CN108226522A - 一种基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的Cys C诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的Cys C诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒、制备及使 用方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内Cys C的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

胱抑素C(cysteine proteinase inhibitor C，Cys C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-微球蛋白，分子量为13.3KD，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。

研究发现除血清外，尿液中胱抑素C也是反应肾脏损伤的早期指标。传统习惯一般把尿素氮、肌酐作为常规肾功能的检测项目，但因肾脏有强大的储备能力和代偿能力，在肾小球受损早期或轻度受损时，血中尿素氮、肌酐仍可维持在正常水平，只有在严重肾小球损害，一般肾小球滤过率降低50％以下时，血尿素氮、肌酐浓度才明显升高。因此，Cys C是较血清尿素氮、肌酐有更高的敏感性和特异性，对于评价肾小球滤过率有非常重要的价值。研究还发现尿液中的胱抑素C水平与肾功能不全患者肾小管损伤之间存在显著相关性，提示尿 Cys C作为肾小管损伤的一个敏感指标。另外，发现在糖尿病肾病早期，尿Cys C、NAG、β2- 微球蛋白的浓度均升高，尿Cys C显著升高，尿Cys C可作为糖尿病早期肾小管损伤的评价指标。尿液Cys C浓度比血清肌酐、血清Cys C更能反映肾病早期损害的情况，且对肾病的阳性检出率更高。尿胱抑素C相对于α1-微球蛋白和β2-微球蛋白而言，有较高的灵敏度和特异性。因此尿液Cys C的检测对临床实践有重要价值。

Cys C是迄今基本满足理想内源性GFR标志物要求的内源性物质。是新近发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。可以代替：复杂的全血检测；24小时小便收集；体表面积和肌酐清除率的计算；患者受放射物质的照射。

Cys C的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。其中单向免疫扩散法一般用于定性检测；酶免疫测定法操作时间长，且较繁琐，对实验员的要求较高；基于免疫层析的时间分辨荧光免疫法虽然灵敏度较高，但是CV较大，目前尚无解决的可行办法；放射免疫法因为放射污染，逐渐被淘汰；目前较多采用的颗粒增强免疫比浊法，技术已趋于成熟，操作简便，干扰因素少，但液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。

为解决上述问题，如果能利用Cys C的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对肾脏疾病诊断的Cys C快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于肾脏疾病的监测，可以及时反映肾脏疾病症状，准确反应病情变化，则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测Cys C的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术Cys C检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗Cys C体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗Cys C抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗Cys C抗体为针对Cys C不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗Cys C抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗Cys C抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗Cys C抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗Cys C抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CysC 抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗Cys C抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(Cys C)，5-抗Cys C抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗Cys C抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗Cys C抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗Cys C抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗Cys C抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CysC 抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、8μg/ml的Cys C标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品，加入50μl抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量Cys C标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算Cys C的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入Cys C浓度(μg/ml)	测量Cys C的浓度(μg/ml)	回收率(％)
				1	0.5	0.52	104.0
2	1.2	1.14	95.0
				3	3.5	3.35	95.7
4	6.0	5.80	96.7

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01ug/ml。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到CysC阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到Cys C阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到Cys C阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25 μg/ml、50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的Cys C阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在95.6％-104.7％之间。表明基于双分子荧光互补技术的Cys C试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与北京九强Cys C试剂盒的相关性为：y＝0.996x-0.011，R²＝0.999。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗Cys C抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗Cys C抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗Cys C抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗Cys C抗体为针对Cys C不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗Cys C抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与CysC抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的Cys C检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗Cys C抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与Cys C抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。