物/去除。

在一些情况下，希望在分析样品前离心(例如旋转)滑液样品。例如，如果滑液中存在一些血液污染或者如果样品含有微粒碎片，则希望在测定处理之前离心样品。

鉴别标志物或者生物标志物

本发明包括用于鉴定来自关节的体液样品中差异表达的核酸或蛋白质生物标志物的方法，其示出测试对象(即患者)由于植入体的原因(例如MOM关节置换术)正在经历ALTR(例如包括金属超敏性)。鉴定这些生物标志物的方法包括使用来自例如具有OA但没有任何关节手术的对象和/或经历关节置换手术的无症状对象(无菌)和/或来自进行关节置换手术的假体周围关节感染(PJI)对象的对照样品。

在一个实施方案中，关节可以是天然关节(例如OA、RA、痛风和假痛风)或者置换关节。

本发明考虑通过多分析物测定分析(MAP)或通过全基因组核酸微阵列鉴定差异表达的生物标志物，以鉴定在非ALTR关节和ALTR关节之间差异表达的生物标志物。本发明进一步考虑使用本领域技术人员已知的方法检测和测量差异表达的生物标志物或生物标志物表达产物如RNA和蛋白质的水平，以测量一种或多种差异表达的生物标志物或生物标志物表达产物的水平。

在一个实施方案中，本发明包括设计为检测存在于一个样品组而在另一个样品组中不存在的基因的基因特征差异分析方法。在测试样品和对照样品之间存在差异表达的基因与表达不改变的基因相比是更好的诊断和治疗靶标。

用于监测差异基因表达的分析可以集中在各种组织和液体，也可以用于检测或测量许多不同的分子靶标。当细胞表达基因时，其转录合适的RNA，其最终翻译成蛋白质。然后相关蛋白可以定位于各种细胞内或细胞外位置。

检测或测量蛋白质浓度或基因表达的方法可以利用针对细胞组分的方法(细胞检查)，或者针对检查细胞外组分的方法(液体检查)。由于基因表达涉及许多不同分子的有序产生，可以使用细胞或液体检查来检测或测量多种分子，包括RNA、蛋白质和许多由于蛋白质的功能而可被修饰的分子。

本发明的实践还可以采用软件和系统。本发明的计算机软件产品通常包括计算机可读介质，其具有用于执行本发明方法的逻辑步骤的计算机可执行指令。合适的计算机可读介质包括软盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动器、闪存、ROM/RAM、磁带等。计算机可执行指令可以用合适的计算机语言或几种语言的组合来编写。基本的计算生物学方法在例如Setubal and Meidanis et al.,Introduction to Computational Biology Methods(PWSPublishing Company,Boston,1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),ComputationalMethods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi and Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRCPress,London,2000)及Ouelette and Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guidefor Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons,Inc.,2nd ed.,2001)中描述。见美国专利6,420,108。

本发明还可以利用各种计算机程序产品和软件用于各种目的，例如探针设计、数据管理、分析和仪器操作。见美国专利5,593,839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170。此外，本发明可以具有优选实施方案，其包括用于通过如因特网等网络提供遗传信息的方法，如US公开号20020183936所示。

鉴定为差异表达的基因可以在多种核酸检测测定中评估以检测或量化在指定样品中一个基因或多个基因的表达水平。例如，传统的Northern印迹、核酸酶保护、RT-PCR、微阵列和差异展示方法可用于检测基因表达水平。用于mRNA的测定方法包括Northern印迹、槽印迹、斑点印迹和与有序寡核苷酸阵列的杂交。可以使用任何特别及定量测量特定蛋白或mRNA或DNA产物的方法。然而，用基于阵列或芯片杂交的方法来检测大量基因的表达是最有效的方法和测定。可以使用任何杂交测定形式，包括但不限于基于溶液和基于固体支持物的测定形式。

也可以测定本文鉴定的基因的蛋白质产物以确定表达量。用于测定蛋白质的方法包括但不限于Western印迹、免疫沉淀、免疫测定、免疫组织化学、免疫荧光和放射免疫测定。分析的蛋白可以位于细胞内(最常见的是免疫组化应用)或细胞外。

本发明的生物标志物的鉴定可以使用各种合适的测定来完成。合适的测定可以包括化学测定、酶测定、免疫测定、质谱分析、层析法、电泳、生物传感器、抗体微阵列或其任意组合中的一或多种。最常见的是，如果使用免疫测定法，可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心测定、竞争性或非竞争性测定、放射免疫测定(RIA)、侧流免疫测定、Western印迹、电化学发光测定、磁粒测定、使用生物传感器的免疫测定、基于珠的阵列测定(例如Luminex，Milliplex或Bioplex)、免疫沉淀测定、凝集测定、浊度测定或比浊测定。本文其它地方提供了本领域已知的免疫测定、质谱分析和层析的详细描述。

本发明还涉及用于多元分析平台的方法。在一个实施方案中，该方法包括用于多元分析测量标志物的分析方法。在另一个实施方案中，该方法包括一组兼容的分析策略以多元测量体液样品(例如滑液、全血、血浆或血清)中的标志物。

免疫测定

在一个实施方案中，本发明的方法可以以本领域熟知的各种免疫测定形式进行。免疫测定以其最简单直接的意义是结合测定，包括抗体与抗原的结合。已知许多类型和形式的免疫测定，均适用于检测揭示的生物标志物。免疫测定的实例是酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点测定(ELISPOT)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠捕获测定、Western印迹、斑点印迹、凝胶迁移测定、流式细胞计量术、蛋白质阵列、抗原阵列、抗体阵列、多珠阵列、磁性捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)、光漂白后的荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)、夹心测定、竞争性测定、使用生物传感器的免疫测定、免疫沉淀测定、凝集测定、浊度测定、比浊测定、immunoPCR、Quanterix、Singulex、AlphaLISA、Siscapa、Luminex、免疫测定、TR-FRET、Meso-scale discovery(MSD)、侧流免疫层析装置、自动磁性颗粒测定、荧光偏振、化学发光、电化学发光等。

通常，免疫测定包括将怀疑含有感兴趣分子(如揭示的生物标志物)的样品与感兴趣分子的抗体接触，或者将感兴趣分子的抗体(例如揭示的生物标志物的抗体)与该抗体可结合的分子接触，根据具体情况在有效允许形成免疫复合物的条件下进行。样品与感兴趣分子的抗体或者与可以由感兴趣分子的抗体结合的分子在有效允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的条件下接触足以允许其形成的一段时间，通常是简单地将所述分子或抗体与样品接触并将混合物保温足够长的时间，以使抗体与(即结合)抗体可结合的存在的任何分子(例如抗原)形成免疫复合物。在许多形式的免疫测定中，然后可以洗涤样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA平板、斑点印迹或Western印迹，以去除任何非特异性结合的抗体物种或者未结合的蛋白质，仅允许在初级免疫复合物内那些特异性结合的抗体被检测。

免疫测定可包括检测或量化样品中感兴趣分子(例如揭示的生物标志物或其抗体)的量的方法，所述方法通常包括检测或定量在结合过程中形成的任何免疫复合物。通常，免疫复合物形成的检测为本领域熟知，可以通过应用多种方法实现。这些方法通常基于标记或标签的检测，例如任何放射性、有色、化学发光、荧光、生物或酶标签或任何其它已知标记。见例如美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，所述专利以其全文并入本文作参考，特别是关于免疫检测方法和标记的教导。

如本文所用，标记可包括荧光染料、结合对的成员，如生物素/链霉抗生物素蛋白，金属(例如金)，或者表位标签，其可以与可被检测的分子特异性相互作用，如通过产生有色底物或荧光。适用于可检测标记蛋白质的物质包括荧光染料(在本文中也称为荧光染料和荧光团)和与生色底物反应的酶(例如辣根过氧化物酶)。在本发明的实践中通常优选使用荧光染料，因为其可以以非常低的量检测。此外，在多个抗原与单个阵列反应的情况下，每种抗原可以用不同的荧光化合物标记以同时检测。使用荧光计检测阵列上的标记斑点，信号的存在表明抗原与特定抗体结合。荧光团是发荧光的化合物或分子。荧光团吸收一个波长的电磁能并发射第二个波长的电磁能。

有两种主要类型的免疫测定，均相和异相。在均相免疫测定中，抗原和抗体之间的免疫反应和检测在均相反应中同时进行。异相免疫测定包括结合和未结合标记之间的至少一个分离步骤，可以区分反应产物与未反应的试剂。多种免疫测定可用于检测公开的或者并入本文作参考的一或多种蛋白质。

ELISA和基于珠的Luminex阵列平台是异相免疫测定的实例，其可以用于本发明的方法中。这些测定可用于检测各种形式的蛋白质抗原。在“夹心”形式中，被测定的抗原置于两种抗体之间。在这种方法中，固体表面首先用固相抗体包被。然后加入含有抗原(例如诊断蛋白)的测试样品或含有抗原的组合物，例如来自感兴趣对象的滑液样品，使抗原与结合的抗体反应。洗去任何未结合的抗原。然后使已知量的酶标记抗体与结合的抗原反应。在反应后洗去任何过量的未结合的酶联抗体。然后加入测定中使用的酶的特异性底物，底物与酶之间的反应产生颜色变化。目测颜色变化的量是特异性酶缀合的结合抗体的直接测量结果，因此与测试样品中存在的抗原量成正比。

ELISA也可以用作竞争性测定。在竞争性测定形式中，将含有待确定的抗原的测试样品与精确量的酶标记的抗原混合，这两种抗原竞争结合附着于固体表面的抗抗原抗体。在加入酶的底物之前洗去过量的游离酶标记的抗原。或者，可以将抗原包被在固体表面上，与样品中的抗原竞争标记的抗原特异性抗体。得自酶-底物相互作用产生的颜色强度的量与测试样品中的抗原量成反比。异相免疫测定如ELISA可用于检测任何揭示的或者并入本文作参考的蛋白质。

均相免疫测定包括例如αLISA、TRFRET(时间分辨的荧光能量转移)和酶扩大免疫测定技术(EMIT)，其通常包括含有待测生物标志物、待测生物标志物的酶标记分子、结合待测生物标志物的一或多种特定抗体及特异性酶显色底物的生物样品。在典型的EMIT中，将过量的特异性抗体加入生物样品中。如果生物样品含有待检测的蛋白质，则这些蛋白质与抗体结合。然后将测得量的相应的酶标记蛋白质加入到混合物中。样品中未被蛋白质分子占据的抗体结合位点被加入的酶标记蛋白质的分子占据。结果，酶活性降低，因为只有游离的酶标记的蛋白质可以作用于底物。由无色转化为有色形式的底物量决定了混合物中留下的游离酶的量。样品中待检测的高浓度的蛋白质会导致较高的吸光度读数。样品中较少的蛋白质导致较少的酶活性并因此较低的吸光度读数。当抗原-酶复合物与抗体结合时，酶标记的失活使得EMIT成为一个有用系统，使得测试可以在不用将结合的化合物与未结合的化合物分离的情况下进行，这种分离是使用其它免疫测定方法所需的。均相免疫测定如EMIT可用于检测任何揭示的或者并入本文作参考的蛋白质。

在许多免疫测定中，如本文别处所述，使用抗原特异性抗体作为检测分子检测抗原。然而，本发明的免疫测定及系统和方法不限于使用抗体作为检测分子。可以使用可以结合或捕获指定样品中的抗原的任何物质。除抗体外，也可用作检测分子的合适物质包括但不限于酶、肽、蛋白质、受体和核酸。此外，本领域已知其中可以检测捕获的抗原的许多检测方法。在一些测定中，酶联抗体产生颜色变化。在其它测定中，通过检测荧光、发光、化学发光或放射性信号检测捕获的抗原。本发明的系统和方法不限于免疫测定中产生的特定类型的可检测信号。

免疫测定试剂盒也包括在本发明中。这些试剂盒包括在分开的容器中的(a)对用于诊断ALTR的生物标志物(例如多肽)具有结合特异性的多克隆和/或单克隆抗体；和(b)和抗抗体免疫球蛋白。这种免疫测定试剂盒可用于实施本文提供的各种方法。(a)中的一抗可以直接标记，在这种情况下不需要抗-抗体免疫球蛋白(b)。单克隆抗体和抗-抗体免疫球蛋白的提供量可以是大约0.001μg-100μg，更优选约0.01μg-10μg。抗体检测试剂可以是多克隆免疫球蛋白、蛋白质A或蛋白质G或其功能片段，其可以在使用之前通过本领域已知的方法进行标记。在一些实施方案中，免疫测定试剂盒包括2、3或4种特异性结合揭示的或者并入本文作参考的生物标志物蛋白质的抗体。

在一个实施方案中，本发明的侧流免疫测定试剂盒可包含(a)样品垫，(b)缀合的标记垫，具有可检测标记的缀合的标记垫、一部分缀合的标记垫和一部分样品垫形成第一界面；(c)侧流测定包含膜，一部分膜和一部分缀合的标记垫形成第二界面，以及(d)与膜结合的至少一种抗体，所述第一界面允许液体从样品垫流至缀合标记垫并且与可检测标记接触，其中样品中存在的生物标志物形成生物标志物-缀合的标记复合物，第二界面允许液体从缀合标记垫流至膜并与至少一种膜结合抗体接触形成生物标志物-抗体复合物，导致可检测标记形成可检测信号。本文包括本领域技术人员已知的其它试剂形式配置。

质谱分析与层析

在一个实施方案中，本发明的方法可以本领域熟知的各种形式质谱分析(MS)或层析法进行。因此，样品中存在的生物标志物的水平可以通过质谱分析确定。通常，本发明可用的是可获得关于肽的质量、及优选地选择的肽的片段化和/或(部分)氨基酸序列的精确信息的任何质谱分析技术。合适的肽MS技术和系统是熟知的(见例如Methods inMolecular Biology,vol.146:"Mass Spectrometry of Proteins and Peptides",byChapman,ed.,Humana Press 2000,ISBN 089603609x；Biemann 1990.Methods Enzymol193:455-79；或者Methods in Enzymology,vol.402:"Biological Mass Spectrometry",by Burlingame,ed.,Academic Press 2005,ISBN 10 9780121828073)且可用于本发明中。

本文所用术语“质谱分析”或“MS”是指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。一般而言，将一个或多个感兴趣的分子离子化，随后将离子导入质谱分析仪器中，在此由于磁场和电场的组合，离子沿着取决于质量(m)和电荷(z)的空间路径。见例如美国专利6,204,500、6,107,623、6,268,144、6,124,137；Wright et al.,1999,ProstateCancer and Prostatic Diseases 2:264-76；Merchant et al.,2000,Electrophoresis21:1164-67，所述文献以其全部内容并入本文作参考，包括所有表、图和权利要求。质谱分析方法为本领域熟知且已经用于量化和/或鉴别生物分子，如蛋白质和激素(Li et al.,2000,Tibtech.18:151-160；Starcevic et.al.,2003,J.Chromatography B,792:197-204；Kushnir et.al.,2006,Clin.Chem.52:120-128；Rowley et al.,2000,Methods 20:383-397；Kuster et al.,1998,Curr.Opin.Structural Biol.8:393-400)。此外，质谱分析技术已经开发为允许分离的蛋白质的至少部分重新测序(Chait et al.,1993,Science,262:89-92；Keough et al.,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6；Bergman,2000,EXS88:133-44)。本领域已知各种离子化方法。例如大气压化学电离(APCI)、化学电离(CI)、电子轰击(EI)、电喷射电离(ESI)、快原子轰击(FAB)、场解吸/场电离(FD/FI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)和热喷射电离(TSP)。

样品中存在的生物标志物的水平可以通过MS确定，如基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS；MALDI-TOF源后衰变(PSD)；MALDI-TOF/TOF；表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱分析(SELDI-TOF)MS；串联质谱分析(例如MS/MS，MS/MS/MS等)；电喷射电离质谱分析(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n(n是大于0的整数)；ESI 3D或线性(2D)离子阱MS；ESI三重四级杆MS；ESI四极正交TOF(Q-TOF)；ESI Fourier转化MS系统；在硅上解吸/电离(DIOS)；次级离子质谱法(SIMS)；大气压化学电离质谱分析(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)；大气压光致电离质谱分析(APPI-MS)；APPI-MS/MS；APPI-(MS)"；液相层析-质谱分析(LC-MS)，气相层析-质谱分析(GC-MS)；高效液相层析-质谱分析(HPLC-MS)；毛细管电泳-质谱分析；及核磁共振波谱分析。串联MS(MS/MS)排列中的肽离子片段化可以使用本领域中确立的方式实现，例如碰撞诱导解离(CID)。见例如美国专利申请号：20030199001、20030134304、20030077616所述，所述专利以其全部内容并入本文作参考。这些技术可以用于相对和绝对量化，也可以用于评估根据本发明的生物标志物与可能存在的其它生物标志物的比率。这些方法也适用于临床筛查、预后、监测治疗结果、确定最有可能对特定治疗反应的患者、药物筛选和开发以及确定药物治疗的新靶点。

在某些实施方案中，使用气相离子分光光度计。在其它实施方案中，使用激光解吸/电离质谱分析样品。现代激光解吸/电离质谱(“LDI-MS”)可以两种主要变化实施：基质辅助激光解吸/电离(“MALDI”)质谱分析和表面增强的激光解吸/电离(“SELDI”)。在MALDI中，分析物与含有基质的溶液混合，并将一滴液体置于基质表面。基质溶液然后与生物分子共结晶。将基质插入质谱仪。激光能量被导向至基底表面，在此其解吸并电离生物分子而不会显着破碎生物分子。见例如美国专利5,118,937和5,045,694所述。在SELDI中，基质表面被修饰使其在解吸过程中是活性的参与者。在一个变化中，表面用选择性结合感兴趣的生物标志物的吸附剂和/或捕获试剂衍生化。在另一种变化中，表面用能量吸收分子衍生化，该能量吸收分子在被激光撞击时不会被解吸。在另一种变化中，表面用结合感兴趣蛋白质并含有在应用激光时断裂的光解键的分子衍生化。SELDI是用于在指定条件下如药物治疗和疾病条件下鉴定体液和组织中蛋白质和肽的特征“指纹”的有力工具。该技术利用蛋白质芯片捕获蛋白质/肽及使用飞行时间质谱仪(tof-MS)定量和计算从小于1,000Da的小分子和肽至500kDa的蛋白质范围的化合物质量。可以使用自动计算机程序对蛋白质/肽模式中的量化差异进行统计学评估，其代表了作为多维空间中坐标的在生物体液样品中测量的每种蛋白质/肽。SELDI 15系统还具有在一个实验中运行数百个样品的能力。另外，来自SELDI质谱分析的所有信号均衍生自天然蛋白质/肽(不同于需要蛋白酶消化的一些其它蛋白质组学技术)，因此直接反映了指定条件的基础生理学。

在MALDI和SELDI中，衍生剂通常定位于应用样品的基质表面上的指定位置。见例如美国专利5,719,060和WO 98/59361。可以通过例如使用SELDI亲和表面捕获分析物及向捕获的分析物中加入含基质的液体以提供能量吸收材料来组合两种方法。关于质谱分析仪的另外信息见例如Principles of Instrumental Analysis,3rd edition.,Skoog,Saunders College Publishing,Philadelphia,1985；及Kirk-Othmer Encyclopedia ofChemical Technology,4th ed.Vol.15(John Wiley&Sons,New York 1995),pp.1071-1094。生物标志物的检测和定量通常取决于信号强度的检测。例如，在某些实施方案中，可以比较来自第一样品和第二样品的质谱峰值的信号强度(例如通过计算机分析等目测)以确定特定生物标志物的相对量。可以使用如Biomarker Wizard程序(CiphergenBiosystems，Inc.，Fremont，CA)的软件程序以助于分析质谱。质谱仪及其技术为本领域技术人员熟知。

在一个实施方案中，通过质谱分析检测和定量生物标志物可包括多反应监测(MRM)，如Kuhn et al.2004(Proteomics 4:1175-86)所述。

在一个实施方案中，MS肽分析方法可以有利地与上游肽或蛋白质分离或分级分离方法组合，例如与下文所述的层析及其它方法结合。

层析也可用于测量生物标志物。如本文所用，术语“层析法”涵盖用于分离化学物质的方法，为本领域广泛可用。在一个优选的方法中，层析是指这样的过程，其中由于分析物的不同分布，由移动的液体或气体流(“流动相”)携带的化学物质(分析物)的混合物被分离成组分，它们在所述流动相和所述固定相之间在固定液相或固相(“固定相”)周围或其上流动。固定相通常可以是细碎的固体、一片过滤材料或者固体表面上的液体薄膜等。层析也广泛适用于分离生物来源的化学化合物，例如氨基酸、蛋白质、蛋白质或肽片段等。

本文使用的层析可优选为柱状(即其中固定相被沉积或置于柱中)，优选液相层析，更优选高效液相层析(HPLC)。尽管层析的细节为本领域中熟知，但进一步的指导见例如Meyer M.,1998,ISBN:047198373X,和"Practical HPLC Methodology andApplications",Bidlingmeyer,B.A.,John Wiley&Sons Inc.,1993。

示例的层析类型包括但不限于HPLC、正相HPLC(NP-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、离子交换层析(IEC)如阳离子或阴离子交换层析、亲水相互作用层析(HILIC)、疏水相互作用层析(HIC)、大小排阻层析(SEC)包括凝胶过滤层析或凝胶渗透层析、层析聚焦、亲和层析如免疫亲和层析、固定金属亲和层析等。

在一个实施方案中，包括单向、双向或多向层析在内的层析可以与另一种肽分析方法例如与在本说明书别处所述的下游质谱分析(例如抗肽抗体稳定同位素标准捕获(SISCAPA))一起用作肽分级分离或纯化方法。

可以使用进一步的肽或多肽分离、鉴定或定量方法，任选地结合任何上述分析方法，用于测量本发明中的生物标志物。这些方法包括但不限于化学提取分区、等电聚焦(IEF)包括毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管电层析(CEC)等，单向聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动层析(MEKC)、自由流动电泳(FFE)等。

生物传感器

在一个实施方案中，使用例如具有电流测量、电化学、电位测定、电导测定、阻抗、磁性、光学、声学或热效换能器的传感器系统的生物传感器检测本发明的生物标志物。

通常，生物传感器包括生物传感器识别元件，其可以包括结合特定生物标志物的蛋白质、核酸、抗体等，及将分子信号(即生物标志物与识别元件的结合)转换成可以量化、显示和分析的电子或数字信号的转换器。生物传感器还可能包括一个读取器设备，其将信号转换为用户友好的结果显示。包含示例生物传感器的潜在组分的实例在Bohunicky etal.(2011,Nanotechnology Science and Applications,4:1-10)中描述，其以全部内容并入本文作参考。

生物传感器可整合物理、化学或生物检测系统。在一个实施方案中，生物传感器是具有生物识别系统的传感器，例如基于核酸如寡核苷酸探针或适体，或者基于蛋白质如酶、结合蛋白、受体蛋白、转运蛋白或抗体。在一个实施方案中，生物识别系统可以包含本文别处描述的传统免疫测定。在另一实施方案中，识别元件(例如蛋白质、核酸、抗体等)可以是未标记的，及生物标志物与元件的结合可直接观测并通过转换器转换为信号。生物传感器可以包括微流体装置，通过毛细管流动、重力、电驱动力或其它方式移动液体用于测量或分配体积、容纳混合试剂、提供保温。

用于检测生物传感器中的生物标志物的方法使用免疫学、电学、热学、磁性、光学(例如全息图)或声学技术。使用这样的生物传感器，可以检测在生物样品中发现的预期浓度的靶生物标志物。

生物传感器可以整合本文所述的检测方法和系统以检测生物标志物。生物传感器可采用电学(例如电流测量、电位测定、电导测定或阻抗检测系统)、量热(例如热)、磁性、光学(例如全息图、发光、荧光、比色法)或质量变化(例如压电，声波)技术。在根据本发明的生物传感器中，一种、两种、三种或更多种生物标志物的水平可以通过选自以下的一种或多种方法检测：直接、间接或偶联酶技术、分光光度测量技术、荧光测量技术、光度测量技术、光谱测定技术、旋光测量技术和层析技术。特别优选的生物传感器包含一种或多种通过介质直接或间接使用的酶，或使用与电、光、声、磁或热转换器结合的结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白。使用这种生物传感器，可以检测在生物样品中发现的预期浓度的靶生物标志物的水平。

在生物传感器的一个实施方案中，本发明的生物标志物可以使用基于“智能”全息图或高频声学系统的生物传感器结合技术检测，这样的系统特别适用于“条形码”或阵列配置。在智能全息图传感器(Smart Holograms Ltd,Cambridge,UK)中，全息图像被存储在薄聚合物膜中，该膜被敏化以与生物标志物特异性反应。暴露时，生物标志物与聚合物反应，导致全息图显示的图像发生变化。读出的测试结果在图像的光学亮度、图像、颜色和/或位置中可以变化。对于定性和半定量应用，可以通过目测读取传感器全息图，从而消除对检测设备的需求。当需要定量测量时，可以使用简单的颜色传感器读取信号。样品的不透明度或颜色不会影响传感器的操作。传感器的形式允许多元同时检测若干种物质。可以设计可逆和不可逆传感器以满足不同的要求，并且对感兴趣的特定生物标志物的连续监测是可行的。

检测本发明的生物标志物的生物传感器可以包括声学、表面等离子体共振、全息和显微工程传感器。印记的识别元件、薄膜晶体管技术、磁声共振器装置和其它新的声电系统可以用于生物传感器中以检测本发明的生物标志物。

合适地，检测本发明的生物标志物的生物传感器是偶联的，即其组合生物分子识别与适当的手段以将样品中生物标志物的存在或定量的检测转化为信号。生物传感器可以适用于“备用场所”诊断测试，例如在病房、门诊、手术室、家庭、田地和工作场所。

对照

在一些情况下，对照可以是标准化的并且仅用于为本发明的测定确立初始截断值的目的。因此，在一些情况中，本发明的方法可以诊断ALTR，例如金属超敏性，而不需要与对照比较。换句话说，仅需检测本发明的生物标志物而不需要与对照组进行比较即可用于诊断ALTR。以这种方式，本发明的系统产生定性(是/否答案)、半定量(-/+/++/+++/++++)或定量答案。

生物标志物

在一个实施方案中，本方面揭示的系统包括将得自测试对象的体液(例如滑液)应用于系统以检测在测试关节样品中差异表达(即上调或下调)的一种或多种生物标志物。这种生物标志物包括但不限于中性粒细胞防御素1(基因：DEFA1，蛋白质：α防御素)、C-反应蛋白(基因：CRP，蛋白质：CRP)、生长调节的α蛋白(基因：CXCL1，蛋白质：GRO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(基因：ELANE，蛋白质：HNE)，干扰素γ(基因：IFNγ，蛋白质：IFNG)，白介素1-α(基因：IL-1A，蛋白质：IL-1α)，白介素1-β(基因：IL-1B，蛋白质：IL-1β)，白介素6(基因/蛋白质：IL-6)，白介素8(基因：CXCL8，蛋白质：IL-8)，白介素12-β(基因:IL-12β，蛋白质:IL-12β)，白介素15(基因/蛋白质:IL-15)，C-X-C基序趋化因子10(基因：CXCL10，蛋白质：IP-10)，乳酸盐，瘦素(基因：LEP，蛋白质：Leptin)，单核细胞趋化蛋白1(基因：CCL2，蛋白质：MCP-1)，单核细胞趋化蛋白3(基因：CCL7，蛋白质：MCP-3)，C-C基序趋化因子22(基因：CCL22，蛋白质：MDC)，巨噬细胞炎性蛋白1-α(基因：CCL3，蛋白质：MIP-1α)，肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(基因：TNFRS11B，蛋白质：OPG)，骨桥蛋白(基因：SPP1，蛋白质：OPN)；血小板衍生生长因子B亚基(基因：PDGFB，蛋白质：PDGF-AB/BB)，肿瘤坏死因子α(基因：TNF-α，蛋白质：TNF-α)，VEGF(血管内皮生长因子)，正五聚蛋白-3(基因：PTX3，蛋白质：PTX3)，肿瘤坏死因子配体超家族成员6(基因：FASL，蛋白质：FASL)，可溶性细胞间粘附分子-1(基因：sICAM-1；蛋白质：SICAM-1)等。

在一个实施方案中，本发明揭示的系统包括将来自测试样品的滑液应用于系统以检测在关节中上调或下调的一或多种生物标志物。特别地，所述关节表现出在接受MOM或MOP关节置换的对象中出现的ALTR症状。

本发明部分基于以下发现：炎症关节中的细胞基于疾病的性质而不同，及ALTR中的诊断基因/蛋白质表达谱在接受MOM关节置换的对象中是独特的。如本文别处所述，待测样品与对照样品的表达模式的比较用于确定本发明生物标志物水平的初始截断值。

本发明的系统可以用于检测至少一种、两种、三种、四种、五种、至少十种不同的生物标志物或多种生物标志物。在一些实例中，所述系统包括确定蛋白质组谱。在其它实例中，本发明的系统包括检测包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或全部这些蛋白质的蛋白质组谱，包括在本文陈述的任何蛋白质。在本发明的一个实施方案中，该系统可以检测编码本发明的一或多个蛋白质生物标志物的核酸。

在一个实施方案中，本发明提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％灵敏性；至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％特异性；或者二者为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％灵敏性和特异性检测ALTR的生物标志物的系统。在一个实施方案中，本发明提供了以至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％灵敏性及>99％特异性检测ALTR的生物标志物的系统。在一个实施方案中，本发明提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％精确度检测关节中炎症生物标志物的系统。示例的某些生物标志物的截断值(通过ROC分析推导)在图8和12中提供。

疾病状况

ALTR是与MOM置换髋关节相关的最常见并发症之一。这种情况可能需要广泛治疗，包括全髋关节修正，或者手术置换不同型号的全金属髋关节。释放到滑膜中的金属颗粒会对包括骨骼在内的机体组织造成不良反应。这种情况是有害的和退行性的，造成周围健康骨骼的骨流失和骨折。炎症、积液和肿瘤样肿块(假瘤)也可以在机体软组织中发展。

在本发明的一个实施方案中，检测样品中的标志物鉴定了从中获得样品的对象是否具有ALTR。例如，本发明提供了检测得自关节的体液样品(滑液样品)中生物标志物的能力，其中生物标志物的检测鉴定足以保证手术干预的ALTR。

在一个实施方案中，本发明提供了用于快速诊断ALTR是否存在的系统。ALTR的确定可以告知医生建议对患者进行手术修正。

在本发明的一个实施方案中，检测样品中的标志物鉴定了从中获得样品的对象具有ALTR及没有PJI。

在本发明的一个实施方案中，检测样品中的标志物将功能良好的MOM关节与ALTR区分。

在本发明的一个实施方案中，检测样品中的标志物鉴定了从中获得样品的对象对植入的金属具有超敏反应。

检测平台

涉及本发明生物标志物的检测和/或定量的方法可以使用台式仪器进行，或者可以并入可以在非实验室环境中使用的一次性的、诊断或监测平台上，例如在医生办公室或患者床边。

因此，如本领域技术人员将理解的，本发明的方法可包括本领域已知的用于检测样品中生物标志物的任何方法。

因此，本发明包括检测体液样品如滑液中希望的生物标志物的任何平台。在一个实施方案中，本发明的系统提供便利的床旁检验(point-of-care)设备，其可以快速检测在家中或临床环境中生物标志物的存在与否。即时检验装置的一个非限制性实例是侧流免疫测定，其使用其上应用了抗体及其它试剂的膜、优选纤维素膜条带。样品由于毛细管作用沿着条带移动，并与沿着条带不同点划痕的试剂反应。最终的结果是出现或不出现有色的线或斑点，任选可以将其与对照线进行比较。在一些实施方案中，即时检测装置检测两或更多种生物标志物。在某些方面，所述两或更多种生物标志物包含IL-8和OPN。

在一个实施方案中，该系统可以包括基底或支撑层以及包含至少一个吸收层的吸收基质，由此液体样品可以通过力或毛细管作用沿着流动路径流动。基底层也可以是吸收剂，及与吸收基质流体连通，使得液体样品的流动路径穿过吸收基质和基底层。流动路径包括至少两个区域，其中第一个区域是样品应用区域，第二个区域是检测区域。

定点使用设备(Point-of-use Devices)

已经开发了定点使用分析测试以使用各种生物样品(如尿液、血清、血浆、血液、唾液)常规鉴别或监测健康相关状况(如妊娠、癌症、内分泌失调、感染性疾病或者药物滥用)。一些定点使用测定基于特异性结合对如抗原/抗体、半抗原/抗体、凝集素/碳水化合物、载脂蛋白/辅因子和生物素/(链霉)抗生物素蛋白(受体/配体)之间高度特异性相互作用。在某些定点使用设备中，使用测试条进行测定，其中将特异性结合对成员附着于可移动材料(例如由乳胶或玻璃制成的金属溶胶或珠)或不可移动基质(例如玻璃纤维，纤维素条或硝酸纤维素膜)。其它定点使用设备可以包括光学生物传感器、光度生物传感器、电化学生物传感器或其它类型的生物传感器。用于执行本发明方法的定点使用设备中的合适生物传感器包括具有光学或听觉读取器的“卡片”或“芯片”。生物传感器可以配置为允许收集的数据以电子方式传输给医生进行解读，因此可以形成电子医学的基础，其中诊断和监测可以在不需要患者接近医生或诊所的情况下完成。

体液(例如滑液)中的生物标志物的检测可以使用样品捕获装置进行，如可以检测一或多种生物标志物如本文所述那些的侧流装置(例如侧流测试条)。

本发明的测试条包括从上游样品应用区域至测试部位的流动路径。例如，流动路径可以从样品应用区域经过移动区域至捕获区域。移动区可包含与分析物或分析物类似物相互作用的可移动标志物，捕获区包含结合分析物或分析物类似物以检测样品中分析物的存在的试剂。

通常在其中掺入已附着于有色标记的试剂，从而允许目测测定结果而不需要加入其它物质的迁移测定装置的实例见例如美国专利4,770,853(并入本文作参考)。有揭示当分析物流经测试条上的多个区域时检测小或大分析物(MW小于或大于1,000道尔顿)方法的许多可商购的侧流型测试和专利。例如可见于美国专利5,229,073、5,591,645、4,168,146、4,366,241、4,855,240、4,861,711、5,120,643(均并入本文作参考)。多区侧流测试条在美国专利5,451,504、5,451,507和美国专利5,798,273中揭示(并入本文作参考)。美国专利6,656,744(并入本文作参考)揭示了侧流测试条，其中通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用使标记结合抗体。

设计流入型测定装置，部分是为了避免需要与试纸测定相关的保温和洗涤步骤。流入型免疫测定装置包括捕获试剂(例如一种或多种抗体)，其结合之中加入了液体样品的多孔膜或滤膜。当液体流经所述膜时，靶分析物(如蛋白质)与捕获剂结合。加入样品之后是(或者同时)加入检测试剂，如标记的抗体(例如金缀合或有色乳胶颗粒缀合的蛋白质)。或者，检测试剂可以以允许检测剂与样品混合并由此标记分析物的方式置于膜上。对检测试剂进行目测提供了样品中靶分析物存在的指示。代表性流入式测定装置在美国专利4,246,339、4,277,560、4,632,901、4,812,293、4,920,046和5,279,935、美国专利申请公开20030049857和20040241876以及WO 08/030,546中描述。迁移测定装置通常在其中包含已附着于有色标记的试剂，从而可以目测测定结果而不用加入其它物质。见例如美国专利4,770,853、PCT公开WO 88/08534所述。

有许多揭示检测大分析物(MW大于1,000道尔顿)方法的可商购的侧流型测试和专利。美国专利5,229,073描述了测量血浆脂蛋白水平的半定量竞争免疫测定侧流方法。该方法利用包含固定的抗体的多个捕获区或线以结合标记的和游离的脂蛋白以给出半定量结果。另外，美国专利5,591,645提供了具有至少两部分的层析测试条。第一部分包括可移动示踪剂，第二部分包括能够结合分析物的固定的结合剂。在以下专利文献中揭示了用于大分析物的侧流测试的其它实例：美国专利4,168,146、4,366,241、4,855,240、4,861,711和5,120,643；WO 97/06439；WO 98/36278；及WO 08/030,546。

本文描述的装置通常包括一条吸收材料(例如微孔膜)，在某些情况下其可以由不同物质制成，每个物质在该区域中可以彼此邻接和/或重叠地连接。在一些实例中，吸收条可以固定在支撑的非相互作用材料(例如非织造聚酯)上例如为该条带提供增加的刚性。每个条带内的区域可以不同地包含特定的结合配偶体和/或检测和/或定量待测试的特定分析物例如本文揭示的一或多种蛋白质所需的其它试剂。因此这些区域可以被视为测试设备内的功能部分或功能区。

通常，将体液样品例如通过在条带近端处浸渍或点渍而导入条带。采用本领域技术人员熟知的方法收集或获得样品。含有待检测的特定蛋白质的样品可得自任何生物学来源。在特定实例中，生物学来源是滑液。在测定之前可将样品稀释、纯化、浓缩、过滤、溶解、悬浮或另外方式处理以优化免疫测定结果。体液向远侧移动流经条带的所有功能区。各个功能区域中液体的最终分布取决于所用材料的吸附能力和尺寸。

在一些实施方案中，本文别处描述的多孔固体支持物如硝化纤维素优选是片材或条带的形式。这种片材或条带的厚度可以在宽限内变化，例如大约0.01-0.5mm、大约0.02-0.45mm、大约0.05-0.3mm、大约0.075-0.25mm、大约0.1-0.2mm，或者大约0.11-0.15mm。这种片材或条带的孔径可以类似地在宽限内变化，例如大约0.025-15微米，或者更具体地为大约0.-3微米；然而，孔径在固体支持物的选择中不是限制因素。在适用的情况下，固体支持物的流速也可以在宽限内变化，例如大约12.5-90秒/cm(即50-300秒/4cm)、大约22.-62.5秒/cm(即90-250秒/4厘米)、大约25-62.5秒/厘米(即100-250秒/4厘米)、大约37.5-62.5秒/厘米(即150-250秒/4厘米)，或者大约50-62.5秒/厘米(即200-250秒/4厘米)。

在使用测定装置时要考虑的另一个常见特征是检测分析物(例如本文所述的一或多种蛋白质)与捕获剂(例如一或多种抗体)之间形成复合物的方式。检测剂(也称为检测试剂)用于此目的。检测剂可以整合进测定装置中(例如包含在缀合垫中)，或者可以从外部源应用于所述装置。

检测剂可以是单一试剂或者共同用于检测目的一系列试剂。在一些情况下，检测试剂是特异于分析物的标记的结合配偶体(例如针对特定感兴趣的蛋白质的金缀合抗体)。

在其它情况中，检测试剂共同包含特异于分析物的未标记的第一结合配偶体及特异于第一结合配偶体的标记的第二结合配偶体等等。因此，检测剂可以是特异于本文所述蛋白质的标记的抗体。检测剂也可以是特异于感兴趣的蛋白质的未标记的第一抗体及特异性结合所述未标记的第一抗体的标记的第二抗体。在每种情况中，检测试剂特异性检测分析物-捕获试剂复合物的结合的分析物，及因此检测试剂优选基本上不结合或者不与捕获试剂或位于分析物捕获区域中的其它组分反应。检测剂的这种非特异性结合或反应可能提供假阳性结果。任选地，检测试剂可以特异性识别存在于次要捕获区域的阳性对照分子(例如对于标记的蛋白质A检测剂或标记的蛋白质G检测剂或标记的抗人Ab(Fc)的非特异性人IgG)。

流入装置构建与设计

流入式装置包括固定在固体支持物上的捕获试剂(例如一或多种抗体)，所述固体支持物通常是微滴定板或膜(例如硝化纤维素，尼龙或PVDF)。在一个简单代表形式中，流入装置的膜功能性或物理性接触吸收层，其作为容器以通过膜吸取液体样品。任选地，在捕获试剂固定之后，(在给予样品之前或同时)可以阻断膜上任何剩余的蛋白质结合位点以最小化非特异性相互作用。

在流入装置的操作中，将液体样品与膜接触。典型地，流入装置还包括用于接收并暂时保留期望体积的液体样品的样品应用区域(或容器)。样品流经膜基质。在该过程中，样品中的分析物(例如一或多种蛋白质，例如本文所述的一或多种蛋白质)可以特异性结合固定的捕获试剂(例如一或多种抗体)。在希望检测分析物-捕获试剂复合物的情况中，可以将检测剂(例如标记的特异性结合一或多种蛋白质的抗体)加入样品或可以在应用样品后加入含有检测剂的溶液。如果分析物被捕获剂特异性结合，则可在膜表面上观察到归因于特定检测剂的特征。任选在该过程任何时间加入洗涤步骤，例如在应用样品之后和/或在应用检测剂之后。

侧流装置构建与设计

侧流装置为本领域中已知。简而言之，侧流装置是一种分析装置，具有作为其本质的测试条，将怀疑含有感兴趣分析物的测试样品液体流经其中。测试液体及任何悬浮的分析物可以沿着测试条流至检测区域，在此分析物(如果存在的话)与捕获剂和检测剂相互作用以表明所述分析物的存在、不存在和/或数量。

已经揭示了许多侧流分析装置，包括在美国专利4,313,734、4,435,504、4,775,636、4,703,017、4,740,468、4,806,311、4,806,312、4,861,711、4,855,240、4,857,453、4,943,522、4,945,042、4,496,654、5,001,049、5,075,078、5,126,241、5,451,504、5,424,193、5,712,172、6,555,390、6,258,548、6,699,722、6,368,876,7,517,699及美国专利申请14/971,375中所示那些装置，上述专利均并入本文作参考。

测试结果可以直接目测，也可以使用读取器(如扫描仪)测量。读取器装置可以根据从读出区域(例如测试线和/或对照线)中得自标记的试剂的颜色、荧光、发光、放射性或任何其它可检测标志物检测检测剂。

在侧流装置的一个实施方案中，可以存在与测试结果区中测试线平行或垂直(或以任何其它空间关系)位置的第二(或第三、第四或更多)个测试线。该特定实施方案的操作类似于本文别处所述的操作，另外考虑因素是(i)特异于第二个分析物如另一种抗体的第二个检测试剂也可以包含于缀合垫中，及(ii)第二个测试线包含对第二个分析物例如样品中的第二个蛋白质具有亲和性的第二个特异性结合配偶体。相似地，如果包含第三个(或更多)测试线，则测试线将包含对第三个(或更多)分析物具有亲和性的第三个(或更多个)特异性结合配偶体。

在一个实施方案中，对照线与测试线的比较产生来自本发明的诊断系统的测试结果。在某些情况下，当对照线与测试线相比以更高的强度水平被检测到时，出现有效结果。例如，当对照线比测试线更暗至少5％或更多、例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多时出现有效结果。在一些情况下，当对照线比测试线更暗至少0.5倍或更多、例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多时出现有效效果。

在一个实施方案中，对照线是保证测试已正确运行的参考线，并且测试样品非得自关节之外的任何其它部位(即血液)。例如，当对照线以至少等于测试线的强度被检测到时，本发明的系统可用于诊断关节中的ALTR。优选地，对照线与测试线相比以更高的强度被检测到。在某些情况下，如果测试线不至少等于对照线的暗度或强度，则称测试的结果无效。如果测试线与对照线至少相等或更亮，则称测试结果有效。

床旁检验诊断与风险评估系统

本发明的系统可以应用于床旁检验情况。美国专利6,267,722、6,394,952和6,867,051揭示并描述了诊断和评估某些医疗风险的系统，所述专利的内容并入本文。该系统设计为用于现场床旁检验，患者在此接受检验和测试，以及远离现场操作。系统被设计为接受以患者数据包括但不限于生物化学测试数据、物理测试数据、病史资料数据及其它这种数据的形式的输入，及加工和输出信息，如与医学诊断或疾病风险指示相关的数据。患者数据可以包含在系统内，例如医疗记录或病史，或者可以作为来自医学检测或过程例如免疫测定测试数据、血压读数、超声、X射线或MRI的信号或图像输入或以任何其它形式导入。具体的测试数据可以数字化、加工并输入医学诊断专家系统，在此其可以与其它病人信息整合。系统的输出是疾病风险指数或医学诊断。

床旁检验检测是指可以在快速时间范围内完成的实时诊断测试，由此所得测试比不使用此系统的相应测试更快执行。例如，本文揭示和描述的示例免疫测定可以比相应的ELISA测定以明显更少的时间进行，例如在不到半小时的时间内。此外，床旁检验检测指可以在现场迅速执行的测试，例如在医生办公室、在床边、在stat实验室、急诊室或其它此类场所中，尤其是在需要快速和准确结果的情况下。

在示例的实施方案中，床旁检验诊断和风险评估系统包括用于读取患者数据的读取器、被设计为在读取器中读取的测试装置以及用于分析数据的软件。在塑料罩中的测试条装置被设计为与读取器一起使用，任选地包括符号体系，如字母数字字符条形码、其它机器可读代码或RFID装置，以及还提供了被设计用于分析从测试条产生的数据的软件。

在一个实施方案中，读取器是指用于检测和/或定量例如在测试条上的数据的仪器。数据可能是肉眼可见的，但不需要可见。这种读取器在上文并入参考的美国专利6,267,722、6,394,952和6,867,051中揭示和描述。反射率读取器是指适于使用反射光来读取测试条的仪器，所述反射光包括荧光或任何波长的电磁辐射。可以使用光检测器或其它检测器如电荷耦合二极管(CCD)来检测反射率。示例的反射率读取器包括适于接收测试条的盒槽、发光二极管、光纤、传感探头，包括用于沿着测试条定位传感探头的装置，用于读取光检测器输出以及用于控制发光二极管的接通和断开操作的控制电路，用于存储原始和/或加工的数据的存储电路，以及光检测器如硅光电二极管检测器。应意识到颜色变化是指颜色的强度或色度的变化，或者可以是没有颜色存在或颜色消失时的颜色表象。

在一个实施方案中，将样品应用于诊断性免疫测定测试条，并产生有色或暗条带。对于感兴趣的浓度范围，由测试条的测试区域(或检测区域)中的有色标记反映的颜色强度与被测试的样品中存在的分析物的量成正比或以其它方式相关。根据本实施方案，使用读取装置例如和适于读取测试条的反射率读取器读取产生的颜色强度。测试条的测试区域(或检测区域)中由有色标记反映的颜色的强度与被测试样品中存在的分析物的量成正比。换句话说，测试区域中较暗的有色线表示较大量的分析物，而测试区域中较浅的有色线表示较少量的分析物。使用读取装置例如适于读取测试条的反射率读取器读取产生的颜色强度，即有色线的暗度或亮度。

由读取器装置获得的反射率测量结果与样品中存在的分析物的存在和/或数量相关。读取器沿着测试条读取多个读数，并获得数据用于产生标示样品中存在的分析物的存在和/或数量的结果。该系统可以将这些数据与疾病、状况或其风险的存在相关联。

如本文别处所提及，除了读取测试条之外，读取器还可适用于读取符号体系，例如条形码或RFID装置，其存在于测试条或外罩上及编码与测试条装置和/或读取测试结果和/或患者和/或试剂有关的信息或其它期望的信息。通常，相关信息存储在远程计算机数据库中，但可以人工存储。此外，符号体系或RFID装置及其中编码信息可以在使用该设备时进行打印。

试剂盒

本发明包括可用于检测本发明的至少一种生物标志物的一组优选的标记(例如荧光剂、猝灭剂等)或未标记的抗体或寡核苷酸。

在某些实施方案中，提供了一种试剂盒。根据本说明书，用于这些方法的可商购的试剂盒为本领域技术人员已知。通常，试剂盒包含适于检测感兴趣的生物标志物(多肽或核酸或mRNA)的存在的检测试剂。

在一个实施方案中，提供了具有使用说明的试剂盒，其中所述试剂盒包含能够与至少一种生物标志物结合或杂交的抗体或探针。生物标志物可以例如选自中性粒细胞防御素1、C-反应蛋白、生长调节α蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、干扰素γ，白介素1-α、白介素1-β、白介素6、白介素8、白介素12-β、白介素15、C-X-C基序趋化因子10、乳酸盐、瘦素、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白3、C-C基序趋化因子22、巨噬细胞炎性蛋白1-α、肿瘤坏死因子受体超家族成员11B、骨桥蛋白；血小板衍生生长因子B亚基、正五聚蛋白-3、肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1。在一些实施方案中，该试剂盒可用于测量来自测试对象体液样品中的ALTR水平。在其它实施方案中，该试剂盒可用于提供ALTR存在或不存在的指示。在其它实施方案中，该试剂盒可用于区分ALTR和PJI。在其它实施方案中，该试剂盒可用于诊断对金属植入物的免疫超敏性。在其它实施方案中，该试剂盒可用于提供修正手术是否与测试对象相关的建议。

在一些实施方案中，试剂盒包括一组探针组或抗体。在一些实施方案中，试剂盒是如本文之前所述的免疫测定试剂盒。在一些实施方案中，探针组被设计为检测本发明的至少一种生物标志物的水平并提供关于ALTR或组织坏死的信息。在本发明中，探针组靶向检测有关ALTR的信息的核苷酸或多肽。探针组还可以包含大量或少量的探针，其检测与ALTR或组织坏死无关信息的核苷酸或肽。这样的探针可用作对照和标准化(例如加标(spiked-in)标记)。探针组可以是干燥混合物或溶液中的混合物。在一些实施方案中，探针组可以被固定于固体基质以形成探针阵列。探针可以是抗体或核酸(例如DNA、RNA、化学修饰形式的DNA和RNA)、LNA(锁定核酸)、PNA(肽核酸)、抗体-核酸缀合物或者能够与感兴趣的肽或核酸序列特异性相互作用的任何其它聚合物化合物。试剂盒中还可以包括用于测量本发明的生物标志物的装置。

实施例

通过参考以下实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，提供这些实施例仅用于例证本发明而无限制之意。因此，本发明不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包含由于本文提供的教导而显现的任何和所有变化。

不用进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以使用前述和下文示例的实施例产生和利用本发明的化合物并且实践本发明请求保护的方法。因此如下实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本方面的其余部分。

现在描述在本发明的实验中使用的材料和方法。

材料和方法

患者选择和治疗方案

基于列出的纳入和排除标准，对接受修正金属对金属(MOM)或金属对聚合物(MOP)全髋关节置换或初次全髋关节置换术的患者进行资格筛查。

纳入标准：

1.呈现如下程序之一的患者：

a.金属对金属髋关节修正，患者在计划修正手术之日起6个月内测试钴和铬金属离子水平，或者

b.呈现金属对聚合物髋关节修正的患者，或者

c.具有髋关节骨关节炎但是不具有全髋关节手术的患者(对照)。

2.仅修正程序：患者必须手术后超过一年。

排除标准：

1.仅主要程序：在对侧具有任何关节形式的全髋的患者，

2.有假体周围感染史的患者

3.囚犯

4.不同意提议的治疗方案的患者，

5.精神状态改变的患者，

6.活动的并发转移性感染，

7.活动的浅表感染，

8.在预定手术的2周(14天)内接受过术前滑液抽吸的患者，

9.仅金属对金属(MOM)修正程序：呈现金属对金属髋关节修正术的患者，其在计划修正术之日起>6个月检测钴和铬金属离子水平，

10.仅金属对聚合物(MOP)修正程序：呈现金属对聚合物髋关节修正术以治疗trunionosis的患者，

11.仅修正程序：在对侧具有金属对金属全髋的患者。

主要/次要结果变量

·主要终点：预测ALTR坏死的血清和滑液生物标志物

·次要终点：

-使用外科医生和组织学分级系统将阳性生物标志物结果与术中ALTR相关联。评分系统见附录2

-使用外科医生和组织学分级系统使术前钴和铬离子水平与术中ALTR相关联。

治疗给予

术前访视：

在术前访视时，病人将根据病史和纳入/排除标准进行筛查。请求符合标准的患者自愿参加。同意参加的患者在收集任何研究数据或进行研究过程之前需要签署知情同意书。

术前从患者抽取血样以测试各种血清生物标志物。将两管血液(约8.0mL或约2茶匙)注入4mL红盖(血块激活剂)血液收集管中。将管轻轻颠倒5-6次，使其凝结至少30分钟(或直到凝结可见)。在1小时内将管在室温以1,300g离心15分钟。用无菌移液管抽吸每个分离的血清样品并移至2或多个冷冻管中。每个冷冻管应含有最少0.5mL血清。如果样品离心15分钟后血清少于1mL，则在1,300g下再次离心10分钟。将剩余的血清置于一或多个冷冻管中。

所有血清管都标有一个去识别的研究ID号码并保存在最低-50qC或更低的温度下，直到运送到实验室。至少每天记录一次冷冻温度，以确保样品保持在-50℃的最低温度。一个冷冻样品保留在原位；所有其它冷冻管根据实验室的要求在干冰上运送至实验室。该实验室会通知患者，并经常更新患者招募。保留样品保存在冰箱中直到研究结束或者直至实验室要求将其运输或销毁。带有患者姓名和相应研究ID号码的总清单由研究人员保存，不与任何外部人员分享。

从所有患者收集如下数据：

·资格筛查

·患者人口统计资料

·患者病史

·术中并发症

从仅具有金属对金属修正患者收集如下额外数据：

·病史评估

·术中组织损害

·病理学报告，包括组织的显微镜组织学检查

·常规术前铬-钴实验室结果。

手术访视:

在手术开始时的手术室中，患者的外科医生从手术髋关节抽取滑液样品。样品等分入没有凝血激活剂的两个红顶样品管中。所有试管都标有一个去识别的研究ID号码并保存在-20℃的最低温度。

将一个样品管以1000g离心10分钟。将上清等分至最少四个500uL冷冻管中。如果获得大量体液可以分入>10个小瓶，则将体液等分入10个小瓶。将所有离心的样品的冷冻管都标有一个去识别的研究ID号和字母“S”表示离心。

将第二个样品等分入最少4个500uL冷冻管中，不进行离心。如果获得大量体液可以分入>10个小瓶，则将体液等分入在10个小瓶。所有未离心的样品的冷冻管都标有一个去识别的研究ID号和字母“U”表示未离心。

检测的特定生物标志物的实例在下表1中示出。

表1

所有冷冻管均贮存在最低-50℃或更低的温度下直到运送到实验室。手术外科医生注意任何术中并发症。

手术外科医生完成术中组织损伤评分(Griffin et al.,J Arthroplasty.2012；27(8Suppl):32-6)并收集常规组织样品送至组织学实验室。病理学家完成组织学评估。

实验结果在如下实施例中描述。

实施例1：确证的坏死分析以确定在MOM全髋关节置换术中进行修正手术的需要

设计一项研究旨在开发一种生物标志物测定，将其在具有MOM全髋关节置换术(THR)的对象中用作ALTR诊断工具。

为了鉴定ALTR的生物标志物，需要比较来自ALTR患者的样品与来自不同疾病类别患者的样品的组成。ALTR患者中存在而在其它疾病组或正常个体中不存在的分子(典型是蛋白质)是ALTR的潜在生物标志物。生物标志物发现程序的一个关键方面是从多个疾病类别获取并检测充分鉴定的患者样品。

该研究是一项多中心前瞻性队列研究。为了使成功鉴别血清生物标志物的机会最大化，使用多分析物测定法生物标志物测试来分析所有样品。该研究的主要终点包括鉴别预测ALTR坏死的血清和滑液生物标志物。次要终点包括使用外科医生和组织学分级系统确定阳性生物标志物结果与术中ALTR的关联。

该研究的一个重要方面是关于血液金属离子浓度、金属染色、囊外液量、组织学坏死和ALVAL评分包括滑膜内层的描述、任何炎性浸润的性质和整体组织机构鉴定MOM样品。患者和样品的广泛鉴定可以鉴别疾病特异性生物标志物。

实施例2：靶生物标志物

如果描述或怀疑其参与观测到的ALTR的组织病理学的分子机制，则选择这样的生物标志物蛋白进行分析。具体而言，选择巨噬细胞、淋巴细胞、T细胞介导的免疫、迟发型超敏反应、先天免疫、坏死、凋亡、细胞增殖、骨溶解、伤口愈合、骨重塑和氧化应激的生物标志物。一般炎症和PJI的生物标志物也包括在内。总共有8种多元Luminex检测方法用于分析82种不同的生物标志物。另外，使用单项ELISA和酶测定分析了17种生物标志物(图1)。

实施例3：生物标志物初步筛查

对于大量的靶生物标志物(99)，鉴定ALTR生物标志物的过程始于组装相对少量的待分析的滑液样品。所有测定均根据厂商建议略做修改进行。除了MOM样品外，将来自PJI、OA和无菌关节患者的汇集的滑液样品用作对照(图2)。

在初步筛查中，从无菌关节患者(3个无菌样品集合在一起)、骨关节炎(OA)(5个OA样品集合在一起)和PJI(4个PJI样品集合一起)制备滑液样品集合，并针对99个人生物标志物在测定中分析5个单独的MOM样品。如本文所用，无菌样品取自ALTR或PJI低概率的对象；OA样品取自未进行关节置换手术的OA对象，PJI样品取自经历关节置换手术且具有已证实的微生物感染的对象，MOM样品取自具有不是由感染引起的有症状的/疼痛的MOM关节植入体的对象。分析前将所有样品冷冻保存。在测试之前，将解冻的样品(200μl)用透明质酸酶(20μl，浓度为10mg/ml)处理以降低滑液的粘度，过滤并通过0.2μm膜离心及在测定缓冲液中稀释(1:3至1:100)。

本文所用的所有方法中的大多数包括用于确定样品中生物标志物浓度的标准曲线，然而无一试剂盒经特别确认用于滑液。在4个疾病类别(无菌、OA、PJI和MOM)中的每一个类别中分析的大多数生物标志物的滑液浓度是未知的。测定在缓冲液中的不同稀释度的每种样品以增加检测在该方法的运行范围内的浓度的可能性及评估滑液基质对测定性能的影响。如果样品中的生物标志物浓度低于最低标准，则结果报告为“超出范围低值”(OOR<)。在一些测定中，生物标志物浓度高于最高标准，将其进一步稀释并重新运行或者报告为“超出范围高值”(OOR>)。基于使用不同样品稀释确定的生物标志物浓度之间的一致性、重复测量的精确性及标准曲线的背景计算值来判断每种测试方法产生的数据的质量。

在初步筛查中，99个生物标志物中的大约三分之一的生物标志物在大多数测试样品中呈阴性。值得注意的是，IFNγ、TNF和IL-12均为阴性。虽然其它研究人员也报道了在滑液中关于这些生物标志物的相似发现，但结果令人惊讶，因为这些生物标志物是迟发型超敏反应的标志，许多研究人员认为所述疾病机制之一是ALTR的主要潜在原因之一。选择经目测数据示出MOM与3个对照集合样品之间有差异的生物标志物用于下一步分析(图3、4A-4B)。

实施例4：二次生物标志物筛查

二次生物标志物筛查涉及更少的生物标志物(23)和更多数量的样品(68)，使用与初步筛查中使用的相同测定。测试每个疾病组的更大数量的各个样品使得能够对数据进行ROC曲线分析以建立组间截断浓度以及临床灵敏性和特异性。对于每个生物标志物，68个样品中的一些样品含有在该测定的运行范围内的浓度，一些样品含有在该范围之外的浓度，或高或低。超出范围的样品指定为浓度等于样品稀释系数乘以低标准浓度或高标准浓度，这取决于样品浓度是否分别超出低或高范围。比较无菌对照和MOM数据以及所有3个对照组(无菌、OA和PJI)和MOM样品的数据，通过ROC曲线分析计算截断浓度。

在二次筛查中，针对23个独特的人生物标志物分析了68个个体滑液样品。样品包含18个无菌、20个MOM、10个OA和20个PJI各个患者滑液样品(图5A-5C、6A-6B和7A-7P)。与初筛结果类似，INFγ、TNF和IL-12在几乎所有测试样品中都是阴性的，IL-1α和IL-1β也是如此。IL-6和IL-8示出对MOM样品显示出高灵敏性，但在PJI样品中也都升高。使用从无菌(对照)样品和MOM(患者)样品计算的ROC截断值，三种生物标志物IL-15、MIP1α和OPN示出100％特异性。使用从所有对照样品(无菌、OA和PJI)对MOM样品计算的截断值，IL-15是100％特异性的。两种生物标志物PDGFB和IL-15对两种计算截断值的方法都具有高灵敏性和特异性(图8、9A-9H、10A-10D和11A-11D)。

在这些研究中，除OPG在所有10个样品中均检测到之外，大多数生物标志物在OA样品中呈阴性。这与报道OPG作为OA生物标志物的文献是一致的。OPG在一些MOM样品中也是阳性的。

使用针对PJI确定的截断值或者本文确定的ROC截断值，PJI生物标志物HNE、AD和乳酸盐不是MOM样品的良好生物标志物。相反，非常低浓度的PJI生物标志物CRP具有约80-90％的灵敏性和特异性。PJI中CRP的截断值>3mg/mL，而诊断MOM样品的截断值<0.5(图12)。这些发现提示CRP在区分PJI和MOM样品的算法中可能起作用。

实施例5：诊断ALTR和PJI的多种生物标志物和算法

感染和ALTR均是需要手术干预的严重状况。治疗感染的程序也可以解决由于与植入物反应而引起的潜在ALTR。感染(例如PJI)和ALTR之间的区别是医生应该考虑的重要因素，这种区分可以使用本发明的诊断算法实现。

在本文提出的算法中，医生需要排除感染是导致关节损坏的原因。例如，100个关节损坏的人群可能有20个感染、10个ALTR和70个无菌性/非ALTR损坏。

组合使用多种标志物以获得期望的临床灵敏性和特异性，以确定对象中PJI和ALTR之间的差异。

算法中初步筛查的目标是鉴别最高被感染潜力或者具有高可能性无菌/非ALTR的样品。然后使用对于ALTR更加确定的其它标记来评估不能由初步筛查分类的样品

下表2列出了本发明实验中收集的一组生物标志物实例。示出感染(例如PJI)和无菌/非ALTR两个主要类别。另外，示出可以证实ALTR存在的4种生物标志物组合。Pos＝阳性，Neg＝阴性。

表2：生物标志物

另外，在本发明中测试的每种生物标志物均呈现出与各个样品独特的反应模式。一些生物标志物呈现出与样品类别相似的模式，但对于每个类别中的不同成员而言是阳性或阴性的。可以将生物标志物与重叠反应性组合在一起，使得一组2或3种生物标志物一起提供优于单独各个生物标志物的临床表现。在这些研究中，IL-8示出在MOM和PJI样品中都升高，因此不能区分二者。然而，使用由AD和CRP的第一组生物标志物组成的诊断算法以去除PJI样品，随后用包含PDGFB或IL-15组合IL-8、MIP1α或OPN的第二组生物标志物分析，使得能够高度准确地临床诊断PJI和ALTR(图13)。

下文概述了鉴别本发明的一些生物标志物如何以不同组合用于区分和诊断ALTR和PJI的算法的另一个实例。

1)单独使用α防御素(AD)、CRP、正五聚蛋白3和IL-8或者以任何及所有组合诊断患者是否具有ALTR、PJI或二者。

2)单独使用PDGFB、IL-15、CRP、MIP1a、OPN和FASL或者以任何及所有组合诊断ALTR。

3)单独使用AD、CRP、正五聚蛋白3和IL-8或以任何及所有组合诊断患者具有PJI或ALTR，及在进一步分析中去除阴性样品，然后单独使用PDGFB、IL-15、CRP、MIP1a、OPN和FASL或者任何及所有组合用ALTR或PJI样品诊断ALTR。

简而言之，AD、CRP和IL-8的使用特别有助于首先鉴别具有ALTR、PJI或两者的患者，及在随后的分析中去除阴性样品。接下来，PDGFB和IL-15的使用与在ALTR患者中区分ALTR与PJI相关。本发明的生物标志物的许多其它组合也是有用的，并且应该考虑用于诊断ALTR和PJI及区分二者。

概述

PDGFB和IL-15已示出是区分MOM ALTR与PJI、无菌和OA滑液样品的高度灵敏和特异性生物标志物。也已经鉴别了其它生物标志物，当其组合在一起时产生具有良好临床表现的多元组。已经开发了使用多种生物标志物的算法以诊断和区分具有骨科植入体的患者中的PJI和ALTR。

本文引用的每个专利、专利申请和专利公开的内容在此以其全部内容并入本文作参考。

虽然已经参照具体实施方案揭示了本发明，但显而易见的是本领域的其它技术人员在不偏离本发明精神和范围的前体下可以设计本发明的其它实施方案和变化方案。所附权利要求旨在解释为包括所有这些实施方案和等价变化方案。

Claims

1.一种用于治疗具有植入体的测试对象的不良局部组织反应(ALTR)的方法，所述方法包括：

a.请求测试以确定测试对象在得自所述测试对象的体液样品中是否具有至少一种ALTR生物标志物；

b.将所述测试对象的体液样品中的所述至少一种生物标志物的水平与对照水平进行比较，其中与所述对照水平相比，所述测试对象的体液样品中的所述至少一种生物标志物的水平的差异是测试对象中的ALTR的指示；及

c.其中当检测到ALTR时，测试对象经历治疗性干预。

2.一种诊断和治疗具有植入体的测试对象的ALTR的方法，所述方法包括：

b.对诊断的测试对象进行诊断的治疗性干预。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述生物标志物是选自如下的至少一种：中性粒细胞防御素1，C-反应蛋白，生长调节α蛋白，中性粒细胞弹性蛋白酶，白介素1-α，白介素6，白介素8，白介素12-β，白介素15，CXC基序趋化因子10，乳酸盐，瘦素，单核细胞趋化蛋白1，单核细胞趋化蛋白3，C-C基元趋化因子22，肿瘤坏死因子受体超家族成员11B，骨桥蛋白；血小板衍生生长因子亚基B，正五聚蛋白-3，肿瘤坏死因子α，血管内皮生长因子，肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1。

4.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物选自白介素15、血小板衍生生长因子亚基B、骨桥蛋白、肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1。

5.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物选自白介素15、血小板衍生生长因子亚基B和骨桥蛋白。

6.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物选自白介素8、C-反应蛋白、白介素12-β、白介素15、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白3、正五聚蛋白-3和肿瘤坏死因子配体超家族成员6。

7.诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

c.通过评估得自植入部位的体液样品中选自白介素15和肿瘤坏死因子配体超家族成员6的至少一种T细胞活性生物标志物的存在，评估测试对象的植入部位是否存在T细胞，其中如果在所述样品中检测到所述至少一种生物标志物，则所述测试对象被诊断为具有ALTR；及

d.建议对所述测试对象进行治疗性干预。

8.一种诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过评估得自植入部位的体液样品中选自单核细胞趋化蛋白1和单核细胞趋化蛋白3的至少一种巨噬细胞生物标志物的存在，评估测试对象的植入部位是否存在巨噬细胞，其中如果在样品中检测到所述至少一种生物标志物，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

b.建议对所述测试对象进行治疗性干预。

9.一种诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

b.建议对所述测试对象进行治疗性干预。

10.一种诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过测量包括正五聚蛋白-3的至少一种生物标志物的水平分析得自测试对象的植入部位的体液样品中局部炎症反应的存在；

b.将测试对象的体液样品中正五聚蛋白-3的水平与对照水平进行比较，其中当与对照水平相比，检测到得自植入部位的体液样品中正五聚蛋白-3的水平升高时，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

c.建议对所述测试对象进行治疗性干预。

11.一种诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

a.通过测量包括C-反应蛋白的至少一种生物标志物的水平分析得自测试对象的植入部位的体液样品中全身炎症反应的存在；

b.将测试对象的体液样品中C-反应蛋白的水平与对照水平进行比较，其中当与对照水平相比，检测到得自植入部位的体液样品中C反应蛋白的水平降低或相似且测试对象不具有升高的指示感染的生物标志物时，则测试对象被诊断为具有ALTR；及

c.建议对所述测试对象进行治疗性干预。

12.一种诊断具有植入体的测试对象中ALTR的方法，所述方法包括：

b.当检测到所述检测剂时，提供测试对象具有ALTR的诊断；及

c.提供建议对所述测试对象进行治疗性干预。

13.一种在具有植入体的测试对象中区分ALTR与假体周围关节感染(PJI)的方法，所述方法包括：

a.请求测试以确定测试对象在得自该测试对象关节的体液样品中是否具有至少一种ALTR或PJI的生物标志物；

b.将所述测试对象的体液样品中所述至少一种生物标志物的水平与对照水平进行比较，其中与所述对照水平相比，测试对象的体液样品中所述至少一种生物标志物的水平的差异指示测试对象具有ALTR和PJI中的至少一种；及

c.其中当指示ALTR和PJI之间的区别时，推荐适合于诊断的测试对象病症的状况的治疗性干预。

14.一种在具有植入体的测试对象中区分ALTR和PJI的方法，所述方法包括：

a.请求测试以确定测试对象在得自测试对象关节的体液样品中是否具有至少一种ALTR或PJI的生物标志物；

b.使用算法分析测试对象的体液样品中所述至少一种生物标志物的存在或水平，其中所述算法有助于区分测试对象中的ALTR和PJI；

c.请求进一步分析，使用另外的生物标志物使用所述算法进行检测以证实(b)；及

d.其中当指示ALTR和PJI之间的区别时，推荐对诊断的测试对象进行治疗性干预。

15.权利要求14的方法，其中所述至少一种生物标志物包含IL-6、CRP、PDGF或者OPN的一或多种。

16.权利要求14的方法，其中所述至少一种生物标志物包含IL-8和/或OPN。

17.权利要求14的方法，其中所述另外的生物标志物包含PDGF。

18.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中所述治疗性干预是修正手术。

19.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中所述体液样品包括选自血液、血清和滑液的至少一种。

20.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中所述植入体是假体。

21.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中所述植入体是选自髋、膝、肩、踝和腕的至少一种。

22.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中ALTR是选自超敏性、金属超敏性和组织坏死的至少一种状况。

23.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中具有植入体的测试对象中ALTR的指示或诊断的灵敏性为至少45％，且特异性为至少90％。

24.权利要求1、2、7-17任一项的方法，其中所述对象是人。

25.一种试剂盒，其包含针对至少一种生物标志物的抗体或寡核苷酸探针组及其使用说明，所述生物标志物选自中性粒细胞防御素1、C-反应蛋白、生长调节α蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、白介素1-α、白介素6、白介素8、白介素12-β、白介素15、C-X-C基序趋化因子10、乳酸盐、瘦素、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白3、C-C基序趋化因子22、肿瘤坏死因子受体超家族成员11B、骨桥蛋白；血小板衍生生长因子亚基B、正五聚蛋白-3、肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子配体超家族成员6和可溶性细胞间粘附分子-1，其中所述说明包括：

a.测量得自测试对象的体液样品中所述生物标志物的水平；

b.提供ALTR或PJI存在或不存在的指示；及

c.提供建议所述对象是否应进行治疗性干预。