JP6244644B2

JP6244644B2 - 膵臓癌の検出方法及び検出用キット

Info

Publication number: JP6244644B2
Application number: JP2013084915A
Authority: JP
Inventors: 大輔仲田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2013-04-15
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2017-12-13
Anticipated expiration: 2033-04-15
Also published as: JP2014206491A

Description

本発明は、膵臓癌の検出方法及び検出用キットに関する。より詳しくは、試料中の膵臓特異的リボヌクレアーゼ１（以下、リボヌクレアーゼ１を「ＲＮａｓｅ１」と称する）を免疫学的手法により測定することによる膵臓癌の検出方法及び検出用キットに関する。

膵臓癌は、早期発見の難しい癌の１つである。非特許文献１によれば、血清中のリボヌクレアーゼ酵素活性を測定すると、膵臓癌患者から得られた血清中では酵素活性が増加していることを示しており、他の臓器癌患者から得られた血清中のリボヌクレアーゼ酵素活性に比べて高い値を示すことが、報告されている。一方で、非特許文献２によれば、血清中のリボヌクレアーゼ酵素活性を測定すると、非特許文献１と同様に膵臓癌患者から得られた血清中では酵素活性が増加していることが報告されているが、他の臓器癌患者から得られた血清中の酵素活性も増加しているため、膵臓癌を明確に区別できなかったと報告されている。以上の文献は、両者とも酵素活性を測定しており、酵素活性を持つ酵素自体を明確に特定していないが、基質特異性などの特徴から血清中のリボヌクレアーゼが、膵臓由来の酵素と同一であると結論づけている。両文献の酵素活性測定の結果において、癌の組織特異性に関して異なる結果が示されたことは、リボヌクレアーゼ酵素活性測定による癌の検出は、確実性に欠く手法であることを示唆している。

特許文献１では、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識する抗体による免疫学的測定法によって、各種癌由来培養細胞の培養上清に分泌された膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の量を測定する例が示されている。膵臓癌由来細胞から膵臓特異的ＲＮａｓｅ１が検出され、胃癌および肺癌由来細胞株の培養上清中には膵臓特異的ＲＮａｓｅ１が検出されなかったという結果をもって、膵臓癌の検出が可能であるとしている。また、膵臓癌由来細胞ではないヒト臍帯血管内皮細胞株ＨＵＶＥＣからも膵臓特異的ＲＮａｓｅ１が検出されることが示されている。非特許文献１および２の結果によれば、健常者の血清中にもリボヌクレアーゼ活性が検出されることから、膵臓由来正常細胞も膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を分泌している可能性があることは推定されるにも関わらず、特許文献１には膵臓由来正常細胞の測定例は示されていない。さらには、非特許文献３によると膵臓癌由来培養細胞であっても、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を分泌しない細胞も存在していることが明らかである。よって特許文献１に提示された方法は、当時の公知事実から判断して、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を分泌する培養細胞を検出する方法を提供しているに過ぎず、体外診断薬のような医学的な見地にのっとった膵臓癌の検出方法については何ら開示・示唆はない。

特開２０１０−１８０１７４号公報

Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３，２３０８−１０（１９７６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３３，１２１２−３（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，１４８４−９４（２０００）

本発明が解決しようとする課題は、膵臓癌を検出可能なより確実性の高い方法を提供することである。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、膵臓癌患者から得られた試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を免疫学的測定法によって測定した場合に、健常人から得られた試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定した場合よりも高い値を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）・膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識する抗体（ａ）、
・抗体（ａ）とは異なる部位で膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識する抗体（ｂ）、及び
・試料、
を接触させ、抗体（ａ）及び（ｂ）と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定し、その値が健常人から得られた試料を用いて測定した場合よりも高い値を示した場合に膵臓癌とすることを特徴とする、膵臓癌の検出方法。
（２）上述の（１）の検出方法において、膵臓癌が病期ステージＩＶの膵臓癌である方法。
（３）・膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識する抗体（ａ）、及び
・抗体（ａ）とは異なる部位で膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識する抗体（ｂ）、
を有することを特徴とする、膵臓癌検出用キット。
（４）上述の（３）のキットにおいて、膵臓癌が病期ステージＩＶの膵臓癌であるキット。

以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明は、試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定することにより、膵臓癌を検出するものである。試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１は、認識部位の異なる２つの抗体（ａ）及び（ｂ）を使用した免疫学的測定方法によって測定するものであって、リボヌクレアーゼ酵素活性を測定するものではない。本発明ではこのようにして得られた測定値が、健常人から得られた試料の測定値よりも高い値を示す場合に、膵臓癌であるとする検出方法である。測定に供される認識部位の異なる２つの抗体（ａ）及び（ｂ）は、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を認識するものであればよく特に限定されないが、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の翻訳後修飾、特に糖鎖修飾に抗体の認識能が影響を受けないものが好ましい。また抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はそれらの断片であってもよい。これらの抗体はキット化し、膵臓癌の検出に用いることもできる。

一方、本発明において測定対象となる試料は、特に限定されるものではないが、人から採取された体液であることが好ましく、特に血清試料であることがもっとも好ましい。

このような試料を前述の２つの抗体（ａ）及び（ｂ）と接触させ、抗体（ａ）及び（ｂ）と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定する。これはいわゆるサンドイッチ測定法といわれるものであり、抗体（ａ）及び（ｂ）の一方は固相化し、他方は標識化することが好ましく、これにより測定を好都合に行うことができる。また試料と抗体（ａ）、（ｂ）との反応の順序には特に限定はなく、同時に反応させてもよく、また順次反応させてもよい。

このようにして抗体（ａ）及び（ｂ）と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定し、その値が健常人から得られた試料を用いて測定した場合よりも高い値を示す場合に、膵臓癌として検出するものである。

特に本発明によれば、病期ステージＩＶの膵臓癌を検出することができる。膵臓癌は、国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類によると、後述の表１に記載したようにステージＩＶは「遠隔転移がある膵臓癌」と定義されている。「遠隔転移の有無」は、膵臓癌の治療、すなわち手術による切除可能か否かを決定する重要な因子であり、ステージＩＶの膵臓癌を検出可能な本発明の方法は、膵臓癌の治療方針決定において重要な判断材料を提供する。

本発明により、膵臓癌の検出を行うことができ、特に病期ステージＩＶの膵臓癌を検出することができる。

健常人血清、膵臓癌患者血清中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１をプロットしたグラフである。膵臓癌患者血清を、国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類に従ってステージ別に膵臓特異的ＲＮａｓｅ１をプロットしたグラフである。

実施例１膵臓特異的ＲＮａｓｅ１特異的抗体の作製
［免疫原の調製］
ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１全長を含むポリペプチドを取得するために、昆虫細胞で発現可能なプラスミドベクターに成熟型ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１（配列番号１）をコードする遺伝子配列を挿入した発現プラスミドを作製した。詳しく説明すると、昆虫細胞組換えタンパク質発現用プラスミドであるｐＩＺ／Ｖ５Ｈｉｓｖｅｃｔｏｒ（ライフテクノロジー社）のマルチクローニングサイトに、５’上流側からヒトイムノグロブリンカッパー鎖をコードする遺伝子配列、Ｈｉｓタグをコードする遺伝子配列、ＦＬＡＧタグをコードする遺伝子配列、及びヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１をコードする遺伝子配列（配列番号２）からシグナルペプチドであるアミノ酸１番から２８番までに相当する８４核酸残基の遺伝子を除いた領域（配列番号１）を挿入した。

作製された発現プラスミドｐＩＺ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１は、昆虫細胞株Ｓｆ９にＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎＩＩ（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入を実施したことにより、Ｎ末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたタンパク質は、培養上清から抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を用いたアフィニティー精製により濃縮精製して免疫原とした。

［免疫動物への免疫］
上述の免疫原を用いてマウスおよびラットに免疫を実施した。詳しくは、マウスへの免疫の場合、１００μｇの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス腹腔に投与し初回免疫とした。その後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後に免疫原１００μｇをフロイント不完全アジュバンドと共に腹腔投与し、追加免疫とした。さらに、４２日後に免疫原１００μｇを生理食塩水と共に腹腔投与し、最終免疫とした。ラットへの免疫の場合は、１００μｇの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、６週齢ＷＨＹ雌ラット両後肢フットパッドへ投与し初回免疫とした。その後、２８日後に免疫原１００μｇを生理食塩水と共に後肢フットパッドへ投与し、最終免疫とした。

［抗体産生ハイブリドーマの作製］
最終免疫の３日後に、マウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。ラットからは、腸骨リンパ節と鼠蹊リンパ節を摘出し、リンパ節細胞を得た。マウス脾臓細胞およびラットリンパ節細胞は、それぞれマウスミエローマ細胞株と電気細胞融合法により融合させた後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加したＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社）で細胞培養用９６ウェルプレートに播種することにより、融合細胞を選択した。

［マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体産生融合細胞株の選定］
マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１に対する反応性を指標にしたＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体（シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むブロッキング溶液（３％ＢＳＡ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート）。

各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍｌとなるように希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で希釈した組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、５０μｌの融合細胞培養上清を加えて室温で１時間放置した。次に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、０．０１μｇのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を含む希釈液を５０μｌ加えて、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）を添加して１５分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体ＭｒｈＲＮ０６１４を得た。

［ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体産生融合細胞株の選定］
ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、ヒト膵臓癌細胞（Ｃａｐａｎ１）由来の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１に対する反応性を指標にしたＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのマウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むブロッキング溶液（３％ＢＳＡ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１抗体固相化プレート）。

各ウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で２倍に希釈したヒト膵臓癌細胞（Ｃａｐａｎ１）の培養上清を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、５０μｌの融合細胞培養上清を加えて室温で１時間放置した。次に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、０．０１μｇのＨＲＰ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）を含む希釈液を５０μｌ加えて、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１５分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を得た。

実施例２膵臓特異的ＲＮａｓｅ１特異的抗体による膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の免疫学的測定方法の構築
実施例１で得た２つの抗体を用いて免疫測定系を構築した。その測定試薬の調製法、評価方法を示す。水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）にＭｒｈＲＮ０６１４を９０ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させ、吸着後ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。この水不溶性担体は、１個当たり約１００ｎｇの蛋白質を物理的に吸着可能である。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を含む緩衝液（１％ＢＳＡ、２．５％デキストラン、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を加え、凍結乾燥した。

この試薬を市販の全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて全自動での測定を行った。その測定原理は以下の通りである。即ち、測定サンプルを１５０μＬ加え、水不溶性担体を３７℃で１０分間磁石を用いて運動させ、混合液を攪拌した状態で免疫反応させた。反応後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸を加え、該基質添加後２０秒から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。この測定試薬を使用して、精製したヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定すると、精製したヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の濃度に依存して測定値が増加していることがわかった。このデータは、以後の試料中膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の測定において、検量線を描くデータとして使用した。

実施例３膵臓特異的ＲＮａｓｅ１特異的抗体による膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の免疫学的測定方法による癌患者検体の検出
実施例２で作製した免疫学的測定試薬を使用して、健常人から得られた血清１０検体と、膵臓癌患者から得られた血清２６検体の、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定した。なお膵臓癌患者から得られた血清は、医学的診断の結果病期が決定されているものであり、その内訳を表１に示した。この病期は、国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類によるものである。

結果を図１，２に示す。図１は、健常人血清、膵臓癌患者血清の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１をプロットしたグラフである。ここで測定検体を健常人と膵臓癌に分けた場合に、最も検出精度が良くなるようにカットオフ値を設定したところ、７７６ｎｇ／ｍｌとなった。またその時の感度及び特異度を統計的に算出したところ、感度８４．６％、特異度１００％となり、検出性能に優れていることがわかり、膵臓癌患者と健常人を有意に区別可能であることが明らかとなった。

図２は、健常人血清と、膵臓癌患者血清を国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類に従ってステージ別に膵臓特異的ＲＮａｓｅ１をプロットしたグラフである。図２から明らかなように、病期がステージＩＶの試料では、他の病期ステージに比べて、試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１が著しく増加していることがわかる。ここで測定検体をステージＩＩＩ以下とステージＩＶに分けた場合に、最も検出精度が良くなるようにカットオフ値を設定したところ、１１７０ｎｇ／ｍｌとなった。またその時の感度及び特異度を統計的に算出したところ、感度６２．５％、特異度９６．４％となった。このように試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定したときに高い値を示す場合には、ステージＩＶの膵臓癌である可能性が高いことを示している。

以上の結果から、試料中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ１を測定することにより膵臓癌を検出することが可能であり、特に高い値を示す場合は、病期ステージＩＶである可能性が強く示された。

Claims

・膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体（ａ）、
・抗体（ａ）とは異なる部位で膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体（ｂ）、及び
・試料、
を接触させ、ここで試料は血清であり、抗体（ａ）及び（ｂ）と複合体を形成した膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を測定し、その値が、予め病期が決定されている膵臓癌患者血清を用いて測定しその病期ステージＩＩＩ以下と病期ステージＩＶとに分けた場合に最も検出精度が良くなるよう設定したカットオフ値よりも高い値を示した場合に病期ステージＩＶの膵臓癌とすることを特徴とする、病期ステージＩＶの膵臓癌の検出方法。
・膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体（ａ）、及び
・抗体（ａ）とは異なる部位で膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体（ｂ）、
を有することを特徴とする、病期ステージＩＶの膵臓癌検出用キット。