CN106468711A

CN106468711A - Dcp快速分离检测试剂盒

Info

Publication number: CN106468711A
Application number: CN201610809892.9A
Authority: CN
Inventors: 高琦; 李伯安; 乔雍; 郄霜; 马海雪; 刘飞; 李辉; 李艳召; 余韶华
Original assignee: Beijing Hot King Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Beijing Hot King Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2017-03-01

Abstract

本发明提供一种DCP快速分离检测试剂盒。通过本发明能快速、准确地体外定量测定人血清样本中异常凝血酶原(DCP)的含量，临床上主要用于对原发性肝细胞癌(HCC)与慢性肝病及良性肝占位性病变的鉴别诊断。

Description

DCP快速分离检测试剂盒

技术领域

本发明属于医疗器械及体外诊断细分领域。具体地，本发明涉及一种DCP快速分离检测试剂盒，和一种优选用于异常凝血酶原(DCP)快速分离检测试剂盒制备的单克隆抗体及其杂交瘤细胞。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种世界范围内常见的恶性肿瘤疾病，其发病率逐年上升，目前已跃居全球所有肿瘤发病率的第四位。HCC的死亡率较高，居全球癌症死因的第三位，全球每年大约有25万名患者死于肝癌细胞。HCC发病机制至今仍不清楚，缺少有效地早期诊断技术及方法是HCC死亡率高的重要原因。因此，早期发现和早期治疗是HCC患者生存的关键，报道显示早期阶段发现HCC，并采取有效治疗，其五年生存率可提高至50％。HCC可由多种因素诱发，如肝炎、肝硬化、致癌物质以及环境因素等，HCC恶性程度较高且易于复发、转移，但其早期诊断较为困难，容易耽误最佳治疗时期，因此一个高灵敏的HCC检测系统的研究是必要的。

凝血酶原(prothrombin)是凝血酶的前体，它由肝脏合成，参与凝血调控。正常的凝血酶原是由维生素K依赖的γ赖谷氨酰基羧化酶将位于N末端附近的10个谷氨酸(Glu)残基羧化形成γ形羧基谷氨酸(Gla)，从而使其具有正常的生理功能。在维生素K缺乏、γ乏谷氨酰基羧化酶功能异常，或肝功能受损等情况时，10个谷氨酸不能够被完全羧化，因此形成了脱-谷氨羧基凝血酶原(des-酶原carboxy prothrombin，DCP)，也称为维生素K缺乏诱导的蛋白-II(Protein induced by vitamin K absence-II，PIVKA-II)。羧化能力不足会导致10个Gla残基中的全部或一部分形成Glu残基，任何一个或多个位点谷氨酸残基羧化不全，都将产生脱-基，羧基凝血酶原(DCP)。1984年Liebman等首次报道约90％的HCC患者血清DCP升高，从此DCP作为HCC的血清肿瘤标志物得到了广泛的研究与证实，且肝脏细胞分泌的DCP肝硬化、慢性肝炎等影响。目前，DCP已被公认为HCC有用的肿瘤标志物，并逐渐被应用于临床。

目前文献报道及实际应用检测的主要方法有：酶联免疫法(ELISA)、免疫沉淀法、液相亲和免疫法、电化学发光法、Western blot方法等。Wako公司开发的DCP定量检测试剂盒采用复杂的色谱分离技术，Eilsai公司研发电化学免疫分析法检测人血清内DCP含量，Wako和Eilsai公司研制的DCP检测试剂盒均需应用到复杂的仪器设备，且仪器试剂价格昂贵，不利于推广应用。ELISA方法不需要复杂的仪器设备，但其具有需要纯手工操作，人为干扰因素较大，时间长，灵敏度低及线性范围小等缺点。

专利CN 104949971 B公开一种肝癌早期诊断试剂盒及其应用，该方法为标准ELISA方法，其检测灵敏度为2mAU/ml，线性范围未做明确记载，按照其实施例推算为10-2000mAU/ml；其检测灵敏度偏低，线性范围小，检测时间长，手工操作，使临床应用受到较大限制。

专利CN 101377505A公开一种DCP微孔板化学发光法免疫分析测定试剂盒及其制备方法，该方法实质上为ELISA检测的一种，且其测定单位为mAU/ml,mAU为酶活性单位，是一种非国际或国内标准单位，每个研究者由于使用抗体不同，酶活性单位定义也不同，因此使得DCP检测结果的溯源性较差，无法获得相对一致的检测结果，另外该方法的检测线性为4.37-2000mAU/ml；其检测灵敏度偏低，线性范围小，检测时间长，手工操作，使临床应用受到很大限制。

专利CN 104520710 A公开一种PIVKA-II测定方法、测定试剂盒，该方法主要是对人血清、血浆检测DCP结果进行一致性研究，而在临床应用的实际检测应用中，单独采集一种血液类型检测血清或血浆即满足临床需求，同时检定血清、血浆的DCP含量，需要对患者进行两种不同形式的血液采集，如采用EDTA抗凝采血管、非抗凝采血管同时采集，加重了患者的身体和经济的双重负担，且在临床操作中无实际意义；另外该方法依然采用mAU/ml作为检测单位，不利于检测的溯源性及对比性，且该专利对DCP的检测的灵敏度和线性范围的改进无任何记载；另外该专利采用抗凝血酶原单抗混合物及抗DCP单抗分别作为标记和包被，其中重点包括抗凝血酶原的制备，而对抗DCP单克隆抗体的制备，尤其是覆盖更全面的抗原表位的抗DCP单克隆抗体缺少必要的表述，但抗DCP单克隆抗体的表位的覆盖对DCP检测的灵敏度、特异性有着非常重要的作用。

高灵敏度DCP的检测依赖于高灵敏度、高特异性的抗DCP单克隆抗体。根据已有研究报道，不同病人体内DCP的羧化顺序不同，因此不同病人身体内的DCP种类和含量也各不相同，理论上，有多少种Glu存在形式就有多少种DCP蛋白。由于DCP的抗原性依赖其氨基酸残端10个谷氨酸的转化程度及其谷氨酸区的构象，因此识别不同DCP表位的抗体特异性和灵敏度尤为重要。目前的研究中，已经有一些不同的诊断HCC的单克隆抗体，例如MU3和3C10，但由于单克隆抗体的识别表位有限，不能够将所有DCP捕获，因此检测灵敏度较低。

发明内容

为了解决现有技术问题的不足，本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒，并提供了一种可用于制备DCP快速分离检测试剂盒的高灵敏度抗DCP单克隆抗体及组合物。

本发明的一方面，提供一种DCP快速分离检测试剂盒，主要组成成分包括：包被抗体、标记抗体、清洗液、底物液、定标液1、定标液2和定标稀释液。

在本发明的一个优选的实验方案中，包被抗体为经磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体，标记抗体为酶标记的抗凝血酶原单克隆抗体；或者包被抗体为经磁珠偶联的抗凝血酶原单克隆抗体，标记抗体为酶标记的抗DCP单克隆抗体；其特征在于：包被抗体、标记抗体共同与待测样品中的DCP在液相中形成免疫夹心复合物，通过经定标液标定的标准曲线准确测定样品中DCP的含量。

在本发明的一个更优选的实验方案中，抗DCP单克隆抗体为一种单克隆抗体或两种及以上单克隆抗体的组合物，其特征在于抗DCP单克隆抗体及组合物的抗原表位为不同类型的DCP抗原及DCP抗原的不同表位，至少对应SEQ ID NO:3-22所示的氨基酸序列中的两种以上，其中SEQ ID NO:2-22所示的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO 2：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCSTEEAFEALESSTATDVF

SEQ ID NO 3：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγγTCSYγγAFγALγSSTATDVF

SEQ ID NO 4：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCS

SEQ ID NO 5：ANTFLEγVRKGNLγRECVγγTCS

SEQ ID NO 6：ANTFLEEVRKGNLγRγCVγγTCS

SEQ ID NO 7：ANTFLEEVRKGNLERγCVγγTCS

SEQ ID NO 8：ANTFLEEVRKGNLERECVγγTCS

SEQ ID NO 9：ANTFLEEVRKGNLERECVEγTCS

SEQ ID NO 10：ANTFLEEVRKGNLERγCVEγTCS

SEQ ID NO 11：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγETCS

SEQ ID NO 12：ANTFLγγVRKGNLγRγCVEETCS

SEQ ID NO 13：ANTFLγγVRKGNLγRECVEETCS

SEQ ID NO 14：ANTFLγγVRKGNLERECVEETCS

SEQ ID NO 15：ANTFLγEVRKGNLERECVEETCS

SEQ ID NO 16：TCSYEEAFEALESSTATDVF

SEQ ID NO 17：TCSYEγAFγALγSSTATDVF

SEQ ID NO 18：TCSYEEAFγALγSSTATDVF

SEQ ID NO 19：TCSYEEAFEALγSSTATDVF

SEQ ID NO 20：TCSYEEAFγALESSTATDVF

SEQ ID NO 21：TCSYEγAFEALESSTATDVF

SEQ ID NO 22：TCSYγEAFEALESSTATDVF

在本发明的一个更优选的实验方案中，提供了一种抗DCP单克隆抗体及组合物的制备方法，所述单克隆抗体及组合物是针对不同类型的DCP及DCP的不同表位进行筛选组合；抗DCP单克隆抗体及组合物由杂交瘤细胞4D09和3H08生产制备，所述杂交瘤细胞4D09和3H08已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCC No.10211和CGMCC No.10210。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的包被抗体制备方法，所述包被抗体为磁珠偶联的高灵敏度抗DCP单克隆抗体，或所述包被抗体为磁珠偶联的高灵抗凝血酶原单克隆抗体；所述磁珠偶联的单克隆抗体与包被缓冲液按照比例混匀，均匀分装制备而成。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体中的磁珠包括超顺磁颗粒和/或表面覆盖有选自硅化物、多聚糖、蛋白质和纤维素中的至少之一的高分子成分的磁性颗粒。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述缓包被冲液主要包括pH7.4的0.02-0.1MPBS溶液，1％-5％的BSA溶液，0.1-1％的防腐剂，0.5-3％的甘氨酸溶液等，主要用于提高DCP检测试剂盒的灵敏度、稳定性、特异性。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的标记抗体制备方法，所述标记抗体为单克隆抗体，所述抗体标记酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶等公知酶类，并不局限于以上公知标记酶类，所述标记酶优选碱性磷酸酶；所述碱性磷酸酶与标记用单克隆抗体进行标记操作，制备成碱性磷酸酶标记的单克隆抗体，然后与缓冲液按比例混匀，均匀分装制成。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的定标液1和定标液2的制备方法，所述定标液1和定标液2由纯化的DCP基因工程抗原、纯化的DCP样本和纯化的DCP校准品得一种或两种及以上的组合物和定标稀释液按比例配制并冻干制成；所述的定标稀释液包括1-5％BSA溶液、1-5％的海藻糖溶液、10-50％新生牛血清溶液。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的清洗液制备方法：清洗液主要包括0.1M Tris缓冲液，0.1-1％的吐温溶液、0.1％防腐剂。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的底物液的制备方法，底物液可以为显色底物、荧光底物、发光底物等公知底物，并不局限于以上底物；所述底物液优选发光底物，如：3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐溶液。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒主要以瓶装、卡式、条式等方式提供，优选以卡式或条式提供；所述卡式或条式检测试剂盒更利于检验操作的简单化和标准化，更节约检测时间。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的应用方法，所述检测试剂盒适用仪器包括半自动或全自免疫分析仪，样品测定时间为20分钟以下。

在一个更优选的实施方案中，所述的免疫分析仪为北京热景生物技术有限公司生产的Maglumi系列全自动免疫分析仪(MQ60系列)及北京中航赛维生物科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪(VI-180型)。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的应用方法，所述检测试剂盒适用的样本类型为人血清样本，所述血清样本的检测结果用于对原发性肝细胞癌(HCC)与慢性肝病及良性肝占位性病变的鉴别诊断。

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒的应用方法，所述检测试剂盒的特征在于：DCP含量的检测为定量检测，经过准确精密的量值溯源，DCP含量的检测单位为ng/ml；DCP检测最低检测限≤1.0ng/mL，检测线性范围为5-20000ng/mL，线性范围内相关系数(r)不低于0.99，批内变异系数不高于8.0％，批间变异系数不高于15.0％。

与现有技术相比，本发明的技术效果在于提供一种人血清样本中DCP含量精确测定的一种DCP快速分离检测试剂盒及应用，以及生产制备该试剂盒的优选抗DCP单克隆抗体的制备方法及保存于CGMCC的杂交瘤细胞株；所述精确测定是指通过精密的量值溯源，使测定单位为ng/ml，其准确性和对比性远高于定值较为随意的酶活性单位mAU/ml；所述检测快捷是指检测者只需简单的加入待测样本等简单操作，在20min内即可完成检测，获得精确的测定结果；所述检测高灵敏性是指最低检测限可达≤1.3ng/mL,线性范围可达5-20000ng/ml。

附图说明

附图1：本发明示例性DCP快速分离检测试剂盒的最低检出限设置图。

附图2、附图3：分别为示例性DCP快速分离检测试剂盒的线性范围设置图。

附图4：本发明的示例性DCP快速分离检测试剂盒的变异系数设置图。

附图5：本发明的示例性DCP快速分离检测试剂盒实施示意图。

其中1-样本孔，2-装有底物液的试剂槽，3-装有清洗液的试剂槽，4-装有包被抗DCP单克隆抗体磁性颗粒的试剂槽，5-装有酶标记的抗DCP单克隆抗体的试剂槽，6-反应孔，7-试剂卡；其中2、3、4、5试剂槽的位置功能可以相互替换。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所述的实施例仅用于解释本发明，并不限定发明范围。

实施例1

本实施例提供一种DCP快速分离检测试剂盒，并提供一种生产制备该试剂盒的优选抗DCP单克隆抗体的制备方法。

1、抗DCP单克隆抗体制备：

本实施例中抗DCP单克隆抗体制备可以为杂交瘤细胞4D09和3H08生产制备的第1抗体、第2抗体或第1抗体和第2抗体组合物，也可以为其他商品化的抗DCP单克隆抗体。

为更好的解释本发明，抗DCP单克隆抗体制备优选第1抗体和第2抗体组合物制备；该制备方法仅为更好的解释本发明，不作为抗DCP单克隆抗体的制备及使用的限制条件。

取杂交瘤细胞4D09和3H08(由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCC No.10211和CGMCC No.10210)，杂交瘤细胞4D09和3H08复苏、活化后，选用成年BALB/c经产鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡，一周后接种至少10⁵个杂交瘤细胞进行腹腔培养，2周后采集小鼠腹水；将腹水离心后吸取上清，用proteinA亲和层析和DEAE离子交换柱相结合对获得的单克隆抗体进行纯化，即得到纯化后的抗DCP单克隆抗体；制备的抗DCP单克隆抗体可以识别多种不同的多肽序列，并能识别纯化的肝癌患者血清的凝血酶原，但不识别纯化的正常人血清中的凝血酶原。

抗凝血酶原抗体制备参照相关文献，按照公开方法制备，取纯化的正常人血清中的凝血酶原作为免疫原，与免疫佐剂一起共同免疫小鼠，取免疫后小鼠的淋巴细胞或脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，通过筛选得到与目标抗原特异性结合的抗体的杂交瘤细胞，按照制备抗DCP单克隆抗体的方法制备抗凝血酶原单克隆抗体。

2、包被抗体的制备：

包被抗体可以为抗DCP单克隆抗体，也可以为抗凝血酶原抗体组合物。

为更好的解释本发明，包被抗体优先选择抗DCP单克隆抗体；该制备方法仅为更好的解释本发明，不作为包被抗体的制备及使用的限制条件。

包被抗体的制备：概括为将磁微粒与抗DCP单克隆抗体反应形成连接物，按一定浓度加入缓冲液中配制而成。主要步骤如下：

(1)将磁珠混匀后加磁场去掉上清，用包被缓冲液清洗磁珠一次，然后加入活化剂(碳二亚胺)，常温震荡反应30min，然后去上清，加入包被缓冲液及适量抗体，常温震荡3h，反应结束后加入封闭液并震荡，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液过夜保存即可。

(2)包被缓冲液为0.1mol/L的pH5.0的MES缓冲液。

(3)活化剂碳二亚胺的终浓度为0.01-0.1g/ml。

(4)抗DCP单克隆抗体的适宜浓度为20-50ug/mg磁珠。

(5)包被结束后，加磁场弃上清，加入约10倍体积的封闭液，常温振荡至少1小时。封闭液主要组成成分为：50mM的Tris缓冲液，1-5％BSA溶液，0.1％防腐剂，pH7.4。

(6)封闭结束后，加磁场弃上清，加入约10倍体积的清洗液清洗，清洗液的主要组成成分为0.02M PBS、100nM氯化钠溶液，0.5-1％的吐温-20溶液。

(7)清洗结束后，加磁场弃上清，准确加入10倍体积的磁性颗粒保存液保存抗DCP单克隆抗体的磁性颗粒；保存液的主要组成成分为0.02-0.1M PBS溶液，1％-5％的BSA溶液，0.1％的防腐剂，0.5-3％的甘氨酸溶液，pH7.4。

3、标记抗体的制备

标记抗体可以为抗DCP单克隆抗体，也可以为抗凝血酶原抗体组合物。

为更好的解释本发明，并于包被抗体对应，标记抗体优先选择抗凝血酶原单克隆抗体；该制备方法仅为更好的解释本发明，不作为标记抗体的制备及使用的限制条件。

标记抗体制备：概括为碱性磷酸酶标记的抗凝血酶原单克隆抗体按照一定浓度加入到缓冲液中配制而成。

取与抗体质量比为2:1的碱性磷酸酶，加入与碱性磷酸酶溶液等体积的NaIO₄(12.8mg/ml，4℃现配)，4℃避光反应30分钟，然后加入与碱性磷酸酶溶液等体积的乙二醇溶液4℃避光反应45分钟；加入抗体，再加入混合液1/20体积的CBS标记缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)置4℃避光透析过夜，最后加入硫酸铵溶液，反应2小时，离心，弃去上清，沉淀用0.01mol/L的PBS溶解后置4℃避光透析过夜，透析完后加等体积甘油混匀，-20℃保存。

按比例(1:1000)将碱性磷酸酶标记的抗DCP单抗加入保存液中，混匀即得DCP标记抗体。

4、清洗液的制备：

清洗液主要组成为：0.1M Tris缓冲液，0.1-1％吐温溶液、0.1％防腐剂。

5、定标液的制备：

DCP定标液制备概括为将检验合格的DCP抗原加入定标生产稀释液中配制冻干而成。定标生产稀释液包括1-5％BSA溶液、1-5％的海藻糖溶液、10-50％新生牛血清溶液。

将高值DCP抗原冻干液进行梯度稀释稀，释至适宜浓度，检测完后放入冻干机冻干，预冻时间为2h，抽真空时间为16-24h。

6、高灵敏DCP检测系统制备：

将DCP分离试剂、DCP检测试剂、DCP清洗液、DCP底物液按照工艺规程或说明书要求，分装至相应大小的试剂瓶内，或着条装试剂的试剂条的相应孔位，然后密封。分装后的试剂与定标液、耗材反应槽、一次性取样头等组成异常凝血酶原(DCP)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)。

实施例2

本发明提供了一种DCP快速分离检测试剂盒及其应用，主要用于准确定量检测人血清样本中DCP的含量，血清样本的检测结果用于对原发性肝细胞癌(HCC)与慢性肝病及良性肝占位性病变的鉴别诊断。

以下检测步骤主要用于更好的解释本发明的使用及应用，不作为本发明应用的限制条件。

主要检测步骤如下：

1、实施例2适配仪器为：北京热景生物技术有限公司生产的Maglumi系列全自动免疫分析仪(MQ60型)。

2、MQ60检测步骤：

(1)试剂准备

a)试剂盒从冷藏环境取出时应平衡至室温方可使用。

b)定标液：向定标液1与定标液2中各加入500ul定标稀释液进行复溶，复溶后的定标液可在2-8℃保存7天，可在-20℃保存1个月。

(2)录入标准曲线数据

a)使用新批号试剂前，必须录入标准曲线数据。

b)更多信息参考相应适配仪器的操作手册。

(3)定标程序

a)使用新批号试剂时，必须录入标准曲线数据，然后进行定标。

b)定标液1与定标液2需复孔进行定标实验。

c)吸取100ul进行充分混匀的定标液加入到相应样本孔中，放入相应的适配仪器中。

d)根据相应适配仪器的操作手册进行实验。

e)注意：在第一次定标后，必须每4周进行一次定标。如仪器显示定标失败，请重新定标。

(4)质量控制实验(质控实验)

可根据使用单位建立适用于其实验室的质控方法。由于地区不同，使用的仪器不同，参考值存在一定差异，因此本说明书所提供的正常参考值仅作参考，各实验室应根据病人群体建立自己的正常参考值范围。

(5)样本实验

a)将不小于100ul的样本添加到样本位中，根据适配仪器的操作手册进行实验。

b)适配仪器将根据检测信号自动计算出各样本中被测物浓度。

c)注意：样本结果大于20000ng/mL时，要获得精确结果，要用样本缓冲液或生理缓冲液稀释后重新检测，或者报告为大于20000ng/mL的结果。

实施例3

本发明一种DCP快速分离检测试剂盒及其应用，主要用于准确定量检测人血清样本中DCP的含量，血清样本的检测结果用于对原发性肝细胞癌(HCC)与慢性肝病及良性肝占位性病变的鉴别诊断。

主要性能指标如下：

2、最低检出限：

DCP最低检出限即从DCP含量为零的点就可以区分DCP的含量。由本发明提供的高敏感性DCP检测系统检测20次DCP校准品稀释液样本，计算平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程Mean-2×SD，计算出RLU值，计算其浓度值为0.001ng/ml(详见附图1)，符合要求。实际工作中，临床样本DCP最低检出限测定值为≤低检1.0ng/ml。

3、线性范围：

选择(100±10)ug/ml的样本，稀释成为2.5ng/mL到30000ng/mL范围内的至少5个稀释浓度(xi)，按照说明书要求，在MQ60上检测，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，并计算线性相关系数r(附图2、附图3)。

由附图2计算的线性来看，在2.5～20000ng/mL和5～20000ng/mL范围内相关系数大于0.990；在2.5～30000ng/mL和5～30000ng/mL范围内相关系数小于0.990；考虑到2.5ng/ml的检测结果与理论值偏差较大，将本试剂盒的线性范围规定在5～20000ng/mL。

4、变异系数：

用同一批试剂盒测定浓度为100ng/mL和8000ng/mL的精密度样本，平行测定10次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批内精密度(CV)＝SD/Mean×100％，CV不大于8.0％。用三批试剂盒分别检测浓度在(8000±800)ng/mL水平的DCP标准品，平行测定10次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批间精密度(CV)＝SD/Mean×100％，CV不大于15.0％。(详见附图4)

5、其他技术指标：

1)回收率：采用DCP纯品配制成(20000±2000)ng/mL的浓度，按照1:9的比例加入到已知浓度的血清基质中，混合后重复测定3次取平均值，其回收率在85％～115％范围内。

2)分析特异性：采用DCP检测系统检测在人血液中容易对DCP的测量造成干扰的物质：高浓度的人血清白蛋白(HSA)和胆红素，检测结果均小于1.3ng/ml(详见下表)，因此DCP检测系统与这些物质的交叉反应很低，不会对DCP的测量造成干扰。

	HSA(2×10⁶ng/ml)	胆红素(2000ng/mL)
			测值1	0.14	0.2
测值2	0.04	0.13
			测值3	0.21	0.15
平均值	0.13	0.16

6、性能指标汇总：

经过上面所述大量实验证明，高灵敏度异常凝血酶原(DCP)的快速分离检测系统的性能指标汇总如下：

1)最低检测限：≤1.3ng/mL。

2)线性范围：5-20000ng/mL，线性范围内相关系数(r)应不低于0.9900。

3)精密度：

a)批内变异系数(CV)：检测(100±10)ng/mL、(8000±800)ng/mL两个浓度水平的样本各10次，批内变异系数应均不高于8.0％。

b)批间变异系数(CV)：检测(8000±800)ng/mL的样本10次，批间变异系数应不高于15.0％。

4)准确性：检测DCP纯品，其回收率在85％～115％范围内。

5)特异性：和其它物质的交叉反应数据如下：

交叉原	浓度	测定浓度
			HSA	2×10⁶ng/ml	≤1.3ng/mL
胆红素	2000ng/mL	≤1.3ng/mL

上述实施例描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解为对本发明的解释，而非局限于本发明实施例披露的形式，不应看做是对其他实施例的排除，而可以用于各种其他形式的组合、修改，并能够在本发明的构思范围内改动。本领域人员所进行的改动和变化在本发明构思及范围内的，都应在本发明所附权利要求保护范围内。

Claims

1.一种DCP快速分离检测试剂盒，其包括：包被抗体、标记抗体、清洗液、底物液、定标液1、定标液2和定标稀释液。

2.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述包被抗体、所述标记抗体共同与待测样品中的DCP在液相中形成免疫夹心复合物，通过经定标液标定的标准曲线测定样品中DCP的含量；且

所述包被抗体为经磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体，和所述标记抗体为酶标记的抗凝血酶原单克隆抗体；或者

所述包被抗体为经磁珠偶联的抗凝血酶原单克隆抗体，和所述标记抗体为酶标记的抗DCP单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述抗DCP单克隆抗体为一种单克隆抗体或两种以上单克隆抗体的组合物，且所述抗DCP单克隆抗体及组合物的抗原表位为不同类型的DCP抗原或者DCP抗原的不同表位，所述表位至少对应SEQ ID NO:2-22所示的氨基酸序列中的两种以上。

4.如权利要求3所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述抗DCP单克隆抗体及组合物为由杂交瘤细胞4D09和/或3H08生产的抗DCP单克隆抗体；所述杂交瘤细胞4D09和3H08已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCCNo.10211和CGMCC No.10210。

5.如权利要求2所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述磁珠偶联的抗DCP单克隆抗体中的磁珠为超顺磁颗粒和/或表面覆盖有选自硅化物、多聚糖、蛋白质和纤维素中的至少之一的高分子成分的磁性颗粒；所述酶标记的抗DCP单克隆抗体的标记酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素酶中的至少一种。

6.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述定标液1和所述定标液2由纯化的DCP基因工程抗原、纯化的DCP样本和纯化的DCP校准品的一种或两种以上的组合物配制。

7.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述试剂盒的形式以卡式或条式提供。

8.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述试剂盒的反应原理为磁微粒化学发光法，适用仪器包括半自动或全自免疫分析仪，样品测定时间为20分钟以下。

9.如权利要求1所述的DCP快速分离检测试剂盒，其适用的样本类型为人血清样本，且所述人血清样本的检测结果用于原发性肝细胞癌、慢性肝病或良性肝占位性病变的鉴别诊断。

10.如权利要求2所述的DCP快速分离检测试剂盒，其中所述DCP含量的检测为定量检测，且所述DCP检测的最低检测限≤1.0ng/mL，检测线性范围为5-20000ng/mL。