CN116535512A - 针对肝细胞癌患者的异常凝血酶原单克隆抗体的制备及应用 - Google Patents
针对肝细胞癌患者的异常凝血酶原单克隆抗体的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及针对肝细胞癌患者的异常凝血酶原单克隆抗体的制备及应用。具体地，本发明涉及特异性结合异常凝血酶原的抗体，其中所述抗体特异性结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，本发明还涉及所述抗体的用途。
Description
技术领域
本发明涉及肝细胞癌患者外周血中异常凝血酶原检测的领域。具体地，本发明涉及高特异性检测肝细胞癌患者异常凝血酶原的单克隆抗体及其用途。
背景技术
原发性肝癌是起源于肝脏的恶性肿瘤，是全球常见的癌症之一，居癌症发病顺位的第6位，预后极差，是全球第3位常见癌症死因。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，是最常见的病理组织学类型，占所有罹患原发性肝癌病例的75％-85％(Bray,Ferlay et al.2018)。在中国所有原发性肝癌中，HCC占比则高达93.0％(Lin,Zhanget al.2022)。多种危险因素与HCC的发生相关，包括慢性乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)和/或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HBV)感染、酒精及非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、药物引起的肝损伤和黄曲霉毒素暴露等。多种原因导致的慢性肝脏炎症，特别是肝硬化是HCC发生的重要环节，尤其是慢性HBV及HCV的感染及其所致的肝硬化。由于发现早期HCC手段不足，临床上超过半数HCC患者发现后已难以手术切除。当前已在临床上发展了多种针对HCC的非手术的系统性的治疗手段，但我国人群中，HCC患者的总体5年生存率由2000-2004年间的11.7％仅提高到2010-2014年间的14.1％。然而，在可手术治疗的早期HCC患者中，切除术后的5年总生存率为56.9％，特别是在巴塞罗那肝癌临床分期(BCLC)为0/A期的HCC患者中，治疗后的5年总生存率可高达69.0％-86.2％。因此，发现早期HCC患者，从而进行早期治疗是提高患者生存的关键。检测高危人群中的外周血中存在的HCC血清学标志物是发现早期HCC患者的重要手段。
凝血酶原(prothrombin)亦称第Ⅱ因子，为凝血酶的前身，是在维生素K作用下由肝脏产生的一种凝血因子，通过释放到血液中发挥功能。1981年，Blanchard等人通过制备相应的兔免疫血清(多克隆混合抗体)，在多种罹患肝脏疾病患者的体内，检测到血清中存在不同水平的异常的凝血酶原(Blanchard,Furie et al.1981)。1984年，Liebman等人报道HCC患者血清中的异常凝血酶原含量升高，与甲胎蛋白的含量无相关性，是HCC患者的一种新的血清学标志物(Liebman,Furie et al.1984)。随后的多项临床研究工作表明血清异常凝血酶原含量升高，可作为HCC诊断的血清标志物。
人凝血酶原是一个含有622个氨基酸的蛋白(GenBank:AAC63054.1)，序列如SEQID NO：1所示。在该蛋白的N端结构域中含有10个谷氨酸(Glu，缩写为E)，分别位于第6、7、14、16、19、20、25、26、29和32位，见图1。正常肝细胞在维生素K的辅助作用下，γ-谷氨酰羧化酶可将这10个谷氨酸全部转化为γ-羧基谷氨酸(Gla，缩写为γ)，生成正常的凝血酶原发挥相应的生理功能。但维生素K缺乏时及罹患多种肝脏疾病时，凝血酶原产生异常，上述N端结构域中的10个谷氨酸不能全部转化为γ-羧基谷氨酸，只能形成在其中1个或几个位点上γ-羧基谷氨酸。如图1所示。图1中仅列出其中的11种情况，10个位点可同时出现未羧化，也可单独或以多种不同的组合方式出现未羧化谷氨酸的情况，这种排列组合可能有超过10，000种的方式。
在发生肝脏疾病，包括药物导致的急性肝炎、病毒感染等引起的急性或慢性肝炎、多种病因引起的肝硬化、出现维生素K不足或存在维生素K拮抗剂情况下以及发生HCC后，甚至发生肝脏的转移性肿瘤时，肝细胞功能发生异常，γ-谷氨酰羧化酶活性降低，不能将凝血酶原蛋白N端结构域中的10个谷氨酸(Glu，缩写为E)全部转化成为Gla，(缩写为γ)，即缺失γ羧基的凝血酶原(des-gamma-carboxyprothrombin,DCP)，又被称为异常凝血酶原，或脱γ羧基凝血酶原，也被称为维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质(protein induced byvitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)(Blanchard,Furie et al.1981,Liebman,Furie et al.1984)。因此，HCC患者及多种病因导致的非肝癌的慢性肝病患者血清中均存在着不同位点上未羧化的异常的凝血酶原，同时也存在着一定水平的正常凝血酶原。
专利CN201610515896.6中公开了一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及制备方法，该方法允许同时检测多个样品(多个重复样品或不同时间点取的样品以获得动态值或不同样品)，在一定程度上降低了所需的样本量(仅需10ul)及抗体量(需12nl捕获抗体)，所需检测时间也降低(仅需1.5h)。但该方法仅能定性检测血清中是否存在DCP，临床应用有限。所采用的抗体株未知。
专利CN201710768857.1公开一种异常凝血酶原磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，该方法将酶标记技术、磁微粒分离技术和化学发光检测技术结合，采用磁微粒做固相增加了抗体有效包被量，并使用发光底物的光信号代替酶免分析中的显色底物，提高了检测范围及灵敏度。其分析灵敏度为1.53mAU/ml，检测线性范围为：8.5mAU/ml-63000mAU/ml。所采用的抗体株未知，并存在潜在交叉反应物，如人抗鼠抗体、类风湿因子等。
专利CN201911075093.3公开一种异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该方法采用链霉亲和素磁珠-生物素标记抗体-吖啶酯标记抗体体系进行DCP的检测，链霉亲和素磁珠和生物素标记可以紧密结合，减少非特异性吸附，吖啶酯分析线性范围宽。该方法检测线性范围为3-30000mAU/ml，样本检测结果重复性好，抗体稳定性较高。但所采用的抗体株未知，该专利也未对抗DCP单克隆抗体的表位覆盖情况进行描述。
抗DCP单克隆抗体的灵敏度和特异性影响了DCP检测的灵敏度和特异度。日本特开昭60 60557号公报报道了利用特异性识别DCP单克隆抗体MU 3(17 27aa)进行测定的免疫检测方法,该方法把特异性识别DCP单克隆抗体MU 3(17 27aa)作为包被抗体，简化样本预处理环节；日本特开平5 249108号公报报道了利用抗凝血酶原的兔多克隆抗体进行测定的免疫检测方法将特异识别DCP单克隆抗体MU 3(17 27aa)调整为标记抗体，减少样本中凝血酶原干扰以便获得更稳定的检测数据；H.Kinukawa等人公开了一种DCP免疫检测方法，采用了特异识别DCP的3C10(13 27aa)抗体，同时结合另外一株抗凝血酶原抗体MCA1 8(3346aa)构建了DCP的化学发光检测试剂。
由于凝血酶原N端的10个谷氨酸的羧化与非羧化，极大地影响着凝血酶原的空间构象，而这种蛋白质构象改变影响了单克隆抗体在DCP检测以及随后的诊断和/或预测HCC中的灵敏度和特异性。目前，急需能够以高特异性以及高灵敏度区分早期HCC与健康受试者、早期HCC与良性肝病、以及早期HCC与肝脏转移性肿瘤的单克隆抗体。
发明内容
为了解决上述现有技术中的问题，在一个方面，本发明提供了特异性结合异常凝血酶原的抗体，其中所述抗体特异性结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体1D5，并且其包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体1A3，并且其包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体2H4，并且其包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体4D1，并且其包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体7F4，并且其包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体由2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCCNo.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株产生，或于2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCC No.45233或CGMCC No.45235的细胞株产生。
在另一方面，本发明提供了细胞株，其为2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCC No.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株，或于2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCCNo.45233或CGMCC No.45235的细胞株。
在第二方面，本发明提供了抗体组合，所述抗体组合包含至少一种特异性结合SEQID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体，以及至少一种特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体。
在第三方面，本发明提供了本发明的抗体组合在制备用于检测来自受试者的样品中异常凝血酶原的试剂盒中的用途。
在第四方面，本发明提供了一种检测异常凝血酶原的试剂盒，优选地，所述异常凝血酶原存在于肝细胞癌患者中，所示试剂盒包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
在第五方面，本发明提供了本发明的抗体组合在制备用于诊断肝细胞癌(HCC)的试剂中的用途。
在第六方面，本发明提供了用于诊断肝细胞癌(HCC)的试剂盒，所述试剂盒包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
在第七方面，本发明提供了一种检测异常凝血酶原的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将捕获抗体包被于固体支持物，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，
ii)使待检测样品与步骤i)的捕获抗体接触；和
iii)加入检测抗体，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
附图说明
图1显示人正常凝血酶原和多种不同的异常凝血酶原。
图2显示SDS-PAGE分析目标蛋白；其中泳道1是2μl样本，泳道2是2μg BSA。
图3显示PIV-I和PIV-II抗原多肽表位序列在DCP蛋白上的空间位置信息；其中表位1(PIV-I)位于DCP蛋白N末端结构域氨基酸序列第10-27位(凝血酶原10-27位序列：KGNLERECVEETCSYEEA(SEQ ID NO：2))；表位2(PIV-II)位于DCP蛋白N末端结构域氨基酸序列第31-46位(凝血酶原31-46位序列：LESSTATDVFWAKYTA(SEQ ID NO：3))。E表示HCC患者体内存在的未羧化的谷氨酸。
图4显示制备鼠源捕获抗体(PIV-I单抗)的免疫流程示意图。
图5显示兔源捕获抗体(PIV-II单抗)制备的免疫流程示意图。
图6显示ELISA分析不同抗体配对形式识别天然构象DCP的能力；
图6的A-C：捕获抗体1A3，与测定抗体4D1(A)、2H4(B)和7F4(C)配对时，检测肝癌患者血清(7例，DCP浓度范围为50mAU/ml-750mAU/ml)和肺癌患者血清(4例，DCP浓度低于40mAU/ml)中DCP蛋白；
图6的D-F：捕获抗体1D5，与测定抗体4D1(D)、2H4(E)和7F4(F)配对时，检测肝癌患者血清(7例，DCP浓度范围为50mAU/ml-750mAU/ml)和肺癌患者血清(4例，DCP浓度低于40mAU/ml)中DCP蛋白。虚线代表截断值，截断值＝平均值(OD肺癌血清)+3×SD(OD肺癌血清)
图7A显示无肿瘤的正常人血清样本的OD450(n＝8)与肝癌患者血清的OD450(n＝7)，一个点代表一例患者；图7B显示ROC曲线的结果。
图8A显示肺癌患者血清中的OD450(n＝34)与肝癌患者血清的OD450(n＝40，雅培PIVKA-II测定值为80-3000mAU/ml)，一个点代表1例患者；图8B显示ROC曲线的结果。
图9A显示肺癌患者血清中的OD450(n＝34)与确定的肝癌患者血清的OD450(n＝22，雅培PIVKA-II测定值为<80mAU/ml)，1个点代表一个患者；图9B显示ROC曲线的结果。
图10A显示肝脏转移的肿瘤患者(n＝8)和肝癌患者(n＝4)的血清样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。1个点代表一个患者；图10B显示ROC曲线的结果。
图11A显示HBV阳性的非肝癌患者(n＝55)和肝癌患者(n＝15)的血清及血浆样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。1个点代表一个患者；图11B显示ROC曲线的结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
人凝血酶原是一个含有622个氨基酸的蛋白(GenBank:AAC63054.1)，序列如SEQID NO：1所示。在该蛋白的N端结构域中含有10个谷氨酸(Glu，缩写为E)，分别位于第6、7、14、16、19、20、25、26、29和32位，见图1。正常肝细胞在维生素K的辅助作用下，γ-谷氨酰羧化酶可将这10个谷氨酸全部转化为γ-羧基谷氨酸(Gla，缩写为γ)，生成正常的凝血酶原发挥相应的生理功能。但维生素K缺乏时及罹患多种肝脏疾病时，凝血酶原产生异常，上述N端结构域中的10个谷氨酸不能全部转化为γ-羧基谷氨酸，只能形成在其中1个或几个位点上γ-羧基谷氨酸。如图1所示。即缺失γ羧基的凝血酶原(des-gamma-carboxyprothrombin,DCP)，异常凝血酶原，也被称为维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)。因此，HCC患者及多种病因导致的非肝癌的慢性肝病患者血清中均存在着不同位点上未羧化的异常的凝血酶原，同时也存在着一定水平的正常凝血酶原。
本文所用的术语“异常凝血酶原(DCP)”、或“维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质(PIVKA-Ⅱ)”可以互换使用。
由于HCC患者血清中的异常凝血酶原并没有在注射维生素K后消失,为此，HowardA.Liebman等通过分离HCC患者的DCP，进行了蛋白的羧化特征分析，发现HCC患者的DCP平均含有5个Gla(Liebman 1989)。随后，业界采用不同来源的异常凝血酶原作为免疫原，制备了多株不同的单克隆抗体，例如采用来自HCC患者体内分离的DCP制备了克隆号为MU-3单抗，采用来自PLC/PRF/5细胞系的DCP制备了克隆号为19B7单抗(Watanabe K,Naraki T,Iwasaki Y.Acta Hepatol Jpn 1994.)。进一步的分析发现，MU-3单抗能与HCC患者体内的存在的DCP反应而被业界认可，而19B7单抗所检测到的DCP，存在于不同良性肝脏疾病患者的血清中。相关研究采用上述MU-3单抗和19B7单抗分别检测来自HCC患者和来自转移性肝脏肿瘤及慢性肝病患者体内凝血酶原中未羧化的具体位点与数目后发现，急性肝炎患者中，外周血中含有6～8个羧化谷氨酸(Gla)的异常凝血酶原即有升高，但在慢性肝病中例如慢性肝炎和肝硬化患者中升高更显著(Naraki,Kohno et al.2002,Uehara,Gotoh etal.2005)。根据MU-3单抗分析的外周血中的异常凝血酶发现，HCC患者外周血中仅含有1～4个γ-羧基谷氨酸(Gla)，羧化的位点存在于这10个谷氨酸的任何位点，即HCC患者体内的DCP所含有的γ羧化谷氨酸(Gla)最多为4个，但羧化位点不同，除蛋白N段的第6、第7位之外，HCC患者在其余位点上的谷氨酸，均可能存在非羧化的谷氨酸；而采用19B7单抗则检测到的DCP含有6个及以上羧化谷氨酸(Gla)的个数。
基于上述的研究分析，Hideki Kinukawa等采用凝血酶原N端的含有6个未羧化谷氨酸的第13 27氨基酸多肽表位作为免疫原，制备了3C10单抗(Naraki,Kohno et al.2002,Kinukawa,Shirakawa et al.2015)，并基于此单抗制备了PIVKA-II的检测试剂盒。
由于凝血酶原N端的10个谷氨酸的羧化与非羧化的排列组合，在理论上存在着10000种以上，并且这种羧化与非羧化极大地影响着凝血酶原的空间构象。这种蛋白质构象改变的检测方法依赖于针对不同羧化个数与羧化位点的特异性单克隆抗体，在获得相关的特异性抗体后，才能发展相关的检测方法，包括：酶联免疫吸附测定方法(ELISA)、放射免疫检测方法、酶联化学发光检测方法等。由于不同良性的慢性肝病(包括慢性肝炎和肝硬化)以及恶性的HCC患者和肝脏转移性肿瘤患者体内均存在不同位点与不同个数未羧化谷氨酸的DCP，因此，制备针对HCC患者体内DCP的构象改变的特异性抗体，可检测到HCC患者体内的非羧化谷氨酸的DCP，而不是良性肝病以及肝脏转移性肿瘤患者体内的非羧化谷氨酸的DCP，从而可实现对早期HCC的诊断。
在第一方面，本发明提供了特异性结合异常凝血酶原的抗体，其中所述抗体特异性结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，优选地，所述异常凝血酶原存在于肝细胞癌患者中。
在具体实施方案中，本发明提供的特异性结合异常凝血酶原的抗体为单克隆抗体，其能够特异性结合上述的异常凝血酶原的表位。
如本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白，其通常是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在具体的实施方案中，本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体是单克隆抗体。
在具体的实施方案中，本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体是IgG型单克隆抗体，例如本发明的抗体是，小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3和兔IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c。例如，本发明的IgG型单克隆抗体可以是小鼠、或兔来源。
如本文所用术语“兔源”是指通过用异常凝血酶原蛋白的片段免疫兔子获得的抗体；例如，本发明的抗体2H4、4D1和7F4；如本文所用术语“鼠源”是指通过用异常凝血酶原蛋白的片段免疫小鼠获得的抗体，本发明的抗体1D5、1A3。
如本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即，除可能的少量存在的变异抗体以外，构成所述群体的各抗体相同和/或结合相同表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制得，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、用于制造本文所描述的单克隆抗体的此类方法和其他例示性方法。
如本文所用术语“表位”是指能够特异性结合至抗体的HCC产生的异常凝血酶原上的决定簇。表位通常由氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，且通常具有特定三维结构特征，本技术涉及到HCC产生的异常凝血酶原的表位是由氨基酸上的羧化基团组成。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体1D5，并且其包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体1A3，并且其包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体2H4，并且其包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体4D1，并且其包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位，例如抗体7F4，并且其包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具体的实施方案中，根据本发明的特异性结合异常凝血酶原的抗体由2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCCNo.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株产生，或由2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCC No.45233和CGMCC No.45235的细胞株产生。
在第二方面，本发明提供了抗体组合，所述抗体组合包含至少一种特异性结合SEQID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体，以及至少一种特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体。
在本发明第二方面的具体实施方案中，特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体包含；
a)分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
b)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明第二方面的具体实施方案中，特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体包含；
c)分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d)分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
e)分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在第三方面，本发明提供了本发明的抗体组合在制备用于检测来自受试者的样品中异常凝血酶原的试剂盒中的用途。
在本发明第三方面的具体实施方案中，所述抗体组合用于定性地检测来自受试者的样品中是否存在HCC产生的异常凝血酶原，和/或用于定量地检测来自受试者的样品中异常凝血酶原的含量。
在本发明第三方面的具体实施方案中，所述来自受试者的样品为来自受试者的体液样品(例如，血浆、血清、全血、腹水、导管冲洗液)、培养中的细胞、细胞上清液。
在本发明第三方面的具体实施方案中，本发明的抗体组合可用于任何适合于检测异常凝血酶原的方法中，包括但不限于，质谱(MS)，包括液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、高压液相色谱-质谱(HPLC-MS)和快速蛋白液相色谱(FPLC)；荧光激活细胞分选仪(FACS)分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括夹心ELISA、从头蛋白质测序(例如，通过LC-MS/MS)、抗体阵列、放射免疫检测方法、酶联化学发光检测方法和它们的组合。
在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所示试剂盒包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
在第四方面的实施方案中，所述捕获抗体选自：
a)包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
b)包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体。
在第四方面的实施方案中，所述检测抗体选自：
c)包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；
d)包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
e)包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体。
如本文所用，术语“捕获抗体”是指特异性结合样品中的异常凝血酶原的抗体。在某些条件下，捕获抗体与异常凝血酶原形成复合物，使得可以将抗体-靶分子复合物与样品的其余部分分离。在某些实施方案中，此类分离可包括洗去样品中未结合捕获抗体的物质或材料。
在本发明的第四方面的实施方案中，捕获抗体可以附接至固体支持物表面，诸如但不限于板或珠，诸如磁珠。
如本文所用，术语“检测抗体”是指特异性结合样品或样品-捕获抗体组合材料中的异常凝血酶原的抗体。在某些条件下，检测抗体与异常凝血酶原或与异常凝血酶原-捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够通过标记直接检测，或间接检测，诸如通过使用被标记并结合检测抗体的另一种抗体。对于直接标记，检测抗体通常与通过某些方式可检测的部分(例如，包括但不限于生物素、荧光素或钌)缀合。
在本发明的第四方面的实施方案中，检测抗体可与可检测部分缀合。
在本发明的第五方面，提供了本发明的抗体组合在制备用于诊断肝细胞癌(HCC)的试剂中的用途。
如本文所用术语“诊断”，包括区分患有肝细胞癌的患者与正常受试者、患有肝细胞癌的患者与其他肿瘤患者、患有肝细胞癌的患者与肝转移癌患者、患有肝细胞的癌患者与慢性肝炎患者。
在本发明的第六方面，提供了用于诊断肝细胞癌(HCC)的试剂盒，所述试剂盒包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
在第六方面的实施方案中，所述捕获抗体选自：
a)包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
b)包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体。
在第六方面的实施方案中，所述检测抗体选自：
c)包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；
d)包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
e)包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体。
为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，并结合附图说明这些具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。本领域技术人员可以结合本领域的公知常识，对本发明的方法、用途进行适当的改变，只要其能够实现本发明所述的功能，即应落入本发明的范围内。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：设计与制备免疫原
HCC患者体内DCP蛋白的分离纯化
由于良性肝病患者体内的凝血酶原也含有一些未羧化的谷氨酸，为检测到HCC患者体内的存在的含有非羧化谷氨酸的DCP，而不是良性肝病患者体内的一些非羧化谷氨酸的DCP，我们从HCC患者体内分离DCP蛋白作为免疫原，从而使所制备的抗体具有识别HCC体内所存在的具有天然构象的DCP。具体步骤如下详述：
1：HCC患者腹水的预处理
根据凝血酶原的结构，推测DCP蛋白的分子量为65KD左右，因此选择截留分子量为35KD的透析袋对蛋白进行透析处理，除去腹水中的盐分等小分子物质，以便于后续采用离子交换层析分离腹水中蛋白质。
1.1.预处理透析袋
将透析袋(Union Carbide.Cat#MD77)剪截成约20cm/段，放入含有2％碳酸氢钠和1mM EDTA(pH8.0)的液体中，完全浸没透析袋，煮沸10分钟。用蒸馏水清洗透析袋除去盐溶液，并将透析袋转移至含有1mM EDTA(pH8.0)的液体中，煮沸10分钟。用蒸馏水清洗后，将透析袋转移至含有50％乙醇溶液内，存放于4℃。
1.2透析处理，除去腹水中的小分子物质
收集3例已确诊的晚期HCC患者的腹水，合并后总计约3700ml。为防止蛋白降解，向腹水中加入氟磷酸二异丙酯(Sigma.Cat#D0879)至终浓度1mM，加入苯甲脒(Sigma.Cat#12072)至终浓度1mM，加入EDTA至终浓度3mM。
使用蒸馏水清洗透析袋，除去残存乙醇，扎紧透析袋一侧，将腹水转入透析袋内。每个透析袋中约加入200ml腹水，保留1/3-1/2的空间，并扎紧透析袋另一侧。将装有腹水的透析袋转入含20mM Tris-HCl和1mM苯甲脒的透析缓冲液(PH＝7.5)内，4℃透析过夜。
2：离子交换层析法分离腹水蛋白
为了进一步纯化蛋白，我们选择离子交换层析法分离腹水中含有DCP的蛋白。
2.1收集透析后的液体，利用离子交换的原理，选用HiTrap Capto DEAE柱子(GEHealthcare,cat#28-9165-40)，使用蛋白纯化仪(GE AKTA AVANT)对蛋白进行分离。其中，上样缓冲液是含有1mM苯甲脒的20mM Tris-HCl液体，PH＝7.5。洗脱缓冲液是含有1M NaCl和1mM苯甲脒的20mM Tris-HCl，PH＝7.5。洗脱时，当洗脱缓冲液占比为25％-45％时，收集洗脱液。通过离子交换层析图谱证实检测到的蛋白(结果未显示)。
2.2将收集的洗脱液合并后，再进行一次透析(操作方法同1.2透析)，除去高浓度的盐溶液，然后将透析后的液体再过一次离子交换柱，收集洗脱液，加入氟磷酸二异丙酯至终浓度1mM。
3：超滤法进一步浓缩分离腹水中的目的蛋白
为了进一步纯化目的蛋白，根据DCP蛋白预测分子量65KD，我们分别选择分子截留量为100KD和30KD的超滤柱对上述离子交换层析操作后获取的蛋白样品进行分离。
3.1超滤柱的预处理：向新柱子内加入1ml去离子水，室温，4000g，5min离心后，弃掉滤出液。
3.2超滤及脱盐：根据DCP蛋白的预测分子量为65KD，我们先选用MWCO：100k(Ultra-15,Millipore,cat:UFC910024)的超滤管处理操作2得到的洗脱液，室温，4000g，15min，收集滤出液，此部分液体已除去分子量超过100KD的大部分蛋白；随后，我们选用MWCO：30k(Ultra-15,Millipore,cat:UFC903024)超滤管处理上述滤出液，并加入10mlPBS，4000g，20min，离心，重复洗涤三次，除去99％的高盐溶液，然后收集浓缩管内的残留液体，此部分液体已除去分子量低于30KD的大部分蛋白，且缓冲液已置换为PBS。
4：亲和层析法分离纯化多种形式的凝血酶原蛋白
为获取纯化的DCP蛋白，我们使用抗人凝血酶原多克隆抗体捕获腹水蛋白中的所有凝血酶原，包括正常和异常凝血酶原蛋白。
4.1制备分离凝血酶原蛋白的亲和层析柱：我们使用抗人凝血酶原多克隆抗体(ThermoFisher Scientific,cat#PA1-43039)包被CNBr-activated Sepharose 4B(Amersham Biosciences,cat#17-0430-01)，按照每300μl柱料加入1mg抗体，获得能够分离凝血酶原蛋白的亲和层析柱。
4.2亲和柱预处理：先向柱料内加入5×柱体积的PBS，混匀并洗柱料1次，200g，2min离心弃上清；然后使用1×柱体积的0.1M甘氨酸(PH＝2.75)洗涤柱料3遍，200g，2min离心弃上清；再用10×柱体积PBST(含有0.1％吐温的PBS)洗涤柱料3遍，200g，2min离心弃上清；用10×柱体积PBS洗涤柱料2遍200g，2min离心弃上清；然后加入等体积的PBS，重悬柱料。
4.3亲和层析：将上述超滤脱盐后的液体与预处理后的层析柱混合，4℃孵育2h，使凝血酶原蛋白与柱料充分结合。装柱子后加入10×柱体积的PBST洗涤柱子，共洗3次；加入1ml PBS重悬柱料，加入50μl 0.1M甘氨酸(PH＝2.75)缓冲液预洗柱料，随后向每个柱子加入500μl 0.1M甘氨酸(PH＝2.75)缓冲液洗脱，每500μl洗脱液中加入45μl Na2HPO3(PH＝8-9)进行中和；留取部分样本进行蛋白定量和纯度检测，剩余蛋白暂时冻存于-80℃冰箱内。
5：蛋白定量
使用BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白含量进行定量；使用SDS-PAGE鉴定目标蛋白纯化情况，结果如图2所示，泳道1是2μl样本，泳道2是2μg BSA；以BSA蛋白作为参照，使用ImageJ软件对蛋白纯度和含量进行分析。结果显示，蛋白总量50mg，目标蛋白(分子量65KD)的纯度大于95％。
设计针对HCC患者体内DCP的抗原表位
依据GenBank:AAC63054.1的序列和参考文献(Naraki,Kohno et al.2002,Uehara,Gotoh et al.2005)，我们设计了针对HCC患者体内异常凝血酶原(DCP)蛋白N末端结构域的两个抗原识别表位，目的是优化识别HCC患者体内DCP抗体的特异性，增加其与特定表位的结合力。
人凝血酶原氨基酸序列：
MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQARSLLQRVRRANTFLEEVRKGNLERECVEETCSYEEAFEALESSTATDVFWAKYTACETARTPRDKLAACLEGNCAEGLGTNYRGHVNITRSGIECQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLQENFCRNPDSSTTGPWCYTTDPTVRRQECSIPVCGQDQVTVAMTPRSEGSSVNLSPPLEQCVPDRGQQYQGRLAVTTHGLPCLAWASAQAKALSKHQDFNSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCYVAGKPGDFGYCDLNYCEEAVEEETGDGLDEDSDRAIEGRTATSEYQTFFNPRTFGSGEADCGLRPLFEKKSLEDKTERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISMLEKIYIHPRYNWRENLDRDIALMKLKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYKGRVTGWGNLKETWTANVGKGQPSVLQVVNLPIVERPVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGE(SEQ ID NO：1)
1：抗体识别表位的预测
采用B细胞表位预测程序ABCpred(Saha,S and Raghava G.P.S.(2006).Proteins,65(1),40-48)进行表位信息预测与确定。由于HCC患者血清中DCP含有的羧化谷氨酸(Gla,缩写为γ)不超过4个，即未羧化谷氨酸(Glu,缩写为E)的个数至少为是6个或6个以上。而这一空间构象的会受到临近氨基酸的影响，为此我们针对DCP的N端氨基酸序列的第10-27位，设计了表位I(简称为PIV-I)用于制备单抗，简称PIV-I单抗，氨基酸序列为KGNLERECVEETCSYEEA(SEQ ID NO:2)，这一表位的设计是基于如下原理：
(1)在这个表位中含有6个未羧化谷氨酸(缩写为E)，
(2)天然蛋白中含有由两个半胱氨酸(缩写为C),由于半胱氨酸的存在而形成二硫键，空间构象需要其它氨基酸进一步稳定，为此，我们在第14位的E之前增加了4个氨基酸(KGNL)，在第25、26位的两个E之后增加了1个氨基酸(A)。目的是保护免疫多肽表位的天然空间构象。
针对N端氨基酸序列的第31-46位，设计了表位II(PIV-II)用于制备单抗，简称PIV-II单抗，氨基酸序列为LESSTATDVFWAKYTA(SEQ ID NO:3)，这一表位的设计是基于如下原理：
(1)为检测HCC患者血清中的DCP，表位II中也含有一个未羧化谷氨酸(缩写为E)，确保检测的特异性。
各表位的空间位置信息见图3。
2：抗体识别表位的确定
由于捕获抗体所识别的抗原表位，极大地影响着检测的特异性，即区分良性肝脏病变与HCC患者，在通过计算机设计了相关的免疫多肽表位后，为确定相关免疫多肽表位是否真正存在于HCC患者所产生的DCP中，进一步采用雅培的PIVKA-II检测试剂对表位多肽及蛋白偶联的多肽进行中和分析。
2.1多肽合成：
全部在杭州中肽公司完成，纯度90％。为保证表位的特异性，分别在N端或C端偶联了不同的载体蛋白，具体见表1，其中斜体的两个C之间形成二硫键。
表1.多肽序列信息
2.2检测仪器及试剂：
使用雅培ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析系统和异常凝血酶原(PIVKA-II)测定试剂盒2P48检测样本中的DCP蛋白，具体方法如下：
1)将PIV-I裸肽(多肽1)和对照裸肽(多肽4)分别稀释至1μg/mL，将KLH偶联(多肽2)和OVA偶联PIV-I多肽(多肽3)稀释至50μg/mL，将KLH偶联(多肽5)和OVA偶联(多肽6)对照肽稀释至50μg/mL。
2)取200μl上述稀释好的多肽，与200μl雅培赋值50、500、10000mAU/ml的HCC血清混合，然后进行检测，检测结果表2所示。
表2.采用PIV-I多肽进行不同处理的DCP测定值
由此表明，所设计的多肽表位能竞争性地结合到雅培试剂的检测抗体上，是HCC患者血清中的DCP的表位。
实施例2：制备针对HCC患者DCP的捕获抗体
1：免疫原的准备
为了制备能够特异性识别HCC患者DCP蛋白的捕获抗体，即PIV-I单抗，我们使用的免疫原包括腹水来源纯化蛋白和针对DCP蛋白N末端结构域氨基酸序列第10-27位的多肽(多肽1、多肽2和多肽3，具体序列信息见表1)。
2：基础免疫与加强免疫
选择8只6-8周龄的雌性Babl/C小鼠进行皮下多点注射免疫，共免疫五次，间隔2周。第一次免疫采用100μg腹水来源纯化蛋白加等体积的弗氏完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第二次免疫采用5μg多肽1和600μg多肽2，加入等体积的弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第三次免疫采用5μg多肽1和400μg多肽2，加入等体积的弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第四次和第五次免疫采用400μg多肽3加等体积弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫。
第五次免疫后采血，使用ELISA法检测小鼠血清内的抗体效价，分析PIV-I抗体的产生情况。根据ELISA结果选择血清抗体效价较高的1～2只小鼠于融合实验前3天，腹腔注射400μg多肽2进行加强免疫。具体免疫流程见图4。
3：检测免疫后小鼠体内抗体产生，确定待融合小鼠
第五次免疫后采血，分离血清进行间接ELISA测定免疫效价。分别包被多肽1(具体序列信息见表1)或腹水来源纯化蛋白，每孔包被1μg/ml，100μl/孔。将小鼠血清按照200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍、102400倍、204800倍和409600倍进行稀释，每孔分别加入100μl梯度稀释后的血清进行检测，确定免疫后效价。测定结果见表3。
表3.ELISA法检测第五次免疫后小鼠血清中抗DCP抗体效价根据ELISA测定结果，最终决定将VQ003703P-R与VQ003703P-B进行融合4：制备杂交瘤细胞
4.1脾细胞融合
选取VQ003703P-R与VQ003703P-B小鼠，无菌取脾，制备脾单细胞悬液并与骨髓瘤细胞融合，利用半固体HTA选择培养基培养融合的杂交瘤细胞，以形成克隆(MC克隆)，按间接ELISA法对MC克隆进行筛选，选取可进一步进行有限稀释的阳性克隆培养。
4.2使用有限稀释法获得杂交瘤细胞单克隆
使用有限稀释法，对4.1阶段中确认的细胞株，进行杂交瘤细胞的单克隆化。杂交瘤细胞有限稀释至单一克隆株结束。每种克隆选择1-4株亚克隆扩培，并检测其分泌的抗体对多肽抗原的识别能力。
5：筛选捕获抗体
采用合成的多肽进行抗体株的筛选，所采用的筛选多肽信息见表1。
有限稀释过程中，阳性克隆的筛选按照常规间接ELISA进行，每孔包被1μg/ml的多肽1，100μl/孔。将细胞上清按照500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍和21000倍进行稀释，每孔分别加入100μl梯度稀释后的细胞上清进行检测，结果见表4。
表4.ELISA检测细胞上清中抗DCP抗体(PIV-I单抗)效价
根据此结果，我们从各克隆细胞株中选择一个亚克隆进行后续抗体配对与测定分析，分别是1A3(1A3-2G4)、1D5(1D5-2E2)、1A12(1A12-3B6)、2E1(1F6)、3H4(3H4-5E6)、10A1(10A1-1C2)、10A2(10A2-3E9)、15A3(15A3-1F10)和16A5(16A5-1B5)共计9个克隆细胞株。
实施例3：制备针对HCC患者DCP的测定抗体
1：免疫原的准备
为了制备能够特异性识别HCC患者DCP蛋白的检测抗体，即PIV-II单抗，我们使用的免疫原包括腹水来源纯化蛋白和针对DCP蛋白N末端结构域氨基酸序列第31-46位的多肽(多肽7和多肽8，具体序列信息见表1)。
2：基础免疫与加强免疫
选择1只兔子进行背部皮下14-16点注射免疫，共免疫五次，间隔2周。第一次免疫采用100μg腹水来源纯化蛋白加等体积的弗氏完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第二次免疫采用5μg多肽7和600μg多肽8，加入等体积的弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第三次免疫采用5μg多肽7和400μg多肽9，加入等体积的弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫，第四次和第五次免疫采用400μg多肽10加等体积弗氏不完全佐剂，制备油包水乳剂进行免疫。
第五次免疫后采血，使用ELISA法检测兔血清内的抗体效价，分析PIV-II抗体的产生情况。根据ELISA结果于分离PBMC前3天，腹腔注射400μg多肽8进行加强免疫。具体免疫流程见图5。
3：检测免疫后兔子体内抗体产生情况
免疫后采血分离兔血清进行间接ELISA测定免疫效价。分别包被1μg/ml的多肽7、多肽8和多肽11，每孔包被100μl，将兔血清进行梯度稀释，每孔分别加入100μl梯度稀释后的血清进行检测，确定免疫后效价。见表5。
表5.间接ELISA法检测第三次、四次和五次免疫后兔子血清中抗DCP抗体效价
4：制备测定抗体
4.1筛选表达PIV-II单抗的阳性克隆
对上述免疫后的兔子进行1次加强免疫，无菌收集兔子全血，分离PBMC。使用磁珠富集技术富集靶特异PBMC细胞，进行PBMC细胞接种、扩展与培养，扩增单个B细胞。
为了检测分选的B细胞产生PIV-II抗体的情况，分别包被多肽7和11，使用ELISA筛选阳性克隆。每个筛选肽最多保留16个ELISA阳性克隆，并保留同时识别多肽7与多肽11的交叉克隆。
为进一步检测上述阳性克隆对凝血酶原的交叉反应情况，分别包被羊抗兔IgG和多肽7，选取7个OD最高的ELISA阳性克隆进行下一步操作，见表6。
表6.ELISA法检测出7株同时识别兔IgG和多肽7的阳性克隆
4.2表达PIV-II单抗序列信息的真核表达质粒的制备与转染
提取上述7个克隆重链和轻链(H+L链)的mRNA，进行cDNA转录与PCR扩增，并将PCR产物亚克隆到表达载体上，提取质粒，并进行测序，分析基因序列，合并序列完全一致的克隆。
将含有IgG H+L链序列信息的真核表达质粒瞬时转染HEK293F细胞，小规模进行重组抗体测试生产(<1mL)，并使用ELISA检测抗体效价。
5：筛选识别PIV-II多肽抗原表位的测定抗体
为了检测重组抗体对多肽表位的识别情况，采用合成的多肽进行抗体株的筛选，所采用的筛选多肽信息见表1。
采用常规间接ELISA法，每孔包被5μg/ml的多肽7，100μl/孔。分别加入上述转染后的待测细胞上清(5000倍稀释)，100μl/孔。结果见表7。
表7.ELISA检测细胞上清分泌的重组抗体识别PIV-II表位多肽的情况
该结果显示，获得的重组质粒表达抗体能有效识别PIV-II多肽表位。
实施例4：确定具有识别HCC外周血中DCP的捕获抗体与测定抗体并进行配对优化
在实施例2和实施例3中，我们分别获得了基于抗原多肽表位的两类抗体，针对PIV-I多肽有9个克隆细胞株，针对PIV-II有7个克隆细胞株，这些细胞株所产生的抗体具有识别免疫多肽的能力，但并不确定一定具有识别HCC患者体内所存在的天然DCP的能力。因此，本部分的目标是基于前述已筛选到的克隆细胞株，确定其具有识别HCC患者体内所存在的天然DCP的能力，通过配对后能够特异性地检测到HCC体内的DCP。
1.初步筛选识别具有构象特征DCP的测定抗体
为了检测重组测定抗体对具有天然构象特征的DCP蛋白的识别情况，我们初步采用肝癌细胞系HepG2分泌DCP蛋白进行抗体株的筛选。
采用常规间接ELISA法，每孔包被10μg/ml绵阳抗人凝血酶原多克隆抗体，50μl/孔。加入100μl/孔的HepG2细胞培养上清(DCP浓度约为600mAU/ml)，以等体积的不表达DCP蛋白的L02细胞上清为对照。然后分别加入1μg/ml的测定抗体，100μl/孔。计算ODHepG2-ODL02，比较不同细胞株对抗原的识别能力。结果见表8。
表8.ELISA检测兔源重组测定抗体识别具有天然构象DCP蛋白的情况
| 克隆号 | ODHepG2-ODL02 | |
| 1 | 2H4 | 0.621 |
| 2 | 3B8 | 0.101 |
| 3 | 2B7 | 0.117 |
| 4 | 4D1 | 0.998 |
| 5 | 6C1 | 0.249 |
| 6 | 7F11 | 0 |
| 7 | 7F4 | 0.648 |
根据该结果，我们初步筛选出4D1、7F4、2H4和6C1四株兔源测定抗体用于后续抗体配对与优化检测。
2.确定具有识别HCC外周血中DCP的捕获抗体与测定抗体的配对信息
2.1初步筛选可能的配对抗体形式
为了获得能够检测出HCC外周血中具有天然构象特征的DCP蛋白的抗体配对信息，我们采用含有DCP蛋白的HCC患者血浆，对上述获得的9株捕获抗体和4株测定抗体进行配对筛选。
采用常规间接ELISA法，每孔包被5μg/ml捕获抗体，100μl/孔。加入100μl/孔的HCC患者血浆(阳性血浆，DCP浓度约1000mAU/ml)，以等体积的不表达DCP蛋白的血浆(阴性血浆)作为对照。然后分别加入1μg/ml的测定抗体，100μl/孔。最后加入HRP标记的山羊抗兔IgG及TMB显色，读取450nm波长处的吸光值。计算OD阳性-OD阴性，比较不同的抗体配对形式对DCP蛋白的识别能力。结果见表9。
表9.ELISA检测不同抗体配对形式识别具有天然构象DCP蛋白的情况
根据该结果，我们初步确定捕获抗体1A3和1D5分别与测定抗体4D1、7F4和2H4进行配对，能识别具有天然构象特征的DCP蛋白。
2.2确定捕获抗体和测定抗体的有效配对形式
为了进一步筛选获得有效的抗体配对形式，我们依据前述检测结果，采用1A3和1D5作为捕获抗体，分别与3株测定抗体(4D1、2H4、7F4)进行配对，使用间接ELISA法分析不同的抗体配对检测肝癌患者血清(7例，DCP浓度范围为50mAU/ml—750mAU/ml)和肺癌患者血清(4例，DCP浓度低于40mAU/ml)的情况。结果显示，捕获抗体1A3和1D5与3株测定抗体配对时，均能检测到样本中天然构象DCP蛋白(图6)。但是，与1A3相比，1D5作为捕获抗体与3株测定抗体配对后能更好的区分DCP阳性和阴性样本，尤其是当1D5与测定抗体2H4进行配对检测(图6的E)。本结果提示我们捕获抗体1D5与测定抗体2H4最佳的配对形式。
3.抗体分型及抗原互补决定区(CDR)序列测定
3.1抗体分型
采用ELISA法分析捕获抗体1A3和1D5的抗体分型。在多肽1包被的酶标板中，分别加入1A3或1D5等待测抗体，100μl/孔，37℃孵育30min后，加入50μl/孔IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM分型酶，反应30min后，洗板，每孔加入100μl显色液，反应15min后加入终止液并读板，根据结果确定捕获抗体1A3和1D5是IgG1型。
测定抗体4D1、2H4和7F4的抗体分型均为IgG。
3.2测定抗原互补决定区(CDR)序列
3.2.1捕获抗体1A3和1D5的CDR序列
分别收取106个生长状态良好的1A3和1D5杂交瘤细胞，离心后弃上清，加入1mlTrizol试剂重悬细胞，由南京金斯瑞生物科技有限公司基于PCR扩增法和国际免疫遗传学数据库(IMGT)确定抗原互补决定区(CDR)序列。相关结果如下。
抗体1A3的CDR氨基酸序列：
重链可变区CDR1(HCDR1)：SDYAWN(SEQ ID NO：6)
重链可变区CDR2(HCDR2)：FITYSGYTAYNPSLKS(SEQ ID NO：7)
重链可变区CDR3(HCDR3)：RGSRIVPTMDY(SEQ ID NO：8)
轻链可变区CDR1(LCDR1)：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：9)
轻链可变区CDR2(LCDR2)：RVSNRFS(SEQ ID NO：10)
轻链可变区CDR3(LCDR3)：SQSTHVPPT(SEQ ID NO：11)
抗体1D5的CDR氨基酸序列：
重链可变区CDR1(HCDR1)：DYKLH(SEQ ID NO：12)
重链可变区CDR2(HCDR2)：AIAPETDVTAYNQNFKG(SEQ ID NO：13)
重链可变区CDR3(HCDR3)：LWVRRGMDY(SEQ ID NO：14)
轻链可变区CDR1(LCDR1)：SASSSVTNMH(SEQ ID NO：15)
轻链可变区CDR2(LCDR2)：DISKLAS(SEQ ID NO：16)
轻链可变区CDR3(LCDR3)：QQWSSNPPT(SEQ ID NO：17)
3.2.2测定抗体4D1，2H4和7F4的CDR序列
通过对重组抗体重链和轻链核酸序列信息的分析，确定3株测定抗体的CDR序列信息，结果如下。
抗体4D1的CDR氨基酸序列：
重链可变区CDR1(HCDR1)：GFSLSRYA(SEQ ID NO：18)
重链可变区CDR2(HCDR2)：ISNSDMT(SEQ ID NO：19)
重链可变区CDR3(HCDR3)：ARWDSYSYADVGDYFGI(SEQ ID NO：20)
轻链可变区CDR1(LCDR1)：QNIGSY(SEQ ID NO：21)
轻链可变区CDR2(LCDR2)：AAS
轻链可变区CDR3(LCDR3)：LGVYGYSSADGTFA(SEQ ID NO：22)
抗体2H4的CDR氨基酸序列：
重链可变区CDR1(HCDR1)：GFSLSNYA(SEQ ID NO：23)
重链可变区CDR2(HCDR2)：IDANNINT(SEQ ID NO：24)
重链可变区CDR3(HCDR3)：ARDGPGYNTGVYFDL(SEQ ID NO：25)
轻链可变区CDR1(LCDR1)：QSIYSG(SEQ ID NO：26)
轻链可变区CDR2(LCDR2)：RAS
轻链可变区CDR3(LCDR3)：QQGVSSSNVDNA(SEQ ID NO：27)
抗体7F4的CDR氨基酸序列：
重链可变区CDR1(HCDR1)：GFSLSSYN(SEQ ID NO：28)
重链可变区CDR2(HCDR2)：IDAGSGNT(SEQ ID NO：29)
重链可变区CDR3(HCDR3)：ARDGPGYRTGVYFDL(SEQ ID NO：30)
轻链可变区CDR1(LCDR1)：QSIYSG(SEQ ID NO：31)
轻链可变区CDR2(LCDR2)：RAS
轻链可变区CDR3(LCDR3)：QQGYSSSNINNA(SEQ ID NO：32)
4.抗体生产与纯化
4.1捕获抗体的生产与纯化：使用细胞转瓶培养技术培养待生产的杂交瘤细胞株，收集细胞上清。使用protein G亲和纯化上清中产生的抗体，抗体最终以PBS或冻干形式保存。
4.2测定抗体的生产与纯化：分别使用4D1，2H4和7F4重组质粒瞬时转染HEK293F细胞，收集细胞上清，进行重组抗体生产。使用protein G亲和纯化上清中产生的抗体，抗体最终以PBS或冻干形式保存。
5.细胞保存
收集对数生长期的、状态良好的分泌抗体的细胞株，调整细胞浓度1.6-2×106个/ml，冻存于含有10％DMSO和90％新生牛血清的细胞冻存液中，梯度降温后保存于液氮中。
产生捕获抗体1A3和1D5的杂交瘤细胞株于2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCC No.C2022125和CCTCCNo.C2022126。产生测定抗体4D1、2H4和7F4的细胞株于2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45233、CGMCC No.45234和CGMCC No.45235。
实施例5：本发明的抗体在特异性诊断HCC患者中的用途
材料：
1.血清样本：来自就诊于中国医学科学院肿瘤医院的检验科，为肝癌患者和肺癌患者完成相关临床检验项目后的剩余样本
2.酶标板：NuncTM446469ImmunoTMBreakable Module Plate,Framed,C8LockWellTMWell Design with MaxiSorpTMSurface,Clear Polystyrene，货号为446469
3.HRP标记的山羊抗兔IgG购自金普莱，货号为P03S02S；TMB：购自thermoFisher，货号为00-4201-56
4.酶标分析仪：雷杜RT-6500
5.其它自行配制的试剂
5.1)包被缓冲液：NaCO3/NaHCO3缓冲液，pH＝9.6
5.2)封闭液：含有3％的BSA的PBS
5.3)洗涤液：含0.1％Tween-20的PBS
5.4)抗体稀释液：含0.25％BSA的洗涤液
5.5)终止液：2M H2SO4
方法：
1、将捕获抗体1D5抗体溶解到包被缓冲液，终浓度为5μg/ml，100μl/孔加入到酶标板中，4℃过夜
2、第二天洗板1次后，加入封闭液，200μl/孔，室温下(24℃)2小时
3、洗板1次后，将相关的血清加入到酶标板中，100μl/孔，24℃孵育2小时。同时设置3个阴性孔和2个空白孔，本步骤的阴性孔和空白孔均加入抗体稀释液。
4、洗板3次，将测定抗体2H4抗体加入到抗体稀释液中，浓度为0.5μg/ml，然后100μl/孔中，加入到酶标板中，室温下(24℃)1小时，本步骤的阴性孔和空白孔均加入抗体稀释液
5、洗板3次后，抗体稀释液将HRP标记的山羊抗兔IgG进行1:20000稀释，然后100μl/孔中，加入到酶标板中，包括阴性对照孔，室温下(24℃)30分钟。本步骤的空白孔只加入抗体稀释液
6、洗板4次后加入TMB显色15分钟，然后加入终止液，本步骤所有孔均加入TMB，包括阴性孔和空白孔。
7、在酶标分析仪上读取OD450的吸光值
结果
1、肝癌患者血清与正常人血清中DCP含量的比较
采用阴性对照为本底，分别计算无肿瘤的正常人血清样本(Normal)和肝癌患者(Liver Ca)的血清样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。结果见图7A。图7B显示上述方法用于检测正常人血清样本(Normal)和肝癌患者(Liver Ca)获得的ROC曲线的结果。
本结果提示1D5/2H4配对组合能有效区分肝癌患者与正常人血清中的异常凝血酶原。
2、肝癌患者血清与肺癌患者血清中DCP含量的比较
采用阴性对照为本底，分别计算肺癌患者(lung)的血清样本和肝癌患者(liver)的血清样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。部分肝癌患者为接受治疗者，采用雅培PIVKA-II进行了赋值做参照。图8A是雅培PIVKA-II测定值为80-3000mAU/ml的肝癌患者血清，图9A是雅培PIVKA-II测定值为<80mAU/ml的肝癌患者血清。图8B和图9B分别显示了ROC曲线的结果。
本结果提示1D5/2H4配对组合能有效区分肝癌患者与不表达DCP蛋白的其他肿瘤患者(如肺癌)血清中的异常凝血酶原。
3、肝癌患者血清与肝脏转移瘤患者血清中的DCP含量的比较
采用阴性对照为本底，分别计算结直肠肝脏转移的肿瘤患者(M-LCa，n＝8)和肝癌患者(PLC，n＝4)的血清样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。结果见图10A。图10B显示上述方法用于检测肝脏转移瘤患者和肝癌患者(PLC)获得的ROC曲线的结果。
本结果提示1D5/2H4配对组合能有效区分原发性肝癌患者与肝脏转移性肿瘤患者血清中的异常凝血酶原。
4、乙肝阳性的肝癌患者血清与慢性非肝癌患者血清中的DCP含量的比较
采用阴性对照为本底，分别计算乙肝病毒阳性患者中，肝癌患者(HCC，n＝15)和慢性肝炎的非肝癌患者(NonHCC，n＝55)的血清及血浆样本的OD450的数值与阴性对照OD450的数值的比值。结果见图11A。图11B显示上述方法用于检测慢性肝炎的非肝癌患者和肝癌患者(HCC)获得的ROC曲线的结果。
本结果提示1D5/2H4配对组合能有效区分肝癌患者与慢性肝炎的非肝癌患者外周血中的异常凝血酶原，与乙肝病毒感染与否无关。无论是血清，还是血浆样本中，1D5/2H4配对组合均可以有效检测DCP蛋白。
结论：
由上述结果可见，本发明提供的针对SEQ ID NO：2所示的DCP蛋白表位的单克隆抗体(例如1D5)用作捕获抗体、组合本发明提供的针对SEQ ID NO：3所示的DCP蛋白表位的单克隆抗体(例如2H4)用作检测抗体，可以高灵敏度和高特异性区分肝细胞癌患者与健康受试者、区分肝细胞癌患者与其他肿瘤患者、区分肝细胞癌患者与肝转移癌患者，以及区分肝细胞癌患者与慢性肝炎患者，可用于肝细胞癌患者的早期诊断。
尽管以上仅提供了1D5与2H4抗体组合的具体实验数据，实际上，本发明的其他抗体的组合，例如，1A3与4D1、2H4或7F4，以及1D5与4D1或7F4组合也可用于上述用途(数据未显示)。
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Claims (10)
1.特异性结合异常凝血酶原的抗体，其中所述抗体特异性结合SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示的异常凝血酶原的表位，优选地，所述异常凝血酶原存在于肝细胞癌患者中。
2.根据权利要求1所述的特异性结合异常凝血酶原的抗体，其中所述抗体包含：
a)分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
b)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c)分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d)分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
e)分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，所述抗体由2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCC No.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株产生、或由2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCC No.45233和CGMCCNo.45235的细胞株产生。
3.一种抗体组合，其包含至少一种特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体，以及至少一种特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体组合，其中：
所述特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体包含；
a)分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
b)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
并且所述特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体包含；
c)分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d)分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
e)分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，所述特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位的抗体由2022年5月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCCNo.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株产生；
所述特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位的抗体由2022年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCC No.45233或CGMCC No.45235的细胞株产生。
5.根据权利要求1或2所述的抗体，或根据权利要求3或4所述的抗体组合在制备用于检测来自受试者的样品中异常凝血酶原的试剂盒中的用途。
6.一种试剂盒，所示试剂盒包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体特异性结合SEQID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，所述检测抗体特异性结合SEQ IDNO：3所示的异常凝血酶原的表位。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中
所述捕获抗体选自：
a)包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
b)包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；
所述检测抗体选自：
c)包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；
d)包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体；或
e)包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体，
优选地，所述捕获抗体由2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCC No.C2022126和CCTCC No.C2022125的杂交瘤细胞株产生；
所述检测抗体由2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCCNo.45234、CGMCC No.45233或CGMCC No.45235的细胞株产生；
优选地，所述捕获抗体和所述检测抗体为单克隆抗体，优选为IgG抗体，优选地，所述捕获抗体和所述检测抗体为单克隆抗体源自不同的物种，优选地，所述捕获抗体为鼠源抗体，所述检测抗体为兔源抗体；
优选地，其中所述捕获抗体附接至固体支持物表面，所述检测抗体与可检测部分缀合。
8.根据权利要求1或2所述的抗体，或根据权利要求3或4所述的抗体组合、根据权利要求6或7所述的试剂盒，在制备用于诊断肝细胞癌的试剂中的用途。
9.产生根据权利要求1或2所述的抗体、或根据权利要求3或4所述的抗体组合的细胞株，其中所述细胞株选自2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号分别为CCTCC No.C2022126和CCTCCNo.C2022125的杂交瘤细胞株，或选自2022年7月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC No.45234、CGMCC No.45233或CGMCC No.45235的细胞株。
10.一种检测异常凝血酶原的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将捕获抗体包被于固体支持物，所述捕获抗体特异性结合SEQ ID NO：2所示的异常凝血酶原的表位，
ii)使待检测样品与步骤i)的捕获抗体接触；和
iii)加入检测抗体，所述检测抗体特异性结合SEQ ID NO：3所示的异常凝血酶原的表位。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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