WO2017187656A1 - 抗医薬品抗体の測定方法 - Google Patents

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WO2017187656A1
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adas
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drug
labeled
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伸仁 柏木
史郎 齋藤
金田　健太
豪孝 前川
裕子 八木橋
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株式会社Jimro
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the presence or level of anti-drug antibodies (ADAs) in a sample.
  • ADAs anti-drug antibodies
  • Biopharmaceuticals such as protein preparations using genetically modified antibodies including antibody drugs, are produced by artificially producing antibodies and substances that react specifically with disease-related molecules and receptors. .
  • pharmaceuticals such as protein preparations using genetically modified antibodies including antibody drugs
  • molecular targeted therapy using pharmaceuticals that control target molecules involved in pathogenesis in a pinpoint manner has become widespread, and currently 47 antibody drugs are approved in Japan, the US and Europe. Many of them are targeted at cancer and autoimmune diseases, and there are many products that are indispensable for treatment.
  • IFX infliximab
  • ATI antibodies to IFX
  • an ELISA method has been conventionally used.
  • ATI measurement method double antigen assay ATI measurement method (Non-patent Document 3), or sample-pretreated sample, labeled IFX added, and mobility shift method using HPLC (non-patent document) Document 4
  • HPLC non-patent document
  • ATI is captured on a solid-phased IFX, and this is detected and measured by a labeled IFX, and accurate measurement may be difficult due to the influence of IFX present in the sample. is there.
  • the mobility shift method requires the introduction of HPLC, which is an expensive instrument, and is not versatile.
  • the present invention relates to providing a method for more easily and accurately measuring ADAs appearing in patients receiving molecular targeted therapy with pharmaceuticals and maintenance administration of recombinant cytokines and hormones.
  • a method for measuring ADAs in a sample to be measured comprising the following steps (1) to (4).
  • a step of preparing a sample containing a sample to be measured for ADAs (2)
  • Step (1) includes the step of adding the drug to a sample to be measured for ADAs and preparing a sample in which a drug-ADAs immune complex is formed [1] The method described in 1. [3] The method according to [2], wherein the amount of the pharmaceutical agent added in the step (1) is larger than the ADAs in the sample to be measured. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the drug is an anti-TNF ⁇ drug.
  • the antibody to the pharmaceutical used in step (3) is a labeled antibody.
  • the labeled antibody is an enzyme-labeled antibody.
  • the sample to be measured is a sample collected from a patient who has been administered a pharmaceutical product.
  • a measurement kit for ADAs A measurement kit comprising a complement C1q, a solid phase carrier on which an anti-C3d antibody or an anti-C1q antibody is immobilized, and a labeled or unlabeled antibody against a drug corresponding to the ADAs.
  • the measurement kit according to [10] wherein the antibody against the pharmaceutical product is a labeled antibody.
  • a method for measuring ADAs in a sample Contacting the sample with complement C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody; Quantifying the pharmaceutical-ADAs immune complex bound to the complement C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody; Including methods.
  • the quantification step is a method using a labeled antibody against the drug.
  • ADAs can be accurately and easily measured without being affected by a drug present in a sample.
  • monitoring the ADAs using the method of the present invention it is possible to confirm the presence or absence of the expression of attenuated effects in molecular target therapy using pharmaceuticals, and more appropriate treatment is possible.
  • the “antibody drug” means a drug including an artificially produced antibody that specifically binds to a disease-related molecule.
  • target molecules such as cell surface molecules such as TNF- ⁇ , VEGF, and CD20, and there are no particular limitations, but those targeting TNF- ⁇ are suitable.
  • Infliximab, adalimumab, golimumab, and certolizumab pegol are known as antibody drugs targeting TNF- ⁇ . Of these, infliximab is preferred.
  • the type of antibody may be any of a mouse antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody, but a humanized antibody or a human antibody is preferable.
  • FIG. 1-A Biopharmaceuticals other than antibody drugs approved by the FDA are shown in FIG. 1-B.
  • FIG. 1-B Biopharmaceuticals other than antibody drugs approved by the FDA are shown in FIG. 1-B.
  • ADAs means an antibody that recognizes a pharmaceutical product produced when any one of the above-mentioned antibody pharmaceuticals or a biopharmaceutical other than the antibody pharmaceutical listed in FIG. 1-B is administered to a human.
  • antibody drug means one identified antibody drug, and ADAs in this case means an antibody against the antibody drug thus identified. Examples include “infliximab (IFX)” and an antibody against infliximab as ADAs (anti-infliximab antibody (ATI)).
  • This step is a step of preparing a sample including a specimen to be measured for ADAs.
  • the sample to be measured is a sample that may contain ADAs, for example, a sample collected from a patient who has been administered a pharmaceutical product.
  • the sample to be measured preferably includes serum or plasma.
  • the sample may be appropriately diluted, solubilized, concentrated, etc. within a range that does not affect the measurement of the present invention after being collected from the patient.
  • ADAs may exist in the patient's body as a drug-ADAs immune complex in which the drug and ADAs are combined, or as free ADAs.
  • a sample in which a pharmaceutical-ADAs immune complex is formed is prepared by adding the pharmaceutical in excess to a sample to be measured for ADAs.
  • the sample is prepared by acid buffer (citric acid buffer, phosphate buffer, Tris salt buffer, acetic acid buffer to which protein such as bovine serum albumin (BSA) and casein is appropriately added. It can be carried out by mixing and stirring the drug and the specimen in a buffer solution or the like (pH of about 5-9).
  • the amount of the drug used may be sufficient to recover ADAs for the drug present in the sample as an immune complex, for example, 2 to 10 ⁇ g per 100 ⁇ L of sample (serum or plasma). Preferably, 3 to 5 ⁇ g is used.
  • the reaction time is usually 16 to 24 hours, preferably 18 to 20 hours.
  • the temperature during the reaction is preferably 4 to 10 ° C.
  • This step is a step of capturing the drug-ADAs immune complex in the sample on a solid phase carrier on which complement C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody is immobilized.
  • Complement C1q, anti-C3d antibody and anti-C1q antibody are all molecules known to bind to immune complexes in human blood.
  • Complement C1q is a protein of about 462 kDa composed of 18 subunits (6 molecules each of A chain, B chain, and C chain), and is a major component of the first factor C1 of the complement activation pathway, Recognizes antigen-antibody complexes (Sunyer, JO and Lambris, JD (1999). Complement. Encyclopedia of Life Sciences).
  • C1q is, for example, a method in which a C1q crude product solution obtained by dialysis of serum or plasma is brought into contact with an IgG-immobilized insoluble carrier, and then C1q adsorbed on the insoluble carrier is separated and recovered (JP-A-9-178745). Etc., and can be prepared by known methods. It is also possible to use a commercially available C1q (for example, Cat. No. C1740 manufactured by Sigma).
  • the anti-C1q antibody is an antibody that recognizes the C1q, and is preferably a monoclonal antibody in the present invention.
  • the anti-C1q monoclonal antibody is sold as, for example, MCA2603 from AbD Serotec.
  • the anti-C3d antibody is an antibody that recognizes complement C3d, and is preferably a monoclonal antibody in the present invention.
  • Anti-C3d monoclonal antibodies are available from, for example, AbD Serotec Cat. No. It is sold as MCA2648.
  • C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody is immobilized on a carrier by immobilizing C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody on a commonly used insoluble and inert carrier.
  • Such carriers include beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials. And insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces.
  • the solid phase can be achieved by binding a C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody to a carrier using a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method or a combination thereof.
  • a C1q solution, an anti-C3d antibody solution or an anti-C1q antibody solution prepared in a buffer solution such as PBS (phosphate buffer) to a concentration of 5 to 20 ⁇ g / mL is contacted with a carrier at 16 ° C. at 16 ° C.
  • a carrier By reacting for ⁇ 24 hours, C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody can be immobilized on a carrier.
  • a blocking treatment is usually performed with a blocking solution containing a protein such as bovine serum albumin (BSA) or casein or a surfactant such as Tween 20 in order to suppress nonspecific binding on the carrier.
  • a protein such as bovine serum albumin (BSA) or casein or a surfactant such as Tween 20
  • BSA bovine serum albumin
  • Tween 20 a surfactant
  • the contact of the sample with the solid phase carrier can be performed, for example, by reacting at 4 to 10 ° C. for 16 to 24 hours. After completion of the reaction, washing is performed using a buffer solution containing a surfactant such as Tween 20, and unreacted substances are removed.
  • a surfactant such as Tween 20
  • the solid phase carrier prepared in the previous step is contacted with a labeled or unlabeled antibody (ADAs for detection) against a drug corresponding to the ADAs, and the drug bound to C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody- It is a step of reacting with an ADAs immune complex.
  • a labeled or unlabeled antibody for a drug corresponding to ADAs a monoclonal antibody or a polyclonal antibody may be used as long as it is an antibody that recognizes a drug (medicine corresponding to ADAs to be measured). It can be obtained by an ordinary antibody production method.
  • an antibody not only IgG but also an antibody fragment (for example, F (ab ′) 2 fragment, Fab ′ fragment, etc.) may be used.
  • a polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with a pharmaceutical as an antigen, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • mammals such as mice, hamsters, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, dogs, goats, sheep and cows can be immunized.
  • Antigen administration methods are known to those skilled in the art, and the administration route is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be appropriately selected.
  • an adjuvant can also be used as needed.
  • a small amount of the mammal's serum is sampled from the ear vein and the antibody titer is measured. If the antibody titer rises, booster immunization may be performed by administering an antigen depending on the situation.
  • blood is collected from the immunized animal by a conventional method, and the blood is collected, for example, by centrifugation, precipitation with ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity.
  • Polyclonal ADAs can be obtained as a polyclonal antiserum by separation and purification by a usual method such as chromatography such as chromatography.
  • a monoclonal antibody can be obtained, for example, by preparing a hybridoma by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
  • antibody-producing cells spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals can be used.
  • a spleen cell is obtained as an antibody-producing cell from an immunized animal, and this and myeloma cell are fused by a known method (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) to produce a hybridoma. be able to.
  • myeloma cell strains used for cell fusion include P3X63Ag8, P3U1 strain, Sp2 / 0 strain and the like in mice.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus is used, and hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium can be used in accordance with a conventional method for selection of hybridomas after cell fusion.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is cloned by limiting dilution or the like.
  • a cell line producing a monoclonal antibody that specifically recognizes a desired drug can be obtained by screening by an enzyme immunoassay using the drug.
  • the hybridoma is cultured by a normal cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is purified from the culture supernatant or ascites.
  • Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used in appropriate combination.
  • monoclonal antibodies against the antibody drugs are commercially available from AbD Serotec (Oxford, UK). In the present invention, these commercially available products can also be used.
  • the labeling agent labeling agent
  • various enzymes, radioisotopes, fluorescent substances, etc. that are commonly used in immunoassay can be used. Is preferably used.
  • the enzymes include alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (HRP), ⁇ -galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, microperoxidase, chymotrypsinogen, procarboxypeptidase, glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase, amylase, phosphorylase, D-nase, P-nase and the like.
  • ALP alkaline phosphatase
  • HRP peroxidase
  • ⁇ -galactosidase urease
  • catalase glucose oxidase
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase
  • microperoxidase
  • radioactive isotopes examples include tritium, iodine 125, or iodine 131.
  • fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • RITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • substituted rhodamine isothiocyanate dichlorotriazine.
  • isothiocyanate, Alexa or AlexaFluoro Labeling with these labeling substances can be performed according to a known method.
  • a solid phase carrier Addition of labeled ADAs to a solid phase carrier is carried out by adding labeled ADAs to a buffer containing a protein such as bovine serum albumin (BSA) or casein, and a surfactant such as Tween 20 (for example, Can Get Signal Solution 2 (Cat. No. NKB-301, Toyobo) is preferably added after dilution.
  • BSA bovine serum albumin
  • Tween 20 for example, Can Get Signal Solution 2 (Cat. No. NKB-301, Toyobo) is preferably added after dilution.
  • Reaction (binding) conditions are not particularly limited, and usual conditions generally used in this type of measurement method are employed. Generally, it may be carried out at 45 ° C. or less, preferably at room temperature for about 1-5 hours. After completion of the reaction, washing is performed using a buffer solution containing a surfactant such as Tween 20 to remove unreacted labeled ADAs.
  • a surfactant such as Tween 20
  • This step is a step of quantifying the drug-ADAs immune complex bound to the C1q, anti-C3d antibody or anti-C1q antibody by measuring the amount of antibody against the drug bound to the drug-ADAs immune complex. Measurement of the amount of antibody against the drug, that is, ADAs, can be performed using a known immunoassay.
  • an immunological measurement method an enzyme immunoassay method (ELISA method) is typically mentioned, but the following measurement methods can be exemplified. 1.
  • Chemiluminescence method MSD: Electrochemiluminescence was measured on the Sector Imager 6000 instrument (Meso Scale Discovery, Rockville, MD, United States). 2.
  • HMSA homogeneous mobility shift assay
  • Agilent Technologies 1200 series HPLC system Santa Clara, CA.
  • BioSep SEC-3000 column Phenomenex, Torrance, CA.
  • BIAcore Primary Resonance
  • Biacore T100 Immunogenicity Package GE Healthcare Bio-Sciences GyrosAB, Uppsala Sweden.
  • Fluorescence method 4-1 Gyrolab.Fluorescence was measured on the Gyrolab Workstation with the Gyrolab Control software (v5.4.0) (GyrosAB, Uppsala, Sweden).
  • 4-2 AlphaLISA.Fluorescence was measured on the Synergy NEO instrument (Biotek, Luzern, Switzerland). 5).
  • Radioimmunoassay 6
  • Immunoradiometric assay IRMA
  • Fluorescence polarization immunoassay FPIA
  • Immunoturbidimetry immunonepherometry
  • Latex aggregation turbidimetry 10. Latex aggregation inhibition immunoassay Time-resolved fluorescence immunoassay (TR-FIA)
  • a labeled antibody when used as an antibody against a pharmaceutical product, the amount of the labeled body is measured, and the measurement of the labeled body is performed by a method according to the label, that is, enzyme activity for enzyme labeling and radioactivity for radioactive labeling. If it is a fluorescent label, it is carried out by measuring the fluorescence intensity.
  • a labeling enzyme peroxidase is used as a labeling enzyme
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • alkaline phosphatase When alkaline phosphatase is used, p-nitrophenyl phosphate is used as a substrate. The degradation of each substrate can be measured using a spectrophotometer or the like.
  • the amount of ADAs in the sample is calculated from the quantitative value of the drug-ADAs immune complex contained in the sample based on the calibration curve created based on the measurement value of the drug-ADAs immune complex formed in the standard sample. Is done. According to the method of the present invention, it is possible to measure both ADAs in a state of being bound to a drug and / or free ADAs not bound to a drug, which are present in a specimen.
  • the kit of the present invention is a measurement kit for ADAs comprising at least a C1q, a solid phase carrier on which an anti-C3d antibody or an anti-C1q antibody is immobilized, and a labeled antibody against the drug.
  • the kit may suitably be a kit for performing the above-described method for measuring ADAs.
  • the kit of the present invention can further contain the pharmaceutical agent of the present invention, and if necessary, a substrate for detecting a labeling substance, reagents necessary for carrying out the measurement, a diluent, a buffer solution, and a washing solution. Etc. may be included.
  • the measurement principle of the present invention is to supplement ADAs in a sample as a pharmaceutical-ADAs immune complex and quantify ADAs derived from a target patient using ADAs for detection.
  • the following examples show that complement C1q or anti-C3d antibody is immobilized and supplemented with pharmaceutical-ADAs immune complexes and ADAs are quantified by ELISA, but supplemented with C1q or equivalent immune complexes It is also possible to use a gene recombinant, a complement receptor, a monoclonal antibody, etc. having the ability.
  • the above-described various immunoassay methods, automatic analyzers and the like can be used as the immunological measurement method, and the present invention is not limited to the examples.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • C1q (Cat. No. C1740, Sigma) prepared at a concentration of 10 ⁇ g / mL with PBS (-) on a 96-well ELISA plate (MaxisorpF8 x12, Cat. No. 468667, Nunc) ) was dispensed into each well at 100 ⁇ L and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • PBS PBS
  • the C1q solution on the plate was discarded, and each well was washed once with PBS ( ⁇ ) containing 300 ⁇ L of 0.5% Tween20.
  • Sample Preparation 1 Standard Sample Preparation 1) Anti-human IgG antibody was substituted as an anti-IFX antibody (ATI) standard sample. Rabbit anti-human IgG (H + L) antibody (Cat.No.ab7155, abcam) was prepared to a concentration of 5 ⁇ g / mL with PBS (+) containing 0.1% BSA (Cat.No.A-3803, Sigma). Further, serial dilutions with 0.1% BSA-containing PBS (+) were made to prepare standard substances at concentrations of 0.078, 0.156, 0.312, 0.625, 1.25, and 2.5 ⁇ g / mL.
  • IFX solution Dissolve IFX cryopreserved at 1 mg / mL and serially dilute with PBS (+) containing 0.1% BSA to prepare IFX solutions with concentrations of 12.5, 25, 50, and 100 ⁇ g / mL. did.
  • HAG-IgG Human IgG 5 mg / mL (I4506, Sigma) was heated at 63 ° C for 20 minutes and centrifuged at 10,000xg for 5 minutes to produce agglutinated human IgG. did.
  • This aggregated human IgG was diluted to 10 ⁇ g / mL with PBS (+) containing 0.1%, and further serially diluted to prepare aggregated human IgG solutions having concentrations of 1.25, 2.5, 5.0, and 10 ⁇ g / mL.
  • Immunological measurement (ATI-C1q ELISA) (1) 100 ⁇ L each of the standard substance prepared in 2 (1) above, the IFX solution prepared in 2 (2) above, and the aggregated human IgG solution prepared in 2 (3) above in the wells of the immobilized C1q plate The mixture was allowed to react with stirring with a plate mixer for 1 hour at room temperature. (2) Next, discard the reaction solution, add 300 ⁇ L of 0.5% Tween 20 (Cat. No. 1706531, BioRad) -containing PBS ( ⁇ ) to each well, and discard the solution. This was repeated 4 times to wash the wells. (3) HRP-labeled Human anti-IFX monoclonal antibody (Cat. No.
  • HCA216P AbD Serotec
  • Can Get Signal Solution 2 Cat. No. NKB-301, Toyobo
  • 100 ⁇ L was added to each well.
  • the reaction was carried out at room temperature for 1 hour while stirring with a plate mixer.
  • 100 ⁇ L of TMB Blue substrate solution (Cat. No. S1601, Dako) was added, stirred, shielded from light, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Example 2 Measurement of anti-infliximab antibody (ATI) in patient plasma ⁇ 1> 1.
  • Sample preparation (1) Plasma collected from patients who developed reduced efficacy of antibody drugs (LOR) was diluted 4-fold with PBS (+), 200 ⁇ L was dispensed into microtubes, and PBS containing 0.1% BSA Add 50 ⁇ L of IFX (62.5 ⁇ g / mL) diluted with (+) or 50 ⁇ L of PBS (+) containing 0.1% BSA, mix, and then react overnight at 4 ° C. (final dilution factor is 5 times) .
  • a healthy plasma sample prepared by mixing the plasma of 5 healthy subjects was diluted 4-fold with PBS (+) in the same manner as the patient sample preparation, and 200 ⁇ L was dispensed into microtubes, and further 0.1% Add 50 ⁇ L of IFX (62.5 ⁇ g / mL) diluted with PBS (+) containing BSA or 50 ⁇ L of PBS (+) containing 0.1% BSA and mix at 4 ° C overnight. 5 times).
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Anti-Cd3 monoclonal antibody prepared at a concentration of 1 ⁇ g / mL with PBS (-) on a 96-well ELISA plate (MaxisorpF8 x12, Cat. No. 468667, Nunc) (Anti-C3d MoAb; Cat. No. MCA2648, AbD Serotec) was dispensed into each well in an amount of 100 ⁇ L and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Washed once.
  • 300 ⁇ L of blocking buffer was added and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solution was discarded and air-dried for 2 hours to obtain a solid-phased anti-Cd3 monoclonal antibody plate.
  • Sample preparation Preparation of standard substance (IFX-ATI immunocomplex (ATI-IFX / Sera)) 1) Cryopreserved IFX 100 ⁇ g / 100 ⁇ L / tube and Rabbit anti-human IgG (H + L) antibody (ATI As a substitute), 100 ⁇ g / 100 ⁇ L was mixed and reacted at 4 ° C. for 18 hours. 2) After the reaction, 800 ⁇ L of 62% healthy volunteer pooled serum (diluted with saline) was added to make 100 ⁇ g / mL, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
  • IFX-ATI immunocomplex ATI-IFX / Sera
  • HAG-IgG Human IgG 5mg / mL
  • I4506, Sigma was heated at 63 ° C for 20 minutes and centrifuged at 10,000xg for 5 minutes to produce aggregated human IgG did.
  • This aggregated human IgG was diluted to 10 ⁇ g / mL with PBS containing 0.1% (+), and further serially diluted to prepare aggregated human IgG solutions having concentrations of 0.1, 0.5, 1, 5, and 10 ⁇ g / mL.
  • Immunological assay (ATI- Anti C3d MoAb ELISA) (1) 100 ⁇ L of a standard substance was dispensed into the well of an immobilized anti-Cd3 monoclonal antibody plate, and allowed to react with stirring with a plate mixer at room temperature for 1 hour. (2) Next, the reaction solution was discarded, and 300 ⁇ L of PBS ( ⁇ ) containing 0.5% Tween 20 (Cat. No. 1706531, BioRad) was added to each well, and the solution was discarded. This was repeated 4 times to wash the wells. (3) HRP-labeled Human anti-IFX monoclonal antibody (Cat. No. HCA216P, AbD Serotec) was diluted 1000-fold with Can Get Signal Solution 2 (Cat. No.
  • Example 4 Measurement of anti-infliximab antibody (ATI) in patient plasma ⁇ 2> 1.
  • Preparation of sample 360 ⁇ L of 0.1% BSA / 0.01% Thimerosal / PBS (+) was added to 120 ⁇ L of plasma from patients with ulcerative colitis who expressed LOR in IFX maintenance therapy, diluted 4-fold, and 200 ⁇ L each in two microtubes
  • Add 50 ⁇ L of IFX (125 ⁇ g / mL) prepared with 0.1% BSA / 0.01% Thimerosal / PBS (+) or 50 ⁇ L of 0.1% BSA / 0.01% Thimerosal / PBS (+) and mix.
  • the reaction was allowed to proceed overnight at 0 ° C. (dilution ratio 10 to 40 times).

Abstract

医薬品による分子標的療法などを受けている患者において出現するＡＤＡｓを、より簡便に且つ正確に測定する方法の提供。　以下の工程（１）～（４）を含む、被測定検体中のＡＤＡｓの測定方法。　（１）ＡＤＡｓ体の被測定検体を含む試料を準備する工程　（２）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固相化した担体に、工程（１）で調製した試料を接触させる工程　（３）工程（２）で作製された固相担体に、前記ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体を接触させる工程　（４）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程

Description

抗医薬品抗体の測定方法
　本発明は、試料中の抗医薬品抗体（ＡＤＡｓ：anti-drug antibodies）の存在又はレベルを検出する方法に関する。
　抗体医薬品を含む遺伝子組換体によるタンパク製剤などのバイオ医薬品（以降「医薬品」）は、疾患関連分子や受容体に特異的に反応する抗体や物質を人工的に作製し、医薬品としたものである。近年、病因に関わる標的分子などをピンポイントで制御する医薬品を用いた分子標的治療が普及しており、現在、抗体医薬品については日米欧で４７品目が承認されている。そして、その多くは、癌や自己免疫疾患を対象とするもので、治療に欠かせない存在となっている製品も少なくない。
　しかしながら、抗体医薬品はヒト化した抗体や物質であっても、患者の免疫応答によりＡＤＡｓが産生され、効果減弱（ＬＯＲ; Loss of response）が発現し、病勢コントロールが難しくなるという問題がある。したがって、当該技術分野では、患者試料中のＡＤＡｓの存在を検出して、医薬品による分子標的療法を監視し及び治療決定を誘導する測定系が必要である。抗体医薬品ではない遺伝子組換体などの医薬品、例えばエリスロポエチン（非特許文献１）や他の医薬品においてもＡＤＡｓ産生によるＬＯＲなどが問題となっている（非特許文献２）。
　例えば、ＴＮＦ－αを標的とする抗体医薬品として代表的なインフリキシマブ（ＩＦＸ）の場合、投与後にＩＦＸに対する抗体（ＡＴＩ：antibodies to IFX）が出現するが、このＡＴＩの測定については、従来、ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、酵素結合免疫吸着法）によるｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｓｓａｙによるＡＴＩ測定法（非特許文献３）や、サンプルを前処理して標識ＩＦＸを添加し、ＨＰＬＣを用いるｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ法（非特許文献４）が知られている。
　しかしながら、ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｓｓａｙ法では、固相化したＩＦＸにＡＴＩを捕捉し、これを標識ＩＦＸで検出・測定するものであり、検体中に存在するＩＦＸの影響を受け正確な測定が困難な場合がある。また、ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ法は、高額な機器であるＨＰＬＣの導入が必要となり、汎用的ではない。
Casadevall et al., N Engl J Med 2002; 346:469-475 Baker et al., Self/Nonself 2010; 1: 314-322 Uri Kopylov et al., Inflamm Bowel Dis 2012;18:1628-1633 Wang SL et al., J Immunol Methods. 2012 Aug 31;382(1-2):177-88
　本発明は、医薬品による分子標的療法ならびに遺伝子組換サイトカインやホルモンなどの維持投与を受けている患者において出現するＡＤＡｓを、より簡便に且つ正確に測定する方法を提供することに関する。
　本発明者らは、斯かる状況に鑑み検討した結果、被測定検体中に存在するＡＤＡｓを、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体の形で補体Ｃ１ｑ等に捕捉させ、補足された医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を当該医薬品に対する抗体で検出・測定することにより、検体中のＡＤＡｓを正確に測定できることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の〔１〕～〔１４〕に係るものである。
〔１〕以下の工程（１）～（４）を含む、被測定検体中のＡＤＡｓの測定方法。
　（１）ＡＤＡｓの被測定検体を含む試料を準備する工程
　（２）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固相化した担体に、工程（１）で調製した試料を接触させる工程
　（３）工程（２）で作製された固相担体に、前記ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体を接触させる工程
　（４）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程
〔２〕工程（１）は、ＡＤＡｓの被測定検体に当該医薬品を添加して、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体が形成された試料を調製する工程を含む〔１〕に記載の方法。
〔３〕工程（１）において添加する医薬品の量は、被測定検体中のＡＤＡｓに比べて多い〔２〕に記載の方法。
〔４〕医薬品が抗ＴＮＦα薬である〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕医薬品がインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブ・ペゴールである〔４〕に記載の方法。
〔６〕医薬品がインフリキシマブである〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕工程（３）において用いる医薬品に対する抗体が、標識抗体である〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕標識抗体が酵素標識抗体である〔７〕に記載の方法。
〔９〕被測定検体が医薬品を投与された患者から採取された検体である〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕ＡＤＡｓの測定キットであって、
　補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固定化した固相担体、及び当該ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体を含む、測定キット。
〔１１〕医薬品に対する抗体が標識抗体である〔１０〕に記載の測定キット。
〔１２〕当該医薬品を更に含む、〔１１〕の測定キット。
〔１３〕試料中のＡＤＡｓを測定する方法であって、
前記試料と補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を接触させる工程と、
前記補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程と、
を含む方法。
〔１４〕前記〔１３〕において、
前記定量工程は、前記医薬品に対する標識抗体を用いる、方法。
　本発明の方法によれば、検体中に存在する医薬品の影響を受けることなく、正確に且つ簡便にＡＤＡｓを測定することができる。本発明の方法を用いて当該ＡＤＡｓのモニターを行うことにより、医薬品を用いた分子標的治療などにおける効果減弱発現の有無を確認することができ、より適切な治療が可能となる。
抗体医薬品一覧（国立医薬品食品衛生研究所　生物薬品部　提供資料） ＦＤＡが承認した抗体医薬品以外のバイオ医薬品とそのＡＤＡｓ発現率（Baker et al., Self/Nonself 2010; 1: 314-322, Table 1） ＡＴＩ用量反応曲線（ATI-C1q ELISA）と特異性を示すグラフ。 検体中のＡＴＩ濃度を示すグラフ。ＩＦＸ（＋）：ＩＦＸ添加、ＩＦＸ（－＋）：ＩＦＸ未添加 ＡＴＩ用量反応曲線（ATI- Anti C3d MoAb ELISA）と特異性を示すグラフ。 検体中のＡＴＩ濃度を示すグラフ。ＩＦＸ（＋）：ＩＦＸ添加、ＩＦＸ（－＋）：ＩＦＸ未添加
　本発明において、単に「医薬品」と云う場合、抗体医薬品を含む遺伝子組換体などのバイオ医薬品を指す。
　ここで、「抗体医薬品」とは、疾患関連分子に特異的に結合する人工的に作製された抗体を含む医薬品を意味する。その標的分子は、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０等の細胞表面分子等、様々であり特に限定されないが、ＴＮＦ－αを標的とするものが適する。ＴＮＦ－αを標的とする抗体医薬品としては、インフリキシマブ（infliximab）、アダリムマブ（adalimumab）、ゴリムマブ（golimumab）、セルトリズマブ・ペゴール（certolizumab pegol）が知られており、このうちインフリキシマブが好適である。
　また、抗体の種類は、マウス抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の何れであっても良いが、ヒト化抗体又はヒト抗体が好ましい。
　平成２８年４月現在で、日米欧で承認されている抗体医薬品を以下に示す。また、その詳細を図１－Ａに示す。また、ＦＤＡが承認した抗体医薬品以外のバイオ医薬品については、図１－Ｂに示す。
　ムロモナブ－ＣＤ３（muromonab-CD3）、イブリツモマブ・チウキセタン（ibritumomab tiuxetan）、ヨウ素１３１トシツモマブ（iodine 131 Tositumoma）、カツマキソマブ（catumaxomab）、ブリナツモマブ（blinatumomab）、アブシキシマブ（abciximab）、リツキシマブ（rituximab）、バシリキシマブ（basiliximab）、インフリキシマブ（infliximab）、セツキシマブ（cetuximab）、ブレンツキシマブ・ベドチン（brentuximab vedotin）、シルツキシマブ（siltuximab）、ジヌツキシマブ（dinutuximab）、オビルトキサキシマブ（obiltoxaximab）、ダクリズマブ（daclizumab）、パリビズマブ（palivizumab）、trastuzumab、ゲムツズマブ・オゾガミック（gemtuzumab ozogamic）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、オマリズマブ（omalizumab）、エファリズマブ（efalizumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、ナタリズマブ（natalizumab）、トシリズマブ（tocilizumab）、ラニビズマブ（ranibizumab）、エクリズマブ（eculizumab）、セルトリズマブ・ペゴール（certolizumab pegol）、モガムリズマブ（mogamulizumab）、ペルツズマブ（pertuzumab）、トラスツズマブ・エムタンシン（trastuzumab emtansine）、オビヌツズマブ（obinutuzumab）、ベドリズマブ（vedolizumab）、ペンブロリズマブ（pembrolizumab）、イダルシズマブ（idarucizumab）、メポリズマブ（mepolizumab）、エロツズマブ（elotuzumab）、ダラツムマブ（daratumumab）、イクセキズマブ（ixekizumab）、レスリズマブ（reslizumab）、アダリムマブ（adalimumab）、パニツムマブ（panitumumab）、ゴリムマブ（golimumab）、ウステキヌマブ（ustekinumab）、カナキヌマブ（canakinumab）、オファツムマブ（ofatumumab）、デノスマブ（denosumab）、イピリムマブ（ipilimumab）、ベリムマブ（belimumab）、ラキシバクマブ（ｒaxibacumab）、ラムシルマブ（ramucirumab）、ニボルマブ（nivolumab）、セクキヌマブ（secukinumab）、エボロクマブ（evolocumab）、アリロクマブ（alirocumab）、ネシツムマブ（necitumumab）。
　本発明において、「ＡＤＡｓ」は、上記抗体医薬品の何れかもしくは図１－Ｂに列挙する抗体医薬品以外のバイオ医薬品をヒトに投与した場合に産生される、当該医薬品を認識する抗体を意味する。
　尚、本発明において、「抗体医薬品」と云う場合、特定された１つの抗体医薬品を意味し、この場合のＡＤＡｓは、そのように特定された抗体医薬品に対する抗体を意味する。例えば、「インフリキシマブ（ＩＦＸ）」と、ＡＤＡｓとしてのインフリキシマブに対する抗体（抗インフリキシマブ抗体（ＡＴＩ））が挙げられる。
　以下、本発明のＡＤＡｓの測定方法における（１）～（４）の各工程について説明する。
＜工程－（１）＞
　本工程は、ＡＤＡｓの被測定検体を含む試料を準備する工程である。
　ここで、被測定検体は、ＡＤＡｓを含む可能性がある検体であり、例えば医薬品を投与された患者から採取された検体である。当該被測定検体としては、好適には、血清又は血漿が挙げられる。
　当該検体は、患者から採取された後、本発明の測定に影響を与えない範囲で、適宜、希釈、可溶化、濃縮等の処理がされていてもよい。
　ＡＤＡｓは、患者の体内において、医薬品とＡＤＡｓが結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体として、或いは遊離のＡＤＡｓとして存在し得る。本発明において、遊離のＡＤＡｓを含めて総ＡＤＡｓを測定する場合には、ＡＤＡｓの被測定検体に当該医薬品を過剰に添加して、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体が形成された試料が調製される。
　試料の調製は、具体的には、水系溶媒（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質を適宜添加した酸緩衝液（クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液等、ｐＨ約５－９程度）中で、医薬品と検体を混合・攪拌することにより行うことができる。
　ここで、医薬品の使用量は、検体中に存在する当該医薬品に対するＡＤＡｓを免疫複合体として回収するために十分な量であればよく、例えば、検体（血清又は血漿）１００μＬに対して２～１０μｇ、好ましくは３～５μｇを使用することが挙げられる。
　また、反応時間は、通常、１６～２４時間、好ましくは、１８～２０時間である。反応時の温度は、好ましくは、４～１０℃である。
＜工程－（２）＞
　本工程は、補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固定化した固相担体に、試料中の医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を捕捉する工程である。
　補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体は、何れもヒト流血中の免疫複合体に結合することが知られている分子である。
　補体Ｃ１ｑは、１８サブユニット（各６分子ずつのＡ鎖・Ｂ鎖・Ｃ鎖）より構成される約４６２ｋＤａのタンパク質で、補体活性化経路の第１因子Ｃ１の主要構成因子であり、抗原抗体複合体を認識する（Sunyer,J.O. and Lambris,J.D.（1999). Complement. Encyclopedia of Life Sciences）。
　Ｃ１ｑは、例えば、血清又は血漿を透析して得られるＣ1ｑ粗精製物溶液をＩｇＧ固定化不溶性担体に接触させた後、当該不溶性担体に吸着したＣ1ｑを分離回収する方法（特開平９－１７８７４５）等、公知の方法によって調製することができる。また、市販のＣ1ｑ（例えば、Ｓｉｇｍａ社のＣａｔ．Ｎｏ．Ｃ１７４０を使用することも可能である。
　抗Ｃ１ｑ抗体は、上記Ｃ１ｑを認識する抗体であり、本発明においてはモノクローナル抗体であるのが好ましい。抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、例えばＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ社からＭＣＡ２６０３として販売されている。
　抗Ｃ３ｄ抗体は、補体Ｃ３ｄを認識する抗体であり、本発明においてはモノクローナル抗体であるのが好ましい。抗Ｃ３ｄモノクローナル抗体は、例えばＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ社からＣａｔ．Ｎｏ．ＭＣＡ２６４８として販売されている。
　Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体の担体への固相化は、Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を通常使用される不溶性、不活性の担体上に固定化することにより行われる。
　斯かる担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を挙げることができる。
　固相化は、担体にＣ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法を用いて結合させることにより達成することができる。例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）のような緩衝液で５～２０μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣ１ｑ溶液、抗Ｃ３ｄ抗体溶液又は抗Ｃ１ｑ抗体溶液を担体と接触させ、４～１０℃で、１６～２４時間反応させることにより、Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を担体へ固相化することができる。
　また、上記反応終了後、通常、担体上の非特異的な結合を抑制するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含むブロッキング溶液でブロッキング処理を行うことが好ましい。
　試料の上記固相担体への接触は、たとえば、４～１０℃で、１６～２４時間、反応させることにより行うことができる。
　反応終了後は、Ｔｗｅｅｎ　２０等の界面活性剤を含む緩衝液等を用いて洗浄し、未反応物体が除去される。
＜工程－（３）＞
　本工程は、前工程で作製された固相担体に、前記ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体（検出用ＡＤＡｓ）を接触させ、Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体と反応させる工程である。
　ここで、ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体としては、医薬品（測定対象であるＡＤＡｓに対応する医薬品）を認識する抗体であれば、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、これらの抗体は、通常の抗体の作成方法により取得することができる。また、抗体としては、ＩｇＧだけでなく、抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント等）を使用してもよい。
　例えば、ポリクローナル抗体は、医薬品を抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。抗原投与の方法は当業者に公知であり、投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、必要に応じてアジュバントを使用することもできる。免疫感作した哺乳動物を適当な期間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原を投与して追加免疫を行なってもよい。最後の投与から１～２ケ月後に免疫動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナルＡＤＡｓを得ることができる。
　また、モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマを作製することにより取得することができる。抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂ リンパ球等を使用することができる。
　例えば、免疫動物から抗体産生細胞として脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞と公知の方法（G. Kohler e t al., Nature, 256, 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。
　更に、医薬品を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、所望の医薬品を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
　尚、下記表１に示す抗体医薬品については、当該抗体医薬品に対するモノクローナル抗体がAbD Serotec社（Oxford,UK）から市販されており、本発明においては、当該市販品を用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記検出用ＡＤＡｓとして、標識体（標識ＡＤＡｓ）を用いる場合の標識子としては、免疫測定法において慣用の各種酵素類、放射性同位元素類、蛍光物質類等を使用することができるが、酵素類を用いるのが好ましい。ここで、酵素類としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ－ナーゼ、Ｐ－ナーゼなどが挙げられる。
　また、放射性同位元素類としては、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等が挙げられ、蛍光物質類としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ等が挙げられる。
　これらの標識物質による標識は、公知の方法に従って実施できる。
　固相担体への標識ＡＤＡｓの添加は、標識ＡＤＡｓを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質、Ｔｗｅｅｎ　２０等の界面活性剤を含むバッファー（例えば、Can Get Signal Solution 2(Cat.No.NKB-301,Toyobo）で希釈して加えるのが好ましい。
　反応（結合）条件は、特に制限はなく、一般にこの種の測定法で用いられる通常の条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは室温で、約１－５時間程度行えばよい。
　反応終了後は、Ｔｗｅｅｎ　２０等の界面活性剤を含む緩衝液等を用いて洗浄し、未反応の標識ＡＤＡｓが除去される。
＜工程－（４）＞
　本工程は、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体に結合した、医薬品に対する抗体の量を測定することにより、Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程である。
　当該医薬品に対する抗体すなわちＡＤＡｓの量の測定は、公知の免疫学的測定法を用いて行うことができる。免疫学的測定法としては、代表的には酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が挙げられるが、この他に以下の測定法を例示できる。
　１．化学発光法:MSD：Electrochemiluminescence was measured on the Sector Imager 6000 instrument (Meso Scale Discovery,Rockville, MD, United States)．
　２．イムノクロマト: HMSA(homogeneous mobility shift assay): Agilent Technologies 1200 series HPLC system (Santa Clara, CA).  BioSep SEC-3000 column (Phenomenex, Torrance, CA)．
　３．BIAcore (Plasmon Resonance): Biacore T100 Immunogenicity Package (GE Healthcare Bio-Sciences GyrosAB, Uppsala Sweden)．
　４．蛍光法：
　　4-1  Gyrolab. Fluorescence was measured on the Gyrolab　Workstation with the Gyrolab Control software (v5.4.0)(GyrosAB, Uppsala, Sweden).
　　4-2  AlphaLISA. Fluorescence was measured on the Synergy NEO instrument (Biotek, Luzern, Switzerland).
　５．ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
　６．イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）
　７．蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA;fluorescence polarization immunoassay)
　８．免疫比濁法（イムノネフェロメトリー）
　９．ラテックス凝集比濁法
１０．ラテックス凝集抑制イムノアッセイ
１１．時間分解蛍光イムノアッセイ(TR-FIA;time-resolved fluorescence immunoassay)
　例えば、医薬品に対する抗体として標識抗体を用いる場合は、標識体の量が測定され、標識体の測定は、標識に応じた方法、すなわち、酵素標識であれば酵素活性、放射性標識であれば放射活性、蛍光標識であれば蛍光強度を測定することにより行われる。
　例えば標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、基質としてＴＭＢ（３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン）を用いて、またアルカリホスファターゼを用いる場合は、基質としてp-ニトロフェニルホスフェートを用い、各基質の分解を、分光光度計等を用いて測定することができる。
　検体中のＡＤＡｓの量は、標準試料において形成された医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体の測定値を基に作成された検量線に基づき、試料中に含まれる医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体の定量値から計算される。
　本発明の方法によれば、検体中に存在する、医薬品と結合した状態のＡＤＡｓ及び／又は医薬品と結合していない遊離のＡＤＡｓの何れも測定することができる。
　本発明のキットは、少なくともＣ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固定化した固相担体、及び当該医薬品に対する標識抗体を含むＡＤＡｓの測定キットである。当該キットは、好適には上述したＡＤＡｓの測定方法を行うためのキットであり得る。
　本発明のキットには、さらに本発明の医薬品を含むことができ、必要に応じて、さらに標識物質を検出するための基質他、測定の実施に必要な試薬類、希釈液、緩衝液、洗浄液などが含まれていてもよい。
　以上のとおり、本発明は、試料中のＡＤＡｓを、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体として補足し、検出用のＡＤＡｓを用いて目的の患者由来のＡＤＡｓを定量することを測定原理とする。以下の実施例では、補体Ｃ１ｑ又は抗Ｃ３ｄ抗体を固相化して医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を補足し、ＥＬＩＳＡ法よってＡＤＡｓを定量することを示すが、Ｃ１ｑもしくは同等の免疫複合体を補足する能力を有する遺伝子組み換え体、補体受容体やモノクローナル抗体などを用いることも可能である。また、免疫学的測定法は、ＥＬＩＳＡ法の他に上述した多岐にわたる免疫測定法、自動分析装置などが使用可能であり、本発明は当該実施例によって限定されるものではない。
実施例１　インフリキシマブ（ＩＦＸ）に対する抗体（ＡＴＩ）の測定＜１＞
＜試薬の調製>
１）PBS（Phosphate buffered saline、リン酸緩衝生理食塩水）；
　・PBS（-）：NaCl 137mmol/l, KCl 2.68mmol/l, KHPO4 2mmol/l, NaH2PO4・12H2O 10mmol/l, pH.7.4
　・PBS（+）：PBS(-)にCaCl2を0.9mM, MgCl212H2Oを0.33mM加えて調製した。
２）blocking buffer；
　PBS(-)に0.5% boiled（5分間煮沸） Casein（Cat.No.C7078, Sigma）, 1% Tween20および 0.01% Thimerosalを添加した。
１．固相化C1q プレートの作製
（１）96 ウエル ELISA用プレート(MaxisorpF8 x12 ,Cat.No.468667,Nunc）にPBS(-)で１0μg/mLの濃度に調製したC1q（Cat.No.C1740, Sigma)を100μLずつ各ウエルに分注し、4℃で一晩静置した。
（２）プレートのC1q溶液を捨て、300μL の0.5％Tween20を含むPBS(-)で、各ウエルを1回洗浄した。
（３）洗浄後、300μLのblocking bufferを加え、室温で1時間反応させる。反応後、液を捨て2時間風乾させて固相化C1qプレートとした。
２．試料の調製
（１）標準試料の調製
　１）抗ヒトIgG抗体を抗IFX抗体（ATI）標準試料として代用した。
　ウサギ 抗ヒト IgG (H+L) 抗体（Cat.No.ab7155, abcam)を0.1%BSA（Cat.No.A-3803,Sigma）を含有するPBS(+)により5μg/mLの濃度に調製し、さらに0.1%BSA 含有PBS(+)で段階希釈して0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5μg/mLの濃度の標準物質を作製した。
　２）各濃度の標準物質を200μLずつマイクロチューブに入れ、さらに0.1%BSA 含有PBS(+)で希釈したIFX (62.5μg/mL；田辺三菱製薬)を50μLずつ添加して混和後、4℃で一晩反応させ標準物質（IFX- ATI免疫複合体）とした。
（２）ＩＦＸ溶液の調製
　１mg/mLで凍結保存しているIFXを溶解し、0.1%BSA 含有PBS(+)で段階希釈して12.5、25、50、100μg/mLの濃度のIFX溶液を作製した。
（３）凝集ヒトＩｇＧ溶液（HAG-IgG）の調製
　ヒトIgG 5mg/mL（I4506、Sigma）を63℃で20分間加温し、10000xgで5分間遠心した上清をとり、凝集ヒトIgGを作製した。この凝集ヒトIgGを0.1%含有PBS(+)で10μg/mLに希釈し、さらに段階希釈して1.25、2.5、5.0、10μg/mLの濃度の凝集ヒトIgG溶液を作製した。
３.免疫学的測定（ATI-C1q ELISA）
（１）固相化C1qプレートのウエルに上記２（１）で調製した標準物質、上記２（２）で調製したIFX溶液、上記２（３）で調製した凝集ヒトIgG溶液をそれぞれ100μLずつ分注し、室温で1時間、プレートミキサーにて撹拌しながら反応させた。
（２）次に反応液を捨て、300μL の0.5％Tween 20（Cat.No. 1706531, BioRad）含有PBS(-)を各ウエル加えた後、液を捨てる。これを4回繰り返してウエルを洗浄した。
（３）HRP標識Human 抗IFX モノクローナル抗体（Cat.No.HCA216P,AbD Serotec)をCan Get Signal Solution 2(Cat.No.NKB-301,Toyobo)で1000倍希釈して100μLずつ各ウエルに加え、室温で1時間、プレートミキサーで撹拌しながら反応させた。
（４）反応後、液を捨て、300μL の0.5％Tween 20含有PBS(-)を各ウエル加えた後、液を捨てる。これを4回繰り返してウエルを洗浄した。
（５）TMB Blue基質液(Cat.No.S1601,Dako)を100μLずつ加え、撹拌し遮光して室温で30分間静置した。
（６)発色後、１N-H2SO4を50μLずつ各ウエルに加えて反応を停止させ、プレートリーダー（96穴プレート用吸光度計）で450nm/650nmの波長で吸光度を測定した。
（７）標準試料の検量線（用量反応曲線）を作成した。
４．結果
　ATI 2.5 μg/mLで、吸光度（O.D.）は1.99を示し用量反応曲線はプラトーに達した（図２）。一方、C1qに捕捉される加熱処理して凝集したヒトIgG（HAG-IgG）を10μg/mL、又はIFXを100μg/mLまで添加してもO.D.の明らかな上昇は認められなかった。
　よって、当該用量反応曲線（検量線）より、検体の吸光度値から検体中のATI量を特異的に算出することができる。
実施例２　患者血漿中の抗インフリキシマブ抗体（ＡＴＩ）の測定＜１＞
１．試料の調製
（１）抗体医薬品の効果減弱（LOR）を発現した患者から採取された血漿をPBS(+)で4倍希釈し、その200μLをマイクロチューブに分注し、さらに0.1%BSA 含有PBS(+)で希釈したIFX (62.5μg/mL) を50μL、又は0.1%BSA 含有PBS(+)を50μLずつ添加して混和後、4℃で一晩反応させた（最終希釈倍率は5倍）。
（２）5例の健常者の血漿を混和して作製した健常血漿検体を患者検体の調製と同様にPBS(+)で4倍希釈し、その200μLをマイクロチューブに分注し、さらに0.1%BSA 含有PBS(+)で希釈したIFX (62.5μg/mL) を50μL、又は0.1%BSA 含有PBS(+)を50μLずつ添加して混和後、4℃で一晩反応させた（最終希釈倍率は5倍）。
２．免疫学的測定
　実施例１と同様にして作製した固相化C1qプレートのウエルに、上記１（１）及び（２）で調製した試料を100μLずつ分注し、実施例１の３（免疫学的測定）で示した方法に従って反応させ、図２で示した検量線より、試料中のATI量を測定した。
３．結果
　患者血漿においてはIFX添加により更にIFX-ATI免疫複合体が形成され測定値は上昇し、希釈率に従い測定値は低下した。一方、健常血清検体ではIFX添加・無添加に関わらず、ATIは検出されなかった（図３）。
　これより、IFX添加による本発明の方法によれば、患者の血漿中に含まれるIFXと結合しているATI量及び／又はIFXと非結合のATI量を測定することができる。
実施例３　インフリキシマブ（ＩＦＸ）に対する抗体（ＡＴＩ）の測定＜２＞
＜試薬の調製>
１）PBS（Phosphate buffered saline、リン酸緩衝生理食塩水）；
　・PBS（-）：NaCl 137mmol/l, KCl 2.68mmol/l, KHPO4 2mmol/l, NaH2PO4・12H2O 10mmol/l, pH.7.4
　・PBS（+）：PBS(-)にCaCl2を0.9mM, MgCl212H2Oを0.33mM加えて調製した。
２）blocking buffer；
　PBS(-)に0.5% boiled（5分間煮沸） Casein（Cat.No.C7078, Sigma）, 1% Tween20および 0.01% Thimerosalを添加した。
１. 固相化抗Cd3モノクローナル抗体プレートの作製
（１）96 ウエル ELISA用プレート(MaxisorpF8 x12 ,Cat.No.468667,Nunc）にPBS(-)で１μg/mLの濃度に調製した抗Cd3モノクローナル抗体（Anti-C3d MoAb；Cat.No.MCA2648,AbD Serotec)を100μLずつ各ウエルに分注し、4℃で一晩静置した。1回洗浄した。
（２）洗浄後、300μLのblocking bufferを加え、室温で1時間反応させた。反応後、液を捨て2時間風乾させて固相化抗Cd3モノクローナル抗体プレートとした。
２．試料の調製
（１）標準物質（IFX-ATI免疫複合体（ATI-IFX/Sera））の調製
　１）凍結保存のIFX 100μg/100μL/tubeと ウサギ抗ヒトIgG(H+L) 抗体 (ATIの代用として)100μg/100μLを混ぜ、4℃で18時間反応させた。
　２）反応後、62％の健常者プール血清（生食で希釈）を800μL加えて100μg/mLとし、37℃で60分間反応させた。
　３）反応終了後、0.1％BSA/0.01% Thimerosal/PBS(+)で20倍希釈して、5μg/mLの濃度にし、ATI標準液とした。500μL/tubeで分注して-80℃にて凍結保存した。
　４）凍結保存のATI標準液(5μg/mL)を融解し、その40μLを取り0.1％BSA/0.01% Thimerosal/PBS(+)を960μL加えて200ng/mLを作製し、さらに段階希釈を繰り返して、0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200ng/mL濃度の標準物質（ATI-IFX/Sera）を作製した。
（２）ＩＦＸ溶液の調製
　１mg/mLで凍結保存しているIFXを溶解し、0.1%BSA 含有PBS(+)で段階希釈して0.1、0.5、１、5、10μg/mLの濃度のIFX溶液を作製した。
（３）凝集ヒトＩｇＧ（HAG-IgG）溶液の調製
　ヒトIgG 5mg/mL（I4506、Sigma）を63℃で20分間加温し、10000xgで5分間遠心した上清をとり、凝集ヒトIgGを作製した。この凝集ヒトIgGを0.1%含有PBS(+)で10μg/mLに希釈し、さらに段階希釈して0.1、0.5、１、5、10μg/mLの濃度の凝集ヒトIgG溶液を作製した。
３．免疫学的測定（ATI- Anti C3d MoAb ELISA）
（１）固相化抗Cd3モノクローナル抗体プレートのウエルに標準物質を100μL分注し、室温で1時間、プレートミキサーにて撹拌しながら反応させた。
（２）次に反応液を捨て、300μL の0.5％Tween 20（Cat.No. 1706531, BioRad）含有PBS(-)を各ウエル加えた後、液を捨てた。これを4回繰り返してウエルを洗浄した。
（３）HRP標識Human 抗IFX モノクローナル抗体（Cat.No.HCA216P,AbD Serotec)をCan Get Signal Solution 2(Cat.No.NKB-301,Toyobo)で1000倍希釈して100μLずつ各ウエルに加え、室温で1時間、プレートミキサーで撹拌しながら反応させた。
（４）反応後、液を捨て、300μL の0.5％Tween 20含有PBS(-)を各ウエル加えた後、液を捨てた。これを4回繰り返してウエルを洗浄した。
（５）洗浄後、100μLのTMB Blue基質液(Cat.No.S1601,Dako)を各ウェルに加え、室温で15~30分間、遮光して反応させた。
（６)発色後、50μLの1.0M H2SO4を加えて反応を停止し、プレートリーダー（96穴プレート用吸光度計）で450nm/650nmの2波長で吸光度を測定した。
（７）標準物質の検量線（用量反応曲線）を作成した。
４．結果
　ATI 200ng/mLで吸光度（O.D.）は2.1と最大値となる用量反応曲線を示した。一方、C3dが結合する加熱処理して凝集したヒトIgG（HAG-IgG）を10μg/mLもしくは、IFXを10μg/mLまで添加してもO.D.の明らかな上昇を認めなかった（図４）。
実施例４　患者血漿中の抗インフリキシマブ抗体（ＡＴＩ）の測定＜２＞
１．試料の調製
　IFX維持療法にLORを発現した潰瘍性大腸炎患者の血漿120μLに0.1％BSA/0.01% Thimerosal/PBS(+)を360μL加えて4倍希釈し、その200μLずつ2本のマイクロチューブに分注、さらに0.1％BSA/0.01% Thimerosal/PBS(+)で調製したIFX (125μg/mL) を50μL、又は0.1％BSA/0.01% Thimerosal/PBS(+)を50μL添加して混和し、4℃で一晩反応させた（希釈倍率１０～４０倍）。
２．免疫学的測定
　実施例３と同様にして作製した固相化抗Cd3モノクローナル抗体プレートのウエルに、上記１で調製した試料を100μLずつ分注し、実施例３の３（免疫学的測定）で示した方法に従って反応させ、図４で示した検量線より、試料中のATI量を測定した。
３．結果
　患者血漿はIFX添加により更にIFX免疫複合体形成が促進され測定値は上昇し、希釈率に従い測定値は低下した（図５）。

Claims (14)

  1. 　以下の工程（１）～（４）を含む、被測定検体中のＡＤＡｓの測定方法。
    　（１）ＡＤＡｓの被測定検体を含む試料を準備する工程
    　（２）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固相化した担体に、工程（１）で調製した試料を接触させる工程
    　（３）工程（２）で作製された固相担体に、前記ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体を接触させる工程
    　（４）補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程
  2. 　工程（１）は、ＡＤＡｓの被測定検体に当該医薬品を添加して、医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体が形成された試料を調製する工程を含む請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（１）において添加する医薬品の量は、被測定検体中のＡＤＡｓに比べて多い請求項２に記載の方法。
  4. 　医薬品が抗ＴＮＦα薬である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　医薬品がインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブ・ペゴールである請求項４に記載の方法。
  6. 　医薬品がインフリキシマブである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（３）において用いる医薬品に対する抗体が、標識抗体である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　標識抗体が酵素標識抗体である請求項７に記載の方法。
  9. 　被測定検体が医薬品を投与された患者から採取された検体である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　ＡＤＡｓの測定キットであって、
    　補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を固定化した固相担体、及び当該ＡＤＡｓに対応する医薬品に対する標識又は非標識抗体を含む、測定キット。
  11. 　医薬品に対する抗体が標識抗体である請求項１０に記載の測定キット。
  12. 　当該医薬品を更に含む、請求項１１に記載の測定キット。
  13. 　試料中のＡＤＡｓを測定する方法であって、
    前記試料と補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体を接触させる工程と、
    前記補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ３ｄ抗体又は抗Ｃ１ｑ抗体に結合した医薬品－ＡＤＡｓ免疫複合体を定量する工程と、
    を含む方法。
  14. 　前記請求項１３において、
    前記定量工程は、前記医薬品に対する標識抗体を用いる、方法。
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