脱γ羧基凝血酶原微孔板化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体的,本发明提供了一种一步免疫分析方法快速、高灵敏、高特异测定脱γ羧基凝血酶原(DCP)的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术
癌症自从诞生之日起就对人类的生存健康构成了严重威胁。目前肿瘤治疗的关键在于早期发现、随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代,以血液为代表的体液蛋白质成为肿瘤标志研究领域中的热点。越来越多肿瘤标志物的发现对建立发展快速、高灵敏、高特异肿瘤标志物新型检测技术提出了更高的要求。
肝癌是世界范围内第五大常见癌症,致命率居于第三位。原发性肝癌占癌症总数的80-90%,在中国,肝癌发病率是世界其它地区的三到四倍,占世界肝癌发病总数的40%多。丙肝、乙肝、酒精肝及其它的肝脏自身免疫疾病常会引发肝硬化,从而进一步导致肝癌的产生。尽管AFP多年来一直作为HCC诊断的首选标志物,但AFP受肝炎、肝硬化的影响,并且有40%-60%的原发性肝癌人群体内AFP并不呈阳性升高,所以寻找与AFP互补的特异标志物是人们一直关注的问题。
脱γ羧基凝血酶原(DCP)又称为维生素k缺乏或拮抗剂诱发的蛋白质PIVKA-II,可以作为HCC的特异标志物,二十多年来一直是人们研究的对象,美国食品药物检验局已经将其列为HCC诊断常规检测对象。1984年liebman,H.A首次报道DCP在HCC病人体内有明显增加,可以作为HCC特异的肝癌标志物。DCP作为血清肝癌肿瘤标志物已经得到很多证实,并且肝脏细胞分泌DCP并不受肝硬化、慢性肝炎的影响,特异性高于AFP。与AFP、AFP-L3抗体无交叉,可以与之互补,联合检测HCC,降低漏检率.在1993年Liebman系统的报道了DCP和HCC的关系,大约67%的HCCs患者体内DCP含量会显著增加,超过300mAU/ml.另外在肝切除手术后观察中,使用DCP肿瘤标志物做追踪调查,与AFP相比效果更好。
检测血清DCP受多种非特异物理吸附或者非特异结合的影响,比如凝血素、凝血酶和纤维素及其类似物等的干扰比较大,因此多克隆DCP抗体在免疫分析上受到很大影响,制约其应用。随着分子生物学和基因工程的发展,DCP抗体应用到免疫分析检测上,纯化的DCP单克隆抗体的出现更是解决了交叉性大的问题。作为血清学标志物,DCP抗体出现后,人们试图建立各种免疫分析方法用于DCP的检测.目前文献中报道的方法有:电化学发光免疫分析技术、液相亲和免疫方法、免疫沉淀法、western blot、ELISA等。
近年来在日本报道、研究的比较多,但大多用于大肝癌的临床诊断,对于早期小肝癌的诊断由于检测灵敏度的限制,诊断结果不是很理想。的并且在日本有市售的酶免疫分析试剂盒,方法的灵敏度自1996年以来大大改进,现在达到10mAU/ml。临床应用方面已经有多篇报道指出DCP水平与恶性HCC具有明显的相关性。
Wako公司也研究了DCP的检测方法,开发了DCP定量测定试剂盒,采用液相亲和色谱分离的免疫方法,该方已被美国FDA认可。检测仪为LiBASys全自动分析仪。该方法不需要固相载体,而是采用复杂的色谱分离技术。Eisai公司研发了电化学发光免疫分析方法检测DCP,开发了试剂盒
PIVKA-IIEISAI,用于检测人血清中DCP含量。检测装置是
,自全动化学发光检测仪。原理:小鼠单克隆抗DCP抗体包被在固相微珠上,与DCP抗原、小鼠抗凝血酶原多克隆抗体(钌酸盐化)形成夹心免疫复合物,加入电化学发光引发剂,检测信号。全自动仪复杂,价格高,不利于在中国推广。
发明内容:
(一)解决的技术问题
本发明迎合HCC早期诊断的需要,解决了现行的DCP检测技术难题,即采用抗体纯化技术结合高灵敏的化学发光免疫分析方法,提供了一种高灵敏、高特异、操作简便、价格适宜的定量检测DCP的化学发光免疫试剂盒,该试剂盒不需要特殊的分离系统,不需要昂贵的检测仪器,便于临床推广,具有良好的市场价值。
本发明的目的是提供一种抗体纯化技术与化学发光免疫分析方法,定量测定DCP化学发光免疫分析试剂盒,很好的解决了交叉反应大的非特异问题,解决了检测灵敏度低而影响小肝癌早期诊断的问题。
本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
(二)技术方案
本发明所述检测DCP化学发光免疫分析方法及试剂盒包括:DCP校准品;DCP多克隆抗体包被的微孔板;辣根过氧化物酶标记的DCP单克隆抗体;发光底物液及浓缩洗涤液。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,DCP的标准品浓度分别为:0mAU/ml、10mAU/ml、80mAU/ml、200mAU/ml、800mAU/ml、2000mAU/ml。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,在DCP多克隆抗体包被的微孔板制备过程中,所用的包被抗体是将DCP多克隆抗体与凝血酶、凝血素和血纤维素及其类似物混合温育,高速离心,从而将抗体纯化。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,辣根过氧化物酶采用戊二醛法标记于DCP单克隆抗体上。
进一步,根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤:
1)选择合适的标准品稀释液,以选择的最佳标准品稀释液配制、DCP的纯品配置校准品;
2)纯化DCP多克隆抗体,并制备DCP多克隆抗体包被微孔板;
3)制备辣根过氧化物酶标记的DCP单克隆抗体,选择合适的酶标记物稀释液,及合适的酶标记物稀释浓度;
4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺;
5)配制浓缩洗涤液;
6)分装上述校准品、抗体包被微孔板、酶标记物、化学发光底物液、浓缩洗涤液;以及
7)组装成试剂盒。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,DCP标准品配置需要选择合适的标准品稀释液,而不采用直接的人血清稀释。目的:一方面降低去激素、去各种相关蛋白的麻烦,另一方面降低成本。以小牛血清,成牛血清,马血清,BSA蛋白溶液作比较,根据RLUS1/RLUS0比值挑选灵敏度最高的标准品稀释液。另外本发明所述DCP校准品为标准级,纯度不低于90%,包被的微孔板为96孔的微孔板条,本发明所述试剂盒为了便于用户使用,配制了浓缩洗涤液,使用时,用生理盐水稀释30倍使用。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,包被微孔板的步骤包括以下步骤:
I)包被
可采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的DCP多克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
III)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mLproclin300,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,制备辣根过氧化物酶标记的DCP单克隆抗体采用戊二醛偶联法,具体操作:
1)将12mgHRP溶于含5mgDCP单克隆抗体的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温3小时。
2)加入0.1mL 0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水),4℃放置2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
3)装入透析袋,以0.01mol/L、pH7.2 PBS,4℃透析过夜。
4)加入等量60%甘油,小量分装,-20℃保存。
本发明所述的DCP化学发光免疫分析试剂盒中,化学发光底物液包含A液和B液,其中,基于1000mL所述化学发光底物A液,包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g 4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂,其pH值为8.0~10.0;基于1000mL所述化学发光底物B液,包括0.329g过氧化脲、1ml Tween20、51.58gNa2HPO4·12H2O、8.74g NaH2PO4·2H2O,其pH值为7.0~7.6。
本发明“脱γ羧基凝血酶原微孔板化学发光免疫分析测定试剂盒”一方面可以非常灵敏地检测出原发性肝癌病人体内的脱γ羧基凝血酶原含量,对于小肝癌患者早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值;另一方面由于使用特异性提高的多克隆抗体作为包被固相,大大提高了脱γ羧基凝血酶原检测的线性范围,可以根据脱γ羧基凝血酶原含量的变化情况判断肝癌治疗效果及其病情的变化。它具有使用简便、检测快速、灵敏、稳定、可使用范围宽等优点。
该“脱γ羧基凝血酶原化学发光免疫分析测定试剂盒”的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。根据本发明的试剂盒,酶标记的抗体与载体上包被的抗体和被测样品的脱γ羧基凝血酶原形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构,因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式。另外,本发明有效地利用了化学发光技术原理,确保了检测的灵敏度。并且操作简便适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量系统,可实现大批量快检测,使用成本低,更易推广应用,特别适合广大中、小医院推广使用。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图
图2为实施例2健全性试验的(log-log线性回归)示意图
图3为本发明同国外试剂盒临床血样测值比对图
具体实施方式
实施例1 制备本发明的脱γ羧基凝血酶原化学法光免疫分析测定试剂盒
一.标准品的配制
分别以马血清、50%马血清(生理盐水稀释)、成牛血清、50%成牛血清(生理盐水稀释)、3%BSA+0.6%水解明胶蛋白缓冲液(生理盐水稀释)五种基质进行选择,优选其中灵敏度表现最高的(以RLUS1/RLUS0)表示。
S1点的配制:将10mAU溶入1ml上述五种基质,充分混匀,备用。
然后按照本发明的操作流程,即:标准品50μl,酶标记物50μl分别加入包被好的微孔板中,37℃温育40min,洗涤,加入发光底物100μl,检测S0、S1点的RLU。结果如表1所示。从结果看出BSA蛋白缓冲液做标准品基质具有最佳灵敏度,且本底值比较低。
表1:标准品基质的选择
基质 | RLUS0 | RLUS1 | RLUS1/RLUS0 |
马血清 | 1560 | 2987 | 1.91 |
50%马血清 | 1040 | 2645 | 2.54 |
成牛血清 | 1487 | 3078 | 2.07 |
50%成牛血清 | 1120 | 2807 | 2.56 |
BSA蛋白缓冲液 | 782 | 2371 | 3.03 |
二.酶标记物的制备及酶稀释浓度的确定
1、改良的戊二醛交联法标记辣根过氧化物酶(HRP)
1)将12mgHRP溶于含5mgDCP单克隆抗体的1ml PBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温3小时。
2)加入0.1mL 0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水),4℃放置2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
3)装入透析袋,以0.01mol/L、pH7.2 PBS,4℃透析过夜。
4)将透析产物移入试剂瓶加入等量60%甘油,混匀,再加入1%BSA,小量分装,-20℃保存。
2、酶标抗体浓度选定
采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度为1:5000。
3、酶标记抗体稀释液的选择
以Tris蛋白缓冲液作为酶标记物的稀释液,具体的蛋白浓度经过试验证明,采用棋盘试验确定的酶标记抗体的稀释液为:
试剂 | 分子式 | 终浓度 | 分子量 | 1000mL用量 |
三羟甲基氨基甲烷 | C4H11NO3 | 0.10M | 121.09 | 12.1g |
盐酸 | HCl | | | 调pH至7.5 |
氯化钠 | NaCl | 150mM | 58.44 | 8.8g |
牛血清白蛋白 | BSA | 1.0% | | 10g |
生物防腐剂 | Proclin300 | 0.1% | | 1.0ml |
食品红 | | 0.005‰ | | 0.1ml |
纯化水 | H2O | | | 加至1000mL |
三.DCP多克隆抗体包被微孔板
(1)DCP多克隆抗体纯化:
将DCP多克隆抗体与凝血酶、凝血素和血纤维素及其类似物混合37℃温育1小时,然后进行亲和层析,从而将抗体纯化,提高包被抗体的质量。
(2)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的DCP单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
具体地,所述包被方法为:
包被液配制及包被:可采用1000mL的0.020M pH4.2的硼酸盐缓冲液包含0.78g的NaH2PO4·2H2O和一定量的碳酸氢钠去离子水溶液,与适当浓度的DCP多克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
具体的缓冲液:
试剂 | 分子式 | 终浓度 | 分子量 | 1000mL用量 |
磷酸二氢钠 | NaH2PO4·2H2O | 0.02M | 156.01 | 0.78g |
氢氧化钠 | NaOH | | | 调pH值 |
上述物质溶解混匀后,调整pH至4.2,加入适量DCP多克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔150μL,4℃过夜。
(3)洗涤:用生理盐水洗三次。
(4)封闭液配制及封闭:
试剂 | 分子式 | 终浓度 | 分???子量???分子量 | 1000mL用量 |
磷酸二氢钠 | NaH2PO4·2H2O | 1.28mM | 156.01 | 0.2g |
磷酸氢二钠 | Na2HPO4·12H2O | 8.10mM | 358.14 | 2.9g |
水解明胶 | | 1.0% | | 10g |
生物防腐剂 | Proclin300 | 0.1% | | 1.0ml |
纯化水 | H2O | | | 加至1000mL |
将上述试剂称量好放入洁净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.0。即得本发明试剂和所述的封闭液。
每孔分别加入封闭液250μL,室温放置3小时。甩掉封闭液,在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时,然后用铅萡袋包装,进行真空封袋。贴签后置4℃保存。
四、化学发光底物A液
鲁米诺 10mM 1.7716g
4-羟基联苯 0.3mM 0.051g
4-碘苯硼酸 0.05mM 0.012g
硼酸 11.4g
硼砂 4.9g
双蒸水 定溶 1000mL
pH 8.0~10.0
五、化学发光底物B液
过氧化脲 3.5mM 0.329g
Tween20 0.1% 1ml
Na2HPO4·12H2O 51.58g
NaH2PO4·2H2O 8.74g
双蒸水 定溶 1000mL
pH 7.0~7.6
使用时A液与B液等比例混合。
六、洗涤液缓冲液
Na2HPO4·12H2O 58g
NaH2PO4·2H2O 2g
NaCl 160g
Tween-20 1ml
Proclin 300 1ml
去离子水 1000ml
调整pH至7.2︿7.4,使用时稀释30倍使用。
八、分装半成品并组装成品试剂盒
上述六步及完成本发明试剂盒的制备,成为半成品。分装半成品组装成试剂盒。作为成品试剂盒需满足临床检验的标准要求,即精密度、灵敏度、特异性及稳定性。对半成品抽查检验,检验合格,贴签后置4℃保存。
实施例2 本发明的脱γ羧基凝血酶原化学法光免疫分析测定试剂盒使用方法
一.样品前处理
取人的空腹血清,2000-4000rpm离心10min,取上清液,无需其它特殊处理,进行分析。
二.检测步骤
使用本试剂盒进行检测前,需先取出试剂盒内分装好的各药品:包被板、酶标记物、标准品室温静置,平衡到室温后使用;之后,将恒温箱或者水浴锅调至37℃;再后,准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。
使用本试剂盒按照实施例1的方法进行实验的具体操作步骤如下:
1)取出试剂盒平衡到室温;
2)将实验需要的板条放置在空板架上;
3)反应孔中加入50μL血清样品或系列标准品溶液(标准品0mAU/ml、10mAU/ml、80mAU/ml、200mAU/ml、800mAU/ml、2000mAU/ml),再加入标记物50μL,每次试验设空白1孔,然后除空白孔外,每孔加辣根过氧化物酶标记抗体溶液50μl;
4)微量振荡器上振荡30秒混匀;
5)37℃恒温温育45分钟;
6)弃去孔中溶液,用PBST洗液,自动洗板机或者手工洗板5次,在吸水纸上拍干;
7)每孔加发光底物100μl,振荡混匀,室温(22~28℃)静置5分钟;
8)用化学发光仪测相对发光值(RLU),测量时间1秒/孔;
9)分别对校准品浓度和对应RLU取对数,在建立的双对数曲线上建立标准曲线,以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的DCP的浓度,计算检测结果;
10)打印检测结果报告。
本试剂盒的校准曲线见附图1,其中,I为发光强度,C为DCP浓度(单位为μg/L),相关系数r=0.9988,Y=1.9449+1.1808X。
实施例3 本发明的试剂盒的方法学指标
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定,结果如下:
1.试剂盒灵敏度
灵敏度即可与零剂量点可区分开的浓度。同时测定10个零标准点,得RLU的平均值与标准偏差。计算RLU平均值与两倍标准偏差的差值,由内插法,从工作曲线中得出其对应浓度值。实验中测定的灵敏度为4.37mAU/ml。
2.试剂盒精密度
精密度即分析结果的重现性,配制三份高\中\低值样本各8份,在同一次分析中同时检测每份样本,每份样本的变异系数与标准偏差的比值即分析内变异系数;若高中低三份样本,在三次分析中测定值的变异系数与标准偏差的比值,即为分析间变异系数.结果表明变异系数在0.9%~7.6%之间。
表2 试剂盒精密度(批内、批间变异)
3.试剂盒准确度测定
在混合人血清中加入一定值的DCP标准品,配成溶液,浓度分别为450mAU/ml,337mAU/ml,112mAU/ml。再根据工作曲线,实际检测该溶液中DCP含量.则样品的测定值减去血清本底值,再除以DCP标准浓度值,得到回收率.回收率在一定程度上,反应方法的准确性和分析灵敏度.回收率如表2所示.三个样本的回收率分别为97%,104%,105%,即回收率在95-105%之间,符合临床应用的需要.
表3 血清样本回收率
人血清本底值mAU/ml | 标准浓度值mAU/ml | 实际检测值mAU/ml | 回收率% |
24.5 | 450 | 496.6 | 105 |
24.5 | 337 | 327.8 | 95 |
9.74 | 112 | 131.58 | 104 |
4.健全性试验
如果样品浓度超过量程范围,可以进行稀释到量程范围内以便测量.由于本方法采用BSA蛋白缓冲液作标准品基质,所以用BSA蛋白缓冲液稀释高值血清.一方面可以分析高值血清稀释后测值的可靠性,另一方面分析BSA蛋白缓冲液作基质是否与人血清有交叉.如附图2所示是BSA蛋白缓冲液以1:2,1:4,1:81:16稀释高值样品的测值曲线.由相关系数R=0.9988稀释倍数与浓度呈良好的线性关系,得出BSA蛋白缓冲液作基质与人血清几乎没有交叉,即不存在交叉反应物质.
经过上面所述大量实验,得出本发明试剂盒的方法学指标如下:
检测范围:0~2000mAU/ml;
灵敏度 :最小检出限为4.37mAU/ml;
精密度 :分析内精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于8%(n=10),
分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于8%(n=10);
准确性 :加标回收率在95~110%之间;
特异性 :和CA199、CEA、AFP等常见肿瘤标志物的交叉反应率小于0.1%。
本发明为了满足HCC早期诊断的需要,解决了现行的DCP检测技术难题,即采用抗体纯化技术结合高灵敏的化学发光免疫分析方法,检测DCP,提供了一种高灵敏、高特异、操作简便、价格适宜的定量检测DCP的化学发光免疫试剂盒,该试剂盒临床应用不需要特殊的分离系统,不需要昂贵的检测仪器,便于临床推广,具有良好的市场价值。