JP2008046018A - 液体試料中のアルブミンを測定するための液状試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】尿などの液体試料中の微量アルブミンを特異的かつ簡便に、免疫学的測定法に匹敵するほどの感度で、免疫学的測定法では容易に測定できない変性アルブミンも含めて高感度に測定することのできる液状試薬を提供する。
【解決手段】液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬において、緩衝液と、化学式１で示される化学構造を有するアルブミン測定用指示薬と、増感剤としてのヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性高分子と、を含ませた。

【選択図】なし

Description

本発明は、液体試料中のアルブミンを高感度かつ特異的に測定するための液状試薬に関する。

生体試料中の蛋白質を測定することは、病理学的診断において重要である。たとえば、肝臓機能が低下した場合には、血清アルブミンの量が減少する。一方、腎炎、ネフローゼ症候群、結石、腫瘍等の腎・尿路疾患の場合には、尿中の蛋白質の量が増加する。また、近年では、生活習慣病である糖尿病、肥満、高血圧、あるいは動脈硬化に起因する心筋梗塞や脳梗塞等の危険性のある患者においても、尿中のアルブミンの量が増加することが指摘されている。生活習慣の改善や介入治療として降圧剤や抗脂血漿剤を投与して効果があった場合は、尿中アルブミンが減少する。従って、尿中に微量に排泄されるアルブミンを高感度に、特異的に、簡便に、安価に測定することは、これらの疾患の診断、治療効果の判定や、重篤な生活習慣病に進行させない個人の予防意識を向上させる動機付けになる重要な指標となり得る。

高感度に尿中アルブミンを測定する目的のために、各種測定方法が開発されてきた。特に、近年、心筋梗塞や脳梗塞の発症リスクが高いメタボリックシンドローム（中心肥満症候群）の概念が提唱され、上記の糖尿病性腎症の尿中アルブミンの診断基準以下でもメタボリックシンドロームを発症していることが報告されている。

米国糖尿病学会の提唱している糖尿病性腎症である微量アルブミン尿の診断基準は、２０ｍｇ／L（２ｍｇ／ｄＬ）である。この診断基準付近を正確に測定するために、測定法として２０ｍｇ／L（２ｍｇ／ｄＬ）以下が精度良く測定できる方法が要望される。その方法の最低検出感度は１〜５ｍｇ／Ｌ（０．１〜０．５ｍｇ／ｄＬ）まで測定できる必要がある。

アルブミンを含む尿中蛋白質のスクリーニング検査として、試験紙法が汎用されている。試験紙法では、主に蛋白質誤差法が用いられている。この方法は、ｐＨ指示薬として、たとえばテトラブロムフェノールブルー（ＴＢＰＢ）が用いられており、アルブミンの等電点付近でアルブミンのアミノ基があたかも塩基性を示し、ｐＨ指示薬であるＴＢＰＢを発色させる。試験紙法にするためには、ＴＢＰＢと緩衝剤を濾紙などに含浸乾燥させて、プラスチックフィルム片に貼付して尿蛋白測定用試験紙を作製し、スクリーニング用として広く用いられている。

尿中アルブミンを高感度に測定できる蛋白誤差法を用いた試験紙法が開発された。ｐＨ指示薬として、ビス（３’，３’’−ジヨード−４’，４’’−ジヒドロキシ−５’，５’’−ジニトロフェニル）−３，４，５，６−テトラブロモスルホフタレインを用いた試験紙法で、検出感度は１０ｍｇ／Ｌである。ＴＢＰＢ法よりも高感度化されているが、まだ感度が低い課題があった。

さらに、尿中アルブミンを高感度に測定できる蛋白結合法（疎水結合）を用いた試験紙法が開発された。アルブミン結合色素として、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨード−フルオレセイン二ナトリウム塩（慣用名：アシッドレッド９４、ローズベンガル）を用いた試験紙法で、検出感度は同様に１０ｍｇ／Ｌである。（特許文献１）

高感度かつ特異的に尿中微量アルブミンを測定する方法として、免疫比濁法や免疫ラテックス凝集法などの免疫法が一般に用いられている。これら免疫法は１ｍｇ／Ｌ（０．１ｍｇ／ｄＬ）まで測定できる高感度な方法であり、免疫反応であるためにアルブミンに特異性が高い方法である。

ところが、尿中に排泄されるアルブミンには変性アルブミン（立体構造が変化したもの、薬物やビリルビンが結合したもの、糖化やスルフォニル化したもの、側鎖が切断された低分子アルブミン等）が多く排泄されているが、精密定量法として最も良い方法であると信じられてきた免疫法も、これらの変性アルブミンを測定することができないことが指摘されている（非特許文献１）

国際公開ＷＯ２００４／０１５４２３号公報 Clinical Chemistry 50: 2286-2291, 2004. Characterization of Immunochemically NonreactiveUrinary Albumin Tanya M. Osicka and Wayne D. Comper

尿中蛋白質のスクリーニング検査として多用されているＴＢＰＢを指示薬として用いた試験紙法の最低検出感度は１５ｍｇ／ｄＬで、米国糖尿病学会の微量アルブミン尿の診断基準である２０ｍｇ／Ｌ（２ｍｇ／ｄＬ）の低濃度付近のアルブミンを測定できない課題があった。当然、上記の診断基準を満足させるための最低検出感度：１〜５ｍｇ／Ｌ（０．１〜０．５ｍｇ／ｄＬ）付近では検出不可能か、又は差異を定量的に識別できない。

非特許文献１に記載されているような、各種変性アルブミンを測定する方法として、液体クロマトグラフィー法や電気泳動法を用いて分離分析して測定する方法があるが、高価な特別な装置が必要であり、また操作が煩雑で実用向きではない。信頼性向上のために、各変性アルブミンに対する抗体を作製して混合抗体で免疫学的に測定することも考えられるが、さらに高コストになり、極めて現実性が無くなる。

そこで本発明は、尿などの液体試料中の微量アルブミンを特異的かつ簡便に、免疫学的測定法に匹敵するほどの感度で、免疫法では容易に測定できない変性アルブミンも含めて高感度に測定することのできる液状試薬を提供することを課題とする。

本発明は、液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬であって、緩衝液と、下記化学式１または下記化学式２で示される化学構造を有するアルブミン測定用指示薬と、増感剤としての水溶性高分子と、を含むことを特徴とする、液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬。

本発明者らは鋭意研究の末、先述の特許文献１に記載のアルブミン測定方法を改良し、さらに高感度に、さらにアルブミンに特異的である処方を見出し、本発明を完成させた。これにより、免疫学的測定法にも匹敵する感度を有しながら、より低濃度のアルブミンを特異的に測定できる。また、特許文献１に記載のアルブミン測定方法は、蛋白質自体を染色することが原理であり、抗原認識部位の有無や性質にとらわれないために、本発明では免疫学的測定法では容易に測定できない変性アルブミンも測定することが可能となった。

また、本発明の液状試薬を用いる場合には、変性アルブミンをも同時に測定するために、液体クロマトグラフィー法や電気泳動法を利用した高価で操作が煩雑な特別の装置が不要であり、本発明の液状試薬は指示薬として比較的に安価で入手容易な試薬を用いている。そのため、本発明の液状試薬は、安価かつ簡易にアルブミンを高感度で測定することができる。

本発明の液状試薬は、アルブミン測定用指示薬として、色素結合法で用いられるハロゲン化キサンテン系色素のうち、下記化学式３で示される化学構造を有するアシッドレッド９２（一般名：フロキシンＢ（Phloxine B））または下記化学式４で示されるアシッドレッド９４（一般名：ローズベンガル（Rose Bengal））を使用するものである。

本発明の液状試薬におけるアシッドレッド９２（上記化学式３）およびアシッドレッド９４（上記化学式４）の濃度は、測定対象である微量アルブミンの濃度によって変更可能であり、たとえば０．０１〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましくは、液状試薬に含有される指示薬の濃度は、０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌとされる。

本発明の液状試薬はさらに、緩衝液および増感剤を含んでいる。

緩衝液としては、ｐＨ１．５〜４．５の範囲で良好な緩衝能を有し、アルブミン測定用指示薬とアルブミンとの反応を阻害しないものであれば何れでもよい。緩衝液としては、たとえばリンゴ酸緩衝液、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ギ酸緩衝液、あるいは酢酸緩衝液を使用することができる。液状試薬における緩衝液の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．１〜１．５Ｍ、好ましくは０．３〜１．０Ｍとされる。

増感剤としては、水溶性高分子が使用される。本発明で使用される水溶性高分子としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルエーテル、あるいはカルボキシメチルセルロースを挙げることができ、その中でもとくに、ヒドロキシプロピルセルロースを使用するのが好ましい。液状試薬における水溶性高分子の濃度は、たとえば０．１〜５．０ｗｔ％とされ、好ましくは０．２〜３．０ｗｔ％とされる。

増感剤としては、水溶性高分子に加えて、他の種類のものを使用することもできる。水溶性高分子以外の増感剤としては、エタノールあるいはメタノールなどの低級アルコールを使用することができる。

本発明の液状試薬は、基本的に、一液系の形態でも、二液系の形態でも使用できる。二液系の形態の場合、アルブミン測定用指示薬（アシッドレッド９２又はアシッドレッド９４）と増感剤とが、別個の溶液（Ｒ１試薬およびＲ２試薬）として独立して存在させられ、液体試料中のアルブミンを測定する直前にＲ１試薬とＲ２試薬とを混合して使用される。

ここで、Ｒ１試薬は、増感剤と緩衝液と、を含んだものとされる。Ｒ１試薬における増感剤および緩衝液の濃度は、Ｒ２試薬と混合したときの最終濃度が先に説明した濃度範囲となるように設定される。

一方、Ｒ２試薬は、アルブミン測定用指示薬（アシッドレッド９２又はアシッドレッド９４）と緩衝液と、を含んだものとされる。Ｒ２試薬におけるアルブミン測定用指示薬および緩衝液の濃度は、Ｒ１試薬と混合したときの最終濃度が先に説明した濃度範囲となるように設定される。

二液系の液状試薬では、Ｒ１試薬に所定量の液体試料を添加して混合することにより、混合液を検体盲検として使用することができる。液状試薬を二液系とする場合、１回のアルブミン測定において、Ｒ１試薬の量は、たとえば１００〜３００μＬとされ、Ｒ２試薬の量は、たとえば５０〜２００μＬとされ、液体試料の量は、たとえば５〜４０μＬとされる。

本発明の液状試薬は、尿、血液、髄液、唾液、涙液、胃液、及びアルブミン含有液（例えば、輸液、組織抽出液、蛋白精製液、食品等）などの液状試料中のアルブミン濃度を測定するために使用することができ、液体試料が尿検体である場合に特に有用である。

次に、本発明を、以下の実施例により説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に制限されない。

本実施例では、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２またはアシッドレッド９４を含む液状試薬において、増感剤としてのヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）が、アルブミン測定用指示薬とアルブミンとの反応性に与える影響について検討した。

アルブミン測定用指示薬とアルブミンとの反応性は、液状試薬３５０μＬと試料２０μＬとを混合して３７℃で１０分間インキュベートした後の吸光度に基づいて評価した。

液状試薬の処方は、下記表１に示す通りとした。

試料としては、プール尿にアルブミンを添加してアルブミン濃度を調整したものを使用した。試料におけるアルブミン濃度は、０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌおよび５００ｍｇ／Ｌとした。

吸光度は、「自動分析装置７１７０」（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各試薬について各アルブミン濃度の試料に対して３回ずつ測定した。測定波長は、表１における試薬Ｎｏ．１〜３については主波長を５４６ｎｍ、副波長を８００ｎｍとし、表１における試薬Ｎｏ．４，５については主波長を５７０ｎｍ、副波長を８００ｎｍとした。吸光度の測定結果は、各液状試薬について、各アルブミン濃度の試料に対する３回の測定の平均値として、下記表２に示した。また、図１として、アルブミン濃度と吸光度の平均値との関係を示した。

表２から分かるように、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２を用いた場合には、液状試薬中にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含ませた試薬Ｎｏ．１，２は、液状試薬中にＨＰＣを含ませていないＮｏ．３に比べてΔＡＢＳ(１５０−０)が大きくなった。すなわち、液状試薬中にＨＰＣを含ませた場合には、アルブミン濃度変化に対して吸光度が大きく変化することが分かった。

また、図１から分かるように、液状試薬中にＨＰＣを含ませた試薬Ｎｏ．１，２は、ＨＰＣを含ませていないＮｏ．３に比べてアルブミン濃度が５００ｍｇ／Ｌでの吸光度が大きく、アルブミン濃度と吸光度（ＡＢＳ）との関係が高い直線性を示している。したがって、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２を用いる場合に液状試薬中にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含ませた場合には、ＨＰＣを含ませない場合に比べて測定精度および感度が上昇することが分かる。

一方、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９４を用いた場合も同様に、表２および図１から分かるように、液状試薬中にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含ませた試薬Ｎｏ．４は、ＨＰＣを含ませていないＮｏ．５に比べてΔＡＢＳ(１５０−０)が大きく、アルブミン濃度変化に対する吸光度変化が大きく、またアルブミン濃度と吸光度（ＡＢＳ）の関係が高い直線性を示している。したがって、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９４を用いる場合に液状試薬中にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含ませた場合にも、ＨＰＣを含ませない場合に比べて測定精度および感度が上昇することが分かる。

本実施例では、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２またはアシッドレッド９４を含む液状試薬において、増感剤としてのヒドロキシプロピルセルロースが、最低検出感度に与える影響について検討した。

アルブミン測定用指示薬とアルブミンとの反応性は、液状試薬３５０μＬと試料２０μＬとを混合して３７℃で１０分間インキュベートした後の吸光度に基づいて評価した。

液状試薬の処方は、下記表３に示した通りとした。

試料は、プール尿にアルブミンを添加してアルブミン濃度を１０ｍｇ／Ｌに調整するとともに、この１０ｍｇ／Ｌ試料を精製水で希釈して希釈系列（下記表４参照）として調製した。

吸光度は、「自動分析装置７１７０」（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各試薬について各アルブミン濃度の試料に対して５回ずつ測定した。測定波長は、表３における試薬Ｎｏ．１，２については主波長を５４６ｎｍ、副波長を８００ｎｍとし、表３における試薬Ｎｏ．３，４については主波長を５７０ｎｍ、副波長を８００ｎｍとした。

吸光度の測定結果は、各液状試薬について、各アルブミン濃度の試料に対して５回の測定の平均値（ａｖｅ）として、下記表４に示した。表４においてはさらに、アルブミンの最少検出感度の演算結果について同時に示してある。

ここで、アルブミンの最小検出感度は、「試料（０ｍｇ／Ｌを除く）の吸光度の平均値（ａｖｅ）−２×標準偏差（ｓｄ）」が、「精製水（アルブミン濃度が０ｍｇ／Ｌ）の吸光度の平均値（ａｖｅ）＋２×標準偏差（ｓｄ）」と重ならない濃度として求めた。
標準偏差（ｓｄ）、

表４から分かるように、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２およびアシッドレッド９４を用いた場合には、液状試薬中にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含ませた試薬Ｎｏ．１，３では、液状試薬中にＨＰＣを含ませていないＮｏ．２，４に比べて最少検出感度が小さくなった。すなわち、アルブミン測定用指示薬としてアシッドレッド９２およびアシッドレッド９４を用いる場合にはＨＰＣを含ませることにより、アルブミンの検出感度が向上し、低濃度において適切にアルブミン濃度を測定できることが分かった。

実施例１における吸光度の測定結果を、アルブミン濃度との関係において示したグラフである。

Claims (8)

1. 液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬であって、
   緩衝液と、
   下記化学式１または下記化学式２で示される化学構造を有するアルブミン測定用指示薬と、
   増感剤としての水溶性高分子と、
   を含むことを特徴とする、液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬。
   

   

   
2. 水溶性高分子は、ヒドロキシプロピルセルロースである、請求項１に記載の液状試薬。
3. 水溶性高分子の含有量は、０．１〜５．０ｗｔ％である、請求項１に記載の液状試薬。
4. アルブミン測定用指示薬の濃度は、０．０１〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の液状試薬。
5. アルブミン測定用指示薬の濃度は、０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項４に記載の液状試薬。
6. 緩衝液の濃度は、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の液状試薬。
7. 緩衝液は、リンゴ酸緩衝液である、請求項１に記載の液状試薬。
8. 液体試料は、尿、血液、髄液、唾液、涙液、胃液、及びアルブミン含有液（例えば、輸液、組織抽出液、蛋白精製液、食品等）である、請求項１に記載の液状試薬。
   

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