CN115975025B - C反应蛋白（crp）检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及C反应蛋白(CRP)检测试剂盒。针对CRP特异性的筛选和制备了CRP单克隆抗体，通过筛选获得较好配对的酶标抗体以及包被抗体，二者组合使用制备得到了ELISA双抗体夹心检测试剂盒，所述试剂盒能够用于CRP的检测，具有较好的特异性以及检测效果。

Description

C反应蛋白(CRP)检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及C反应蛋白(CRP)检测试剂盒。

背景技术

C反应蛋白又称CRP，是一种急性时相反应蛋白，可由肝细胞合成。当病原体轻度刺激或组织损伤时，肝细胞合成迅速启动，6h内C反应蛋白浓度达到病理水平(＞8mg/L),48～72h内达到峰值，直接反映早期组织炎性坏死。CRP作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，具有多种生物活性，它的浓度和分泌水平不因进食和抗炎药物等改变。因此C反应蛋白高低变化与疾病的炎性反应及严重程度具有重要的相关性，C反应蛋白是最有效和最通用的炎性反应标记物。在细菌与病毒感染、组织创伤、脑梗死、心肌梗塞、心血管疾病等多种疾病中，C反应蛋白的检测具有一定的意义。

CRP在某些疾病上的具体应用包括如下几种疾病。下呼吸道感染：细菌性感染时CRP明显高于病毒感染。细菌性肺炎时CRP大幅度增高，平均值可达200mg/L。CRP值取决于感染的持续时间。病毒性肺炎并发细菌感染，如果CRP值偏低，那么在给予抗生素治疗前还需要观察和检测，如果值很高应立即给予抗生素治疗。连续监测CRP水平下降，这是治疗效果满意的指标。CRP水平在3-4天内下降，2-4周内恢复到正常附近水平，表示很好的治疗效果。细菌和病毒引起的呼吸道感染临床症状有时很难区分，CRP可以帮助作判断，决定是否抗生素早期治疗。如果发病<12小时，即使有细菌感染的明显表现，CRP值可以是正常的。但是12小时后CRP值异常的话可以证实为细菌感染。泌尿系统感染：膀胱炎病人CRP水平<30-50mg/L，肾盂肾炎>10-20mg/L，中值75mg/L,最高230mg/L，CRP检测特别对不能表达症状的病人(婴儿、昏迷、痴呆病人等)，有良好的提示作用。此外对评价泌尿系统感染的严重程度有重要作用。妇科及孕妇的感染：孕妇CRP从怀孕时的6mg/L，分娩时上升到20mg/L，顺产24小时后升到60mg/L，24小时减到25mg/L，剖腹产48小时后平均升到150mg/L。更高水平的CRP表示感染。妇科炎症性疾病如子宫附件炎，急性与慢性盆腔炎CRP值显著高于非炎性疾病。急性与慢性炎症CRP值有显著差异，与WBC部分相关。在盆腔炎治疗后CRP在抗生素治疗前后变化幅度值明显大于WBC值，说明CRP敏感性较高。CRP动态观察可以较好的指导临床用药。单一观察WBC值可能会掩盖对疾病发生发展及治疗效果观察。婴儿和儿童感染：婴儿时期严重感染的临床特征往往模糊不清。CRP增高对婴儿感染有更高的的特异性和敏感性。连续的CRP测定对诊断更有价值。发热患儿如果症状持续>12小时之间在测CRP水平<20mg/L，临床上不能确诊细菌感染，可以怀疑为病毒感染，或在8--12小时之间在测CRP的值可排除或证实细菌感染的可能。败血症、心内膜炎、脑膜炎和骨髓炎：CRP的值水平较高，均值为150-200mg/L。CRP迅速下降至正常是疾病好转和抗生素治疗有效的标志。大龄儿，成人患细菌性脑膜炎时，症状超过12小时，CPR极少低于50mg/L，而症状小于12小时，CRP可能会正常。几小时在测会出现高浓度的CRP值。急性阑尾炎：发病时间少于12小时，CRP可能正常，几小时后进行第二次检测可得到有诊断价值的结果。和WBC计数综合分析是诊断的最佳指标。郑建方报道了400列CRP与WBC对急性阑尾炎诊断价值的研究提示：CRP与WBC均正常者可以排除急性阑尾炎，其预测效率为100％。这种病例根据临床症状尽量采取保守治疗，并多次测CRP、WBC，当某一指标升高，在全面考虑是否手术。组织损伤：术后6-8小时CRP开始增加，2-4天达到最高水平。胆腹镜，开放式胆囊切除，前者CRP的均值为20mg/L,后者均值100mg/L。急性肝移植排斥反应不会引起CRP升高，术后细菌感染CRP可大幅度升高。肝功减退的病人，蛋白合成障碍术后CRP会低于正常人。评估CRP时应考虑肝功影响。手术后感染：术后6天或6天后CRP>75mg/L明显提示有并发症可能。疑似急性肠梗阻，CRP持续高或不断上升趋势，提示并发症可能。每天CRP测定的动态观察，对发现感染很有价值。心血管疾病：对健康人群首发心血管事件的预测，把hs-CRP纳入常规的胆固醇筛查:(1)、提高对心血管风险预测的水平，而不再单独依赖于LDL-C的预测(2)、hs-CRP浓度的升高可以筛选出胆固醇水平正常，但未来心血管病事件的高风险无症状者冠心病患者再发心血管事件的预测：当冠心病患者血清中hs-CRP浓度每增加一个标准差时，发生非致命性心肌梗死的相对危险增加45％hs-CRP可作为冠心病患者病情恶化及发生心梗危险的独立预报因子，提示可利用hs-CRP来区分高危险和低危险患者。在AMI和UAP血液中hs-CRP的含量：UAP(7.28+/-2.03)mg/lAMI(22.19+/-7.64)mg/l正常组(2.35+/-0.58)mg/l炎症反应在ACS的形成中所起的决定性作用已得到公认，hs-CRP是急性冠脉事件发生的强有力的，独立的预测指标hs-CRP的升高与炎症的活动相关，并与动脉硬化斑块的稳定状态相关，是高度敏感炎症指标。hs-CRP对心血管炎症的评价：对不稳定性心绞痛，非Q波型的心肌梗死患者，即使cTnI未升高，但出现hs-CRP的升高，相应的14天内病死率也会增加。对糖尿病患者在治疗过程中检测hs-CRP，可以很好的预防急性心肌梗死的发生。当病情好转或治愈时，检测hs-CRP的含量低时，则意味着预后较好。预测所有因素的死亡率：研究报道患者在入院时hs-CRP浓度>5mg/L，则任何原因导致的死亡率均升高50％至330％不等，如入院时患者hs-CRP浓度>8mg/L，死亡危险性成倍增加。作为一项独一无二的死亡危险性分选标志物，hs-CRP应在患者入院时进行常规检测，并根据检测结果来分选出需要特别监护的高危患者。

正是基于CRP的重要性，检测该指标变得尤为重要。目前市面上主要运用的方法分为三大类：1.免疫比浊测定法(散射，透射)此方法是运用抗原和抗体在反应液中反应后通过一束光照射到反应液中使之发生散射或是透射来测定蛋白浓度的一个过程。这种方法在于抗原和抗体是否充分反应，另外每个厂家的仪器的光源也有所不同所受因素比较大，免疫透射比浊法与免疫散射比浊法比较，免疫投射比浊法具有优良的精密度，相似的分析灵敏度和检测范围，良好的相关性，系统误差小，且更加实用和便利。2.标记免疫测定法(RIA放射免疫检测法、酶标记免疫附测定法ELISA)将抗原或抗体与酶结合作为探针，利用酶的活性来检查有无抗体或抗原而将放射免疫测定(RIA)中的放射性标记用酶来代替的方法。因为不使用放射性物质，所以较为安全，只是灵敏度稍差，但由于在使用的酶的种类及结合方法等方面的改进，巳逐渐达到与RIA大致相等的灵敏度。3.POCT(免疫渗滤和免疫层析、酶标记、生物传感器、生物芯片)此种方法是最近今年发展较为迅速的一种快速检测方法。POCT检测方法检测速度快只要几分钟就可以出具结果，操作简单，可用于床旁检测。但是目前针对CRP可选择的单克隆抗体种类还不够丰富。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供一种改进的CRP单克隆抗体。

所述抗体为配对抗体，分别是6D2和7B12。

进一步的，6D2抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQID NO:2所示；7B12抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ IDNO:2所示。

进一步的，在一些具体的实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区为具有至少80％同一性或至多15个氨基酸差异的序列。

在一些具体的实施方式中，所述至少80％同一性优选为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；所述至多3个突变优选为至多3、2、1或0个突变；所述至多15个突变优选为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个突变；优选地，所述突变为插入、缺失或替换，所述替换优选为保守氨基酸替换，所述突变优选为回复突变或热点突变。

本文术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异体(例如含有天然存在的突变或在制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体或抗原结合分子。举例来说，单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤技术、重组DNA方法、噬菌体库展示技术和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法和其它本领域已知的方法。

进一步的，本发明的单克隆抗体还可以被可识别的标记进行标记。

进一步的，本发明还提供一种用于CRP检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有特异性针对CRP的单克隆抗体。

进一步的，本发明还提供了特异性针对CRP的单克隆抗体在制备用于CRP检测的试剂盒中的用途。

进一步的，本发明的试剂盒是ELISA检测试剂盒。

所述ELISA检测试剂盒还包含：包被抗体、酶标抗体、样品稀释液、10倍洗涤液、阴性对照、阳性对照、TMB底物溶液和终止液。

有益效果

本发明针对CRP特异性的筛选和制备了CRP单克隆抗体，通过筛选获得较好配对的酶标抗体以及包被抗体，二者组合使用制备得到了ELISA双抗体夹心检测试剂盒，所述试剂盒能够用于CRP的检测，所述试剂盒具有较好的特异性以及检测效果。

附图说明

图1抗体特异性鉴定结果图

图2试剂盒针对样品检测结果

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本公开，本公开的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本公开实施例仅是范例性的，并不对本公开的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本公开的精神和范围下可以对本公开技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本公开的保护范围内。

实施例1 CRP单克隆抗体的制备

动物免疫及杂交瘤细胞株筛选：将购买的CRP蛋白(启泰生物，货号A006)与50％弗氏完全佐剂充分乳化，免疫4只雌性BALB/c鼠，腹腔注射，首次剂量100μg/只，间隔10d再次免疫，100μg/只，共免疫3针，融合前4d加强注射1针150μg/只。免疫3针后鼠尾采血间接ELISA检测抗体滴度。其中2号小鼠血的抗体滴度达1∶12800以上，选用该雌性小鼠，并无菌取脾，按常规杂交瘤融合技术进行细胞融合，HAT选择培养基筛选，用间接ELISA法检测细胞上清，选取强阳性孔细胞克隆化。共融合9块96孔板板，融合率达到100％，提阿欧安阳性孔进行克隆化，用有限稀释法，经过3～4次克隆化，得到强阳性的稳定分泌特异性mAb的细胞株1B6、2C7、6D2、7B12和4C5。

扩大培养前述5株细胞并收集细胞沉淀，分别腹腔注射液体石腊致敏的雌性小鼠，14d后收集腹水，将腹水进行ELISA滴度检测，结果如表1所示。取各mAb腹水各4mL，50％饱和硫酸铵沉淀法初步盐析粗提。溶解第2次盐析后的硫酸铵沉淀，经S-200层析拄纯化，0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl洗脱，分段收集洗脱峰，进行还原SDS-PAGE电泳检测发现只有2条轻重链的蛋白带，说明纯度较好均到了95％以上。用Lowry法检测蛋白浓度如表1所示。

表1腹水滴度以及抗体蛋白浓度

抗体名称	腹水滴度	抗体蛋白浓度(g/L)
			1B6	256000	5.14
2C7	512000	3.97
			6D2	256000	4.86
7B12	256000	5.62
			4C5	128000	6.34

实施例2配对抗体的选择

按简易过碘酸钠法标记HRP。按ELISA双抗体夹心法测CRP抗原的基本试验程序，采用棋盘滴定试验。取纯化后的5种抗体分别稀释至10、5、2.5、1.25mg/L，每种抗体每一稀释度分别包被酶标板条，4℃过夜，洗板后与50mg/L和10mg/L浓度的Pfs25纯化抗原反应，同时用CRP标准抗原作阳性对照，并设盐水阴性对照。分别加入与包被抗体不同的另外4种酶标抗体，稀释度1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000，四甲基联苯胺TMB显色测A450值，根据最大A值对应的包被抗体和酶标抗体饱和浓度，确定包被抗体和酶标抗体的最佳搭配为包被抗体为6D2，酶标抗体为7B12，包被抗体的浓度为2mg/L，酶标抗体的浓度为1.5mg/L。

实施例3 6D2和7B12抗体的亚类及特异性鉴定

二个抗体的亚类和特异性测定用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒，HRP标记的兔抗鼠IgA、IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、λ和κ，亚类鉴定的具体操作步骤按试剂盒说明书进行。结果显示，6D2抗体为IgG1类，轻链类型为κ，7B12抗体为IgG1类，轻链类型为κ。

将以上2个单抗分别与CRP、BSA、HBsAg、PD-1、小鼠血清等抗原包被板条反应，间接ELISA测定mAb与各抗原反应的A450值。设生理盐水(NS)阴性对照。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，2株mAb 6D2和7B12抗体均与CRP抗原有很强的反应，有较高的A450值，而与BSA、HBsAg、PD-1、小鼠血清等抗原包被抗原不反应，呈现与阴性对照生理盐水(NS)相同的A450值，说明本发明的二个抗体具有较好的特异性。

实施例4 6D2和7B12抗体的亲和力鉴定及序列鉴定

使用ProteinA芯片(GEHelthcare；29-127-558)捕获抗人CRP抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactantP20)(GEHealthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用ProteinA芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的CRP抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用GlycinepH1.5(GEHelthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的人CRP持续250秒来测量结合，其中流速为30μl/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH1.5)以30μl/分钟的流速洗涤40秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulkrefractiveindex)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD，使用Langmuir1：1模型。抗体与人CRP蛋白的解离常数如表2所示。

表2单抗解离常数

抗体名称	解离常数(nM)
		6D2抗体	7.88±0.10
7B12抗体	14.25±0.14

从表2的结果可以看出，本发明制备的2个单抗6D2和7B12均具有较好的结合能力。

利用抗体轻重链鉴定试剂盒进行轻重链可变区序列的扩增及测序鉴定，得到6D2抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；7B12抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例5 6D2和7B12双抗体夹心检测

包被抗体为6D2，酶标抗体为7B12，建立针对CRP的双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒。同时绘制标准曲线，并根据标准曲线计算标本中CRP的含量。结果显示，该试剂盒敏感度可以达到2ng/mL，线性范围是0-50ng/mL。

用已建立的CRP ELISA检测试剂盒检测40例细菌性呼吸道感染患者和20例正常人血浆中CRP的水平。6D2作为包被抗体，以1.5mg/L在酶标板每孔中加入100μL，4℃过夜。磷酸盐缓冲液(PBST，含2mL/L Tween 20)洗涤3次，分别加入100μL标准品或1:500稀释后的待测血浆样品，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的7B12抗体，37℃孵育1h。PBST洗涤3次后，每孔加100μL ABTS显色液，室温孵育15min显色。以空白对照调零，用405nm滤光片在酶标仪上测定吸光度(A)值。用标准曲线计算出待检血浆中CRP的浓度。统计学分析用Graphpad prism5软件对数据进行作图分析，利用SPSS17.0统计分析软件对数据进行处理，采用

表示计量资料，采用t检验进行2组间比较分析，P＜0.05为差异有统计学意义。结果如图2所示。

应用建立的CRP夹心ELISA，对40例细菌性呼吸道感染患者血浆及20例正常人血浆中CRP含量进行检测。结果显示细菌性呼吸道感染患者血浆中CRP水平为(57.38±5.89)mg/L，正常人为(1.39±0.18)mg/L，细菌性呼吸道感染患者血浆CRP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01，图2)。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一组结合CRP的用于双抗体夹心检测的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是由6D2和7B12组成，其中包被抗体为6D2，酶标抗体为7B12；6D2抗体的轻链可变区序列如SEQID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；7B12抗体的轻链可变区序列如SEQ IDNO：3所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：4所示。

2.如权利要求1所述的一组结合CRP的用于双抗体夹心检测的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体中的酶标抗体被显色酶标记。

3.一种用于CRP检测的试剂盒，其特征在于含有如权利要求1所述的一组结合CRP的用于双抗体夹心检测的单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有样品稀释液、洗涤液、阴性对照、阳性对照、TMB底物溶液和终止液。

5.如权利要求1所述的一组结合CRP的用于双抗体夹心检测的单克隆抗体在制备用于检测CRP的试剂盒中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述试剂盒中还含有样品稀释液、洗涤液、阴性对照、阳性对照、TMB底物溶液和终止液。

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