CN103344768B

CN103344768B - 缺血性心脏病检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103344768B
Application number: CN201310286843.8A
Authority: CN
Inventors: 黄君富; 罗阳; 蒋天伦; 府伟灵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103344768A

Abstract

本发明公开了一种缺血性心脏病检测试剂盒及其应用，所述的试剂盒包括HSA一抗，QD偶联的HSA二抗复合物，Co²⁺，PBS缓冲溶液。采用本发明的试剂盒，可以准确地检测到真正的IMA值，不受极高或极低的总的HSA浓度的干扰，其检测速度在20-30min即可完成，尤其适合于IMA这种需要快速得出结果的生物学指标。

Description

缺血性心脏病检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体而言，涉及一种缺血性心脏病检测试剂盒及其应用。

背景技术

缺血性心脏病(IHD)是由于脂质代谢不正常，在动脉内膜一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块，这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄，使血流受阻，导致心脏缺血，产生心绞痛，是临床常见的心脏血管急症，也是造成急性死亡的重要原因。目前缺血性心脏病(IHD)是导致世界范围内死亡和伤残的首要疾病。据统计1760万的美国人受该病影响，并造成每年大约45万的美国人因该病死亡。因此，临床工作者一直致力于寻找一种敏感的心肌缺血标志物，能在IHD早期可逆阶段检出，这对于提高IHD早期诊断和减少死亡率具有重要的临床意义。

传统检查方法都不能作为诊断心肌缺血的“金标准”，现目前IHD的诊断主要依靠于心电图，影像和各种生化标志物的联合诊断。生化标志物如：肌钙蛋白，CK-MB以及肌红蛋白被认为是早期诊断IHD最为重要的指标。其中，CK-MB与乳酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶联合检测是一种常规诊断心肌损伤的方法。但其持续时间短，受损的骨骼肌肉同样也能够释放上述酶进入血液里，大大降低了特异性，故此方法很大程度上限制了IHD的诊断。而肌钙蛋白与CK-MB相比，虽提供了更高的特异性来诊断心肌损伤，但它总是在发病后12小时才达到峰值，不利于在IHD早期心肌损伤可逆阶段做出诊断。

近年来，学者观察到不稳定型心绞痛和心肌梗死发作早期患者的人血清白蛋白(HSA)转化为缺血修饰白蛋白(IMA)，揭示IMA可用于心肌缺血的早期诊断。IMA与传统的心肌坏死指标不同，在心肌缺血发作后5-10min血中浓度即可升高，能够辅助临床医生早期明确缺血的诊断，早期干预治疗，改善患者的预后和减少病死率，且具有更高的敏感、特异性。之前质谱法分析揭示了IMA与HSA之间的差异仅仅依赖于最后四个氨基N-末端的变化，且已定位在HSA氨基末端N-天门冬氨酸(Asp)-丙氨酸(Ala)-组氨酸(His)-赖氨酸(Lys)序列的变化上。并且由于IMA和HSA抗原之间无显著差异，几乎所有现有的常规免疫或生化检测无法准确量化IMA的浓度。

直到现在，经FDA批准的IMA的检测方法也只有一种：白蛋白钴结合试验(ACB)。该方法的原理是基于血清中正常白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，Co²⁺可与白蛋白N-末端结合，溶液中的游离Co²⁺浓度较低，而心肌缺血患者血清中含有较多的修饰白蛋白，加入同样浓度的氯化钴溶液后，由于IMA丧失了与Co²⁺结合的能力，使溶液中存在较高浓度的游离钴，加入二巯苏糖醇(DTT)，溶液可与游离Co²⁺发生颜色反应，以分光光度法测定其吸光度，即可推测IMA含量。但ACB检测结果易受多种因素干扰，从检测原理上看ACB试验检测IMA是通过测量与未改变的HSA(iHSA)结合后游离的Co²⁺，从而间接反应溶液中IMA浓度。这种间接方式易受HSA总体水平过高或过低的影响。此外，它的潜在影响的因素也很多，例如螯合剂和溶血的存在，这就要求在分析前排除任何可能的干扰。因此，ACB方法并不能检测真实的IMA浓度。

因此，需要采用更为先进的技术以消除内源性干扰。那么如何保证其检测的特异性？在本文中，我们提出了一种新型无干扰检测技术即量子点耦合x射线荧光光谱技术(Q-XRF)，用于IMA的准确检测。通过计算总HSA水平和iHSA水平之间的差异，以确定真正的IMA值。

发明内容

本发明的目的是提供一种缺血性心脏病检测试剂盒及其应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种缺血性心脏病检测试剂盒，其特征在于所述的所述的试剂盒包括HSA一抗，QD偶联的HSA二抗复合物，Co²⁺，PBS缓冲溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括基质材料，所述的基质材料选自玻片、纤维素膜和/或聚乙烯多孔板。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒的一个应用，所述的应用为在制备检测缺血性心脏病的试剂盒中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒用于检测血液中的IMA含量。

本发明另一方面涉及一种检测离体样本血液中IMA含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)总HSA测定：

采用物理吸附法将HSA一抗标记在基质上或者通过氨基和羧基间的脱羧反应将HSA一抗标记在基质上；

将一定量的待测样品溶液加入基质上，37℃下反应15-25分钟，然后采用清洗液进行清洗三次；然后加入QD标记的二抗到基质上，再次温育15-25分钟；基质用洗涤缓冲液洗涤三次后，进行荧光强度测定，通过检测相应的荧光成像与浓度间的回归方程确定待测样品中总HSA的含量；

(2)iHSA测定：在一定量的待测样品溶液中Co²⁺溶液，待其反应3-7min后，使用缓冲液清洗掉未结合的Co²⁺，再加入少量的PBS缓冲液进行x光谱检测得到待测溶液中Co²⁺的浓度，通过建立标准曲线即可获得iHSA的准确浓度；

IMA的计算：采用公式：IMA＝总HSA-iHSA进行IMA的计算。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测是非诊断目的的。

采用本发明的试剂盒，可以准确地检测到真正的IMA值，不受极高或极低的总HSA的干扰，其检测速度在20-30min即可完成，尤其适合于IMA这种需要快速得出结果的生物学指标。

附图说明

图1：Q-XRF法检测IMA原理示意图；

图2：总的人血清白蛋白(HSA)检测的标准曲线；

图3：未改变的HSA(iHSA)检测的标准曲线；

图4：量子点试剂保存时间与荧光强度的关系；

图5：干扰试验结果；

图6：ACB和Q-XRF结果均值。

具体实施方式

患者

标本采集时间为2011年1月至2013年1月第三军医大学附属西南医院临床标本采集。所有的参与者被分为两组：缺血性心脏病或非缺血性心脏病组。非缺血组表明诊断显示没有心肌缺血的迹象，或参与者普遍健康。非缺血组有125个样本(74名男性和51名女性)，平均年龄35岁。

缺血组64个样本(34名男性和30名女性)平均年龄39.4岁。首先将肾脏疾病患者从这项研究中排除。心肌缺血(MI)的临床判断包括一些客观的临床指标如：影像学检查，心电图研究和血清心肌生化标志物。具体如下：肌钙蛋白明显的上升和逐渐下降或CK-MB更快速的上升和下降，心肌坏死的生化标志物至少有下列之一现象：1缺血症状；2有病理性Q波在心电图上；3反映缺血的心电图改变；4冠状动脉介入。

ELISA微孔板和HSA标准物的制备

抗白蛋白单克隆抗体(克隆HSA-9)通过被动吸附到微孔板的底部上以实现一抗的包被，包被好的微孔板干燥并储存在4℃下。用稀释缓冲液(PBS，pH为7.4，用0.05％Tween-20)将HSA标准物溶解，并连续稀释成一系列浓度为0.001，0.01，0.1，1，10，和100mg/mL的标准品。IMA标准品由由怡康科技公司提供，IMA的浓度使用ACB方法验证。结果表明一抗浓度为7mg/L时可以获得较好包被效果。

QD-HSA复合物的制备

QD-HSA复合物根据Invitrogen提供的方案进行制备。首先，生物素标记的HSA第二抗体(克隆HSA-11)和QD-链霉生物素结合物混合，并轻微搅拌，在25℃下孵育2小时，最后形成量子点-二抗复合物。接下来，进行QD-二抗复合物的浓缩和纯化前的吸光度和荧光光谱的测量。采用Bradford法检测偶联前后溶液中蛋白质的量，从而确定人血清白蛋白抗体的耦合效率。

IMA测定

IMA的浓度确定通过计算总HSA和未改变HSA(iHSA)水平之间的差异，具体检测原理见图1。人血清白蛋白(HSA)的总浓度使用量子点标记的免疫夹心法测定，而未受影响的HSA(iHSA)则使用x射线荧光光谱法进行测定。在x射线荧光光谱法中，首先在微孔中加入100μl含有HSA的样品，而阴性对照中则加入PBS缓冲液作为对照。微孔板温育15分钟后，用洗涤缓冲液(0.15MNaCl的0.1M的PBS，pH为7.2，用0.05％Tween-20)洗涤三次。将氯化钴溶液加入微孔，并保温3分钟，以完成Co²⁺和iHSA之间的结合。除去未结合的Co²⁺，使用洗涤三次后，进行x射线荧光光谱法测定微孔板。

X射线荧光光谱法测定

采用40千伏和100μA的Amptek迷你型x光管来产生一次x射线。该管用嵌合黄铜准直器(直径为2毫米针孔)将x-射线集中到目标。x-射线光谱仪中包含一个固态检测器，一个数字脉冲处理器和多通道分析器，数据采集和分析用计算机。采用25μm厚的银过滤器和一个250微米厚的铝过滤器作为组合过滤器，以减少背景信号，从而提高低能量(0-15千电子伏)的频谱区域信噪比。为了使检测的x光集中在每个微孔位置，我们将x射线源固定在微孔板顶部4cm处。通过记录6.93和7.65kev位置的的钴元素的x射线荧光光谱峰，以确定完整的iHSA的浓度。

总HSA检测：使用量子点标记的夹心免疫分析测定

在上述检测后的微孔中，加入100μl的量子点标记的抗人血清白蛋白的单克隆抗体(第二抗体)，并温育20分钟。微孔板用洗涤缓冲液洗涤三次后，进行荧光测定。由于量子点在565nm处的荧光强度与总HSA的浓度成正比，通过使用HSA标准物质建立标准曲线，Y轴为荧光强度，x轴为总的HSA浓度。最后，通过总HSA浓度减去未改变的HSA浓度以获得IMA浓度。典型的标准曲线见图2和图3。

试剂保存实验

我们分别测定了不同试剂组合的保存时间。分别对单纯的链酶亲和素标记量子点、偶联二抗的量子点的荧光强度进行了长时间监测。分别取相同浓度的上述溶液，每天定时检测荧光强度3次，取其均值作为当日荧光强度。连续检测50天，观察荧光变化情况。量子点随时间变化的结果见图4。结果表明，单纯的链酶亲和素标记量子点比偶联二抗的量子点可以保存更久的时间，因此建议试剂盒对于上述试剂分开保存，待检测前才进行偶联。

分析准确性确定

在上述方法建立后，分别在一个已知浓度样本中加入三种不同浓度的IMA质控品(浓度分别为2.5U/mL、25.3U/mL、185U/mL)，然后分别对上述样品进行检测，将检测结果与标准曲线进行比对，从而得出加入质控品后的浓度，并且依据加入的浓度进行比对，从而计算出该方法在不同浓度下的回收率。回收率结果见表1。结果表明，所有的浓度IMA的回收率都在95-105％之间，提示该方法的精密度可以满足临床要求。

表1.IMA检测的回收率

原始量(U/ml)	添加量(U/ml)	检测量(U/ml)	回收率
				13.5	2.5	16.3	101.8％
13.5	25.3	38.4	98.9％
				13.5	185	199.2	100.4％

检测的特异性实验

特异性实验采用交叉反应来进行表征。分别取一定浓度的溶液来进行检测其IMA浓度。这些干扰物质包括：白蛋白(10g/L)、纤维蛋白原(4g/L)、胆固醇(7mg/L)、IgG(10g/L)、甘油三酯(5.2mg/L)、血红蛋白(5g/L)等。通过检测其荧光强度来判断该方法对其中总白蛋白结果的影响。图5结果显示：只有HSA可以产生显著的荧光信号。而任何其它添加的干扰物质均不会产生显著荧光信号，从而确保了该技术的高度特异性。

方法学对比实验

采集临床标本30份，在3000rpm速度下离心10分钟，然后提取血清。将所提取血清均分为两份。一份采用金标准ACB方法进行检测，另外一份采用我们构建的试剂盒进行检测，检测结果表明：ACB方法和Q-XRF方法在相同标本检测时，具有高度的一致性(见图6)。有个别超过2SD偏差的数据，可能源于ACB受到血清中总HSA的影响。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测离体样本血液中IMA含量的方法，所述的检测方法是非诊断目的的，其特征在于包括如下步骤：

(1)总HSA测定：采用物理吸附法将HSA一抗标记在基质上或者通过氨基和羧基间的脱羧反应将HSA一抗标记在基质上；将一定量的待测样品溶液加入基质上，37℃下反应15-25分钟，然后采用清洗液进行清洗三次；然后加入QD标记的二抗到基质上，再次温育15-25分钟；基质用洗涤缓冲液洗涤三次后，进行荧光强度测定，通过检测相应的荧光成像与浓度间的回归方程确定待测样品中总HSA的含量；

(2)iHSA测定：在一定量的待测样品溶液中加入Co²⁺溶液，待其反应3-7min后，使用缓冲液清洗掉未结合的Co²⁺，再加入少量的PBS缓冲液进行X光谱检测得到待测溶液中Co²⁺的浓度，通过建立标准曲线即可获得iHSA的准确浓度；

IMA的计算：采用公式：IMA＝总HSA-iHSA进行IMA的计算。