CN102967713A

CN102967713A - 同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN102967713A
Application number: CN2012104990622A
Authority: CN
Inventors: 马伟民; 张永顶; 马新民
Original assignee: SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法。该方法以新型荧光染料量子点替代传统的胶体金，能够准确、定量、快速、灵敏的检测人血清中的同型半胱氨酸。本试剂盒所需仪器不同于以往检验科的大型昂贵仪器，只需一台小型的荧光定量分析仪即可，实现了实时检测。

Description

同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

同型半胱氨酸（HCY）是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸的中间代谢产物，在体内由甲硫氨酸转甲基后生成。在血浆中，HCY有3种形式：HCY、HCY二硫化物和HCY——半胱氨酸。在正常人体内游离型HCY很少，约有80%与清蛋白以二硫键结合，仅小部分呈游离状态，所有统称为总HCY。红细胞是产生HCY的主要场所，血液离体后在收缩和凝固的这段时间，红细胞仍不断产生HCY并释放到细胞外液：一般认为测定血浆标本为好。关于血浆HCY正常范围的确定目前比较公认的参考范围是5～15μmol/L。

所谓HCY血症是指血浆中游离的及与蛋白结合的HCY和混合性二硫化物包括HCY和HCY巯基内酯。Kang等将高HCY血症分为：轻度15～<30μmol/L，中度30～100／μmol/L，重度>100μmol/L。

近年国内外研究发现，一些原发性高血压患者血浆同型半胱氨酸（HCY）水平明显升高，这一类高血压称为H型高血压。其血中HCY水平升高，易引起动脉粥样硬化和脏器损伤。其作用机制有以下几种：①血管内皮损伤，②平滑肌细胞增生，③血小板功能的紊乱，④脂质代谢紊乱。动脉内皮损伤，HCY可促进脂质沉积于动脉壁，泡沫细胞增加，还可改变动脉壁糖蛋白分子纤维化结构，促进斑块钙化。高HCY血症不但是原发性高血压发生的一个危险因素，可能还是一个独立的危险因素。HCY可以预测心血管事件的发生，检测血浆HCY水平对高血压的分型、预防、诊疗具有重要临床价值。

测定HCY的方法较多，在60年代只能用简单的氨基酸分析仪，方法灵敏度低、重复性差、实验数据不可靠。70年代采用第二代氨基酸分析仪检测血浆中Hcy。至80年代，发展为采用高效液相色谱法对还原成游离形式的Hcv进行测定。进入90年代，各种围绕提高分析速度，减少预处理步骤的分析方法相继出现。从近年来报道中归纳起来有：高效液相色谱法(HPL)、全自动荧光偏振免疫分析(FPLA)技术、气相色谱一质谱分析法、液相色谱一质谱分析法、高效毛细管电泳法、酶联免疫吸附法(ELISA)及放射免疫法等多种检测方法。以上方法均因为操作复杂、检测时间长、需要特殊的仪器和设备，限制了临床的推广和应用。

量子点作为一种新型的荧光染料，已广泛应用于科研领域。相对于传统的有机荧光染料和胶体金，量子点具有稳定、可定量的优点。免疫层析技术现已广泛应用于肝炎、梅毒、等传染性疾病抗原抗体及激素、药物的检测。将量子点与免疫层析技术相结合，使得该临床诊断试剂既具有稳定，可定量的优点，又能够快速、灵敏的检测特定的抗原或抗体。目前尚无量子点免疫层析技术检测同型半胱氨酸的报道和产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法。该方法以新型荧光染料量子点替代传统的胶体金，能够准确、定量、快速、灵敏的检测人血清中的同型半胱氨酸。本试剂盒所需仪器不同于以往检验科的大型昂贵仪器，只需一台小型的荧光定量分析仪即可，实现了实时检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括检测用具，该检测用具依次设置有加样区、结合物释放区、测试区、控制区和吸水区；结合物释放区包被量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体，测试区包被同型半胱氨酸，控制区包被抗鼠IgG抗体。

由于同型半胱氨酸首先与单抗结合，因此单抗的选择也非常的重要。此外，抗鼠IgG抗体的质量，是判断试剂盒及检测结果是否有效的标志。

作为信号扩增物的量子点是该试剂盒中的重点。量子点的大小、均一度、稳定性都会影响产品的最后读数。在本发明的一些实施例中，本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm。

硝酸纤维（NC）膜承载了产品的毛细管运动，选择合适的NC膜有助于提高产品的灵敏度。在本发明的一些实施例中，本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，测试区为硝酸纤维素膜。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，结合物释放区为本领域常用材料，优选为玻璃纤维膜。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒中，控制区为硝酸纤维素膜。

本发明利用量子点免疫层析法（quantum dot immunochromatography，QDIG）竞争性结合单抗原理，将量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体喷涂在结合物释放区，硝酸纤维素膜上喷涂同型半胱氨酸。随后将样品区、结合物释放区、检测区、控制区、吸水区从左至右进行安装。当血清中不存在同型半胱氨酸时，标记有量子点的同型半胱氨酸单抗由于毛细管作用沿着硝酸纤维素膜移动至检测区与该区的同型半胱氨酸结合，经激发后产生强的荧光信号；当血清中存在高浓度同型半胱氨酸时，标记有量子点的同型半胱氨酸单抗首先与血清中的同型半胱氨酸结合，因此达到硝酸纤维素膜的检测区时只有少量的偶联物能够与检测区的同型半胱氨酸结合，经激发后只能产生弱的荧光信号。根据荧光强度的大小，可判断人血清中的同型半胱氨酸浓度。浓度大于15μmol/L则可被认为是高同型半胱氨酸血症。此外，控制区包被抗鼠IgG抗体，是判断试剂盒及检测结果是否有效的标志。

本发明还提供了一种同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

获得量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体；

依次设置加样区、结合物释放区、测试区、控制区和吸水区，在结合物释放区包被量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体，在测试区包被同型半胱氨酸，在控制区包被抗鼠IgG抗体，制备获得检测工具。

在本发明提供的一些实施例中，同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法中，量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm。

在本发明提供的一些实施例中，同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法中，测试区为硝酸纤维素膜。

在本发明提供的一些实施例中，同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法中，控制区为硝酸纤维素膜。

本发明还提供了基于本发明提供的同型半胱氨酸检测试剂盒的非用于疾病诊断和治疗目的的检测方法，包括如下步骤：

取本发明提供的试剂盒，取一定浓度梯度的同型半胱氨酸标准品各100μL，加入试剂盒中检测工具的加样区待渗入，室温放置10min。将检测工具插入专用荧光定量检测仪读取同型半胱氨酸含量，根据同型半胱氨酸的浓度及相应的荧光强度，绘制标准曲线；

取本发明提供的试剂盒，取待检样品100μL，加入试剂盒中检测工具的加样区待渗入，室温放置10min。将检测工具插入专用荧光定量检测仪读取待检样品的荧光强度，根据标准曲线，获得待检样品中同型半胱氨酸含量。

本发明利用量子点免疫层析法（quantum dot immunochromatography，QDIG）竞争性结合单抗原理检测人血清中的同型半胱氨酸。该方法以新型荧光染料量子点替代传统的胶体金，用以准确、定量、快速、灵敏的检测人血清中的同型半胱氨酸。与传统的胶体金法相比，不仅灵敏度提高数十倍，而且还可以定量检测，为临床诊断和治疗提供更加准确的依据。本试剂盒所需仪器不同于以往检验科的大型昂贵仪器，只需一台小型的荧光定量分析仪即可，实现了实时检测，为各级医院和疾控中心对同型半胱氨酸定量诊断和流行病学调查提供了方便、快速的检测手段。

具体实施方式

本发明公开了一种同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种同型半胱氨酸检测试剂盒及其制备方法中所用生物材料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1试剂盒的制备

取粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm的量子点标记同型半胱氨酸单克隆抗体，获得量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体；

依次设置加样区、结合物释放区、测试区、控制区和吸水区，在结合物释放区包被量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体，在测试区包被同型半胱氨酸，在控制区包被抗鼠IgG抗体，制备获得检测工具，装配试剂盒使用说明书，获得试剂盒。

实施例2试剂盒的制备

取量子点标记同型半胱氨酸单克隆抗体，获得量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体；

实施例3基于本发明提供的试剂盒的检测方法的可行性验证

量子点免疫层析法同型半胱氨酸定量检测试剂盒：本发明实施例1提供的试剂盒。

荧光偏振免疫法(FPIA)同型半胱氨酸定量检测试剂盒：购自美国雅培公司，试剂主要成分：

试剂1(15.0m1)：s-腺苷-L一半胱氨酸荧光素跟踪剂，存在于含小牛蛋白稳定剂的磷酸缓冲液，防腐剂为叠氮化钠。

试剂2(12.4m1)：s-腺苷-L同型半胱氨酸水解酶，存在于含小牛蛋白稳定剂的磷酸缓冲液，防腐剂为叠氮化钠与抗菌剂。

试剂3(15.6m1)：反-s-腺苷-L-同型半胱氨酸，存在于含小牛蛋白稳定剂的磷酸缓冲液，防腐剂为叠氮化钠。

试剂4(15.3m1)：前处理液，包含柠檬酸，二硫苏糖醇(DTr)和腺苷。

标准品：CAL A0.0μmol/L，CAL B2.5μmol/L，CAL C5.0μmoL/L，CALD10.0μmol/L，CAL E20.0μmol/L，CAL F50.0μmoL/L。

定值质控:CONTROL L7.0μmoL/L，CONTROL M12.5μmol/L，CONTROLH25.0μmol/L。

测定样本：

定值质控：低值质控血清同型半胱氨酸=7μmoL/L；中值质控血清同型半胱氨酸=29μmol／L；高值质控血清同型半胱氨酸=40μmol/L，

标准品：同型半胱氨酸=6.5μmol/L，同型半胱氨酸=28.5μmol/L两种浓度标准。

健康查体者及不同疾病患者血清标本：收集北京大学深圳医院明确诊断的糖尿病患者、高血压患者、冠心病患者、心梗脑梗患者、慢性肾功能不全患者及健康人标本各20名，共120例空腹血液标本5ml于分离胶试管中，3000r／min，离心10min后分离血清，-80℃保存备用。

操作方法：

荧光偏振免疫法操作方法：试剂盒测定参数设置和操作按照试剂盒厂家规定进行。

量子点免疫层析法同型半胱氨酸定量检测：

取上述浓度梯度的同型半胱氨酸标准品各100μL，加入本发明实施例1制备的试剂盒中检测工具的加样区待渗入，室温放置10min。将检测工具插入专用荧光定量检测仪读取同型半胱氨酸含量，根据同型半胱氨酸的浓度及相应的荧光强度，绘制标准曲线；

取待检样品100μL，加入取本发明实施例1制备的试剂盒中检测工具的加样区待渗入，室温放置10min。将检测工具插入专用荧光定量检测仪读取待检样品的荧光强度，根据标准曲线，获得待检样品中同型半胱氨酸含量。

数据分析：采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。

结果：

精密度实验：取高值质控血清(40μmol/L)、中值质控血清(29μmol/L)，低值质控血清(7μmol/L)分别测定10次，计算批内CV，低值血清CV=3.07％，中值血清CV=3.99％，高值血清CV=4.21％；连续测定10天，计算批间CV，低值血清CV=4.00％，中值血清CV=4.79％，高值血清CV=4.58％。

相关性实验：选取120份不同疾病患者同型半胱氨酸浓度的血清标本同时用本法与雅培公司的荧光偏振免疫法对血清同型半胱氨酸水平进行测定，浓度由5.32-45.70μmol/L(FPIA测定)，两种方法的ⅹ±s分别为(19.74±9.78)μmoL/L，(17.82±8.40)μmol/L，两者相关性良好，相关系数r=0.993，作两种方法t检验，P>0.05。由此可见两者测定结果的可靠性是相同的，差异无统计学意义。

结论：基于本发明提供的试剂盒的检测方法的测定结果与荧光偏振免疫法测定结果相关性良好(r=0.993，n=120)，差异无统计学意义，P>0.05。

实施例4基于本发明提供的试剂盒的检测方法与免疫荧光法PCT定量法的比较

对试剂：免疫荧光法PCT定量检测试剂盒购自深圳新产业生物医学工程有限公司；

临床标本：78例高血压患者标本来源于北京大学深圳医院患者。静脉取血3毫升分离血清-80℃保存，待检。

实验方法：

免疫荧光法定量PCT检测：严格按照厂家试剂盒标准操作规程进行试验。标准品、质控品、标本各加20μL，然后加发光物标记抗体20μL，加荧光素标记抗体20μL，混匀，37℃水浴15min；加磁分离试剂40μL，混匀，37℃水浴5min，上磁分离器分离4min，倒去上清；加应用洗涤液400μL，混匀，上磁分离器分离4min，倒去上清；重复一次洗涤过程；直接按要求上机测试。PCT浓度与相对光强度(RLΜ)成一定的比例关系，仪器自动拟合计算PCT浓度。

本发明（量子点免疫层析法）：

结果数据：比较了两种不同方法的检测PCT结果，若以血清同型半胱氨酸≥15μmol/L为阳性阈值，检测78例高血压患者，免疫荧光法有44例阳性，量子点免疫层析法有43例阳性。卡方检验结果见表1。

表1量子点免疫层析法和免疫荧光法检测78例高血压患者血清同型半胱氨酸结果比较

组别	免疫荧光法(＋)	免疫荧光法(－)	合计
				量子点免疫层析法(＋)	42	1	43
量子点免疫层析法(－)	2	23	25
				合计	44	24	68

以免疫荧光法为标准，量子点免疫层析法检测血清同型半胱氨酸的敏感度95.4%，特异度95.8％，阳性预测值97.6%，阴性预测值92.0%，准确度95.6%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，包括检测用具，所述检测用具依次设置有加样区、结合物释放区、测试区、控制区和吸水区；所述结合物释放区包被量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体，所述测试区包被同型半胱氨酸，所述控制区包被抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm。

3.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述测试区为硝酸纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述控制区为硝酸纤维素膜。

5.根据权利要求1至4任一项所述的同型半胱氨酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获得量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体；

依次设置加样区、结合物释放区、测试区、控制区和吸水区，在所述结合物释放区包被所述量子点标记的同型半胱氨酸单克隆抗体，在所述测试区包被同型半胱氨酸，在所述控制区包被抗鼠IgG抗体，制备获得检测工具。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述测试区为硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述控制区为硝酸纤维素膜。