JPS59122951A - ヒトの抗生得ｄｎａ抗体上の共通イデイオタイプと反応可能なモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイ
プと反応可能なモノクローナル抗体（単クローン抗体）
に関する。また２本発明は全身性紅斑性狼癒に罹患して
いることが疑われる患者中の抗生得ＤＮＡ抗体の存在を
検出する診断試験方法に関する。

免疫学で使用される１′抗体″という用語は包括的用語
であり、成る面でよく似ており、また、他の面では異な
っている多くの免疫グロブリンを包含して使用されてい
る。共通エフェクター機能（ｃｏｍｍｏｎ　ｅｆｆｅｃ
七ｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する抗体はイソタイプ
（ｉｓｏｔｙｐｅ）と呼ばれ、主要な免疫グロブリンで
あるＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍなどが含まれる。これらは各々、ある暫定な種類に特
有なＨ鎖とカッパ型またはラムダ型のいずれかのＬ鎖か
ら構成されており、そして、Ｈ鎖とＬ鎖はジスルフィド
結合によって結合されている。異種抗体、即ち、一つの
種のなかで別の種の抗体に対して生ずる抗体、はイソタ
イプを識別するのに有用である。

特定のイソタイプ、例えば、　ＩｇＧ、の抗体（複数）
は該抗体を構成する特定のタイプのＨ鎖に基づき。

例えば、γ１．γ２．γ３等にさらに細区分できる。同
じ一般的タイブのＨ鎖を有する抗体もなおＨ鎖中で成る
種の異質性を示すことができる。特定の動物種において
は、特定のイソタイプのＨ鎖上の成る領域は同一である
こともでき、あるいは異なっていてもよい。これらの領
域内で類似性を示す抗体はアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐ
ｅ）と呼ばれる。この類似性は遺伝子に由来するものと
信じられている。

最後に、特定のイソタイプおよびアロタイプの抗体は該
抗体の抗原結合領域（Ｆａｂ領域）中の。

またはその付近の該抗体の構成に基づき、異なることも
ある。この領域中で類似性を示す抗体は同じイディオタ
イプ（ｉｄｉｏｔｙｐｅ）のものであると言われている
。これらの領域内の特別な区別される抗原部位はイディ
オタイプ決定基とが、あるいは。

しばしば、そのまま、イディオタイプと呼ばれている。

共通または共有イディオタイプ（ｃｏｍｍｏｎ　ｏｒｓ
ｈａｒｅｄ　１ｄｉｏｔｙｐｅ）を有する抗体は一般的
に同一の抗原特異性を有する。

イディオタイプ間の共通抗原特異性にもかかわらず、全
てのイディオタイプ決定基が免疫グロブリン分子の抗原
結合部位°に存在するわけではない。

このことは、第一の抗体上のイディオタイプ決定基に対
して作用する第二の抗体（以下、この第二の抗体を「抗
イデイオタイプ抗体」と呼ぶ）と抗原とが第−抗体上の
抗原結合部位に対して必らずしも競合的でない、という
事実によって実証される。イディオタイプ決定基は遺伝
および抗原の影響の双方によりコントロールされる。共
通抗原特異性を有する遺伝的に異なる個体に由来する抗
原は通常、イディオタイプ的な異質性を示す。即ち。

抗体が同じ抗原に結合できたとしても、イディオタイプ
決定基の構造は、抗原結合部位に位置している場合であ
っても、異なる。

免疫グロブリン分子上のイディオタイプ決定基に対して
作用する抗体は自己免疫疾患にともなう。

また、その特徴でもある抗体類を検出するための検出手
段となる。抗イデイオタイプ抗体を含有する血清は、背
筋無力症、グレーブス病、寒冷凝集素疾患およびリュー
マチ性関節炎などのような多くの自己免疫疾患において
、無関係の患者番こ由来する免疫グロブリンについて共
通イディオタイプを証明するのに使用されてきた。ヒト
の全身性紅ウスにより産生きれる。生得ＤＮＡＫ対する
抗体（抗−ｎＤＮＡ）は共通イディオタイプを有するこ
とが示されているが、共通イディオタイプｉｔ、ｓＬＥ
に罹患した人間患者の抗−ｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ抗体中力λら
は未だ検出され、証明されていなし）。

全身性紅斑性狼癒は年々高い頻度で診断発見されている
疾患である。その発生率は最小しこ見積もっても１００
，０００人あたり１０人であるが、５ＬＥｔ±黒人およ
び妊娠可能年令の女性に優先的しこ発生する。ＳＬＥ患
者の家系中のＳＬＥ発生率１′！、全人口におけるＳＬ
Ｅ発°生率よりも少なくとも１００倍高いが、その遺伝
機構は解明されてｐＮなｔ＼。全身性紅斑性狼癒は臨床
学的にも、血清学的にも多様症候発現の疾患である。臨
床学的には、ＳＬＥはあらゆる器官系−を冒す。ＳＬＥ
は発熱および倦怠のような全身的症状を生じさせる。ま
た、ＳＬＥは関節炎、漿膜炎（混性、腹膜性および心嚢
性）、腎疾患、血液学的異常およ°び中枢神経系障害な
どをおこす。狼癒患者の血清は自己抗体が存在するので
、様々な抗原と反応することができる。これらの自己抗
体は主に細胞核抗原および細胞膜抗原に作用するが、細
胞質抗原に対する少数の抗体しか記載されていない。Ｓ
ＬＥに特異的であり、しかも、ＳＬＥ患者の血清中に最
も一般的に見いだされる自己抗体は生得ＤＮＡに対する
抗体である。

前述のように、１個の個体は一般的にＤＮＡのような特
定の抗原に対する多、くの異なった抗体を産生する。こ
のような抗体は全て共通抗原と反応できるが、抗体は構
造的相違を示すことがあり。

その場合イディオタイプ的な異質性が付与されている。

さらに、一般に別のイディオタイプ的な相違が共通の抗
原に対して遺伝的に同一でない個体によって産生された
抗体の間にも存在する。従って、遺伝的に異なったヒト
集団では、ＳＬＥ患者の□抗ＤＮＡ抗体には広範な異質
性が存在するだろうと思われる。従って、成る個体の抗
ＤＮＡ抗体に対して産生された抗イデイオタイプ抗体は
集団中の他の遺伝的に同一でない個体の抗ＤＮＡ抗体と
交差反応するとは予期されなかった。本発明では、−人
のＳＬＥ患者から得られた杭生得ＤＮＡ抗体に対してモ
ノクローナル抗イデイオタイプ抗体が産生され、そして
、この抗体は、予期されなかったことに、ヒトの集団中
の遺伝的に同一ではないＳＬＥ患者から得られた抗生得
ＤＮＡ抗体と交差反応する。この予期されなかった交差
反応性により、このモノクローナル抗体は、集団中のＳ
ＬＥに罹患していることの疑われる患者から得られた血
清中の抗生得ＤＮＡ抗体を検出するための診断薬として
使用できる。

本発明は、その一つの様相において、ヒトの抗生得ＤＮ
Ａ抗体上の共通イディオタイプと反応可能なモノクロー
ナル抗体（本明細書では、また。

モノクローナル抗イデイオタイプ抗体とも呼ぶ）からな
る組成物を提供することである。

本発明はまた別の様相において、液状の生物学的検体を
、ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと結
合可能なモノクローナル抗イデイオタイプ抗体と接触さ
せ、結合の程度を測定することからなる。該液状生物学
的検体中に存在していることを疑われる抗生得ＤＮＡ抗
体を検出する方法を提供することである。

本発明の抗イデイオタイプ抗体は単一のハイブリドーマ
から由来するモノクローナル抗体であり。

また、これはＩｇＧまたはＩｇＭイソタイプのいずれか
である。ＩｇＧイソタイプの方が好ましい。さらに２本
発明の抗体は正常なヒトの免疫グロブリンの非イディオ
タイプ領域とは非反応性である。また２本発明の抗体は
抗生得ＤＮＡ抗体の抗原結合領域中に位置するイディオ
タイプ決定基と、あるいは、抗原結合領域外に位置する
イディオタイプ決定基と結合できる。モノクローナル抗
体が循環免疫複合体を検出できるので、抗原結合領域外
に位置するイディオタイプ決定基と結合する方が好まし
い。本発明の抗体は２Å以上の遺伝的に同一ではない個
体間の共通のイディオタイプ仁交差反応する。

本発明のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体は公知の
細胞融合技術を使用することにより調製できる。この調
製法は例えば、　Ｇｅｆｔｅｒらの”Ｓｏｍａｔｉｃ　
Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、”、第３巻、　２３１〜２３６
頁（１９７７）およびＫｅａｒｎｅｙらの”Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、’″、第１第１春３ 一般に，ｌｌｌ１乳類生体（ヒトまたはヒト以外）から
得られるＢリンパ球を，該リンパ球が得られた生物種と
同一の，または異なる種のいずれかの生物から得た杭生
得ＤＮＡ抗体に対して特異的に感作し，この感作Ｂリン
パ球を適合可能な融合パートナ−好ましくは，非分泌性
骨髄腫細胞と融合させ。

次いで，得られた融合生成物をスクリーニングし。

前記の判断基準に合致する抗体を分泌するハイブリドー
マを得る。選別されたハイブリドーマは次いで，腹水と
して継代培養することからなる公知の技法により増殖さ
せることができる。

好ましい実施態様では，特異的に感作されたＢ細胞は次
のようにして調製する。ＳＬＥ患者から得た血清を，一
般的に子牛の胸腺のような外来源から得たＤＮＡと反応
させる。ＤＮＡと抗ＤＮＡ抗体からなる免疫複合体を生
成させることができる。この複合体を２例えば、イオン
交換クロマトグラフ法により単離し，そして、一般的に
，８Ｍの尿素で処理することによって解離させる。次い
で９例えば、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ法に
より抗ＤＮＡ抗体を回収する。精製されたヒトの抗生得
ＤＮＡ抗体を調製する別法は抗生得ＤＮＡ抗体を分泌す
る（ヒト×ヒト）ハイブリドーマをつくりだすことから
なる。このようなハイブリドーマをつくりだす好まし．
い々法は，その血清が抗ＤＮＡ抗体を多量に含有するＳ
ＬＥ患者がら得た末梢血液リンパ球を薬物で標識された
ヒトの骨髄腫細胞と融合させることからなる。融合後。

ハイブリドーマ上澄液を下記に述べるようなミリポアフ
ィルタ−検定法のような常用の検定法にょリスクリーニ
ングし，抗ＤＮＡ抗体を得ることができる。これらのい
ずれかの方法により産生された回収抗ＤＮＡ抗体をその
後，免疫原として使用し，免疫能を有する受容動物（通
常は，マウス）中でＢリンパ球を感作する。好ましいマ
ウスの系統はＢＡＬＢ／ｃである。免疫処理後，マウス
を殺し，肺細胞を回収し，適当な融合パートナ−と融合
させる。感作マウス牌細胞用の好ましい融合パートナ−
は非産生性耐チオグアニン骨髄腫株Ｘ６３Ａｇ８．６５
３である。これはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−しｉｏｎ　（米国，　Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ州，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）に寄託されてお
り，そのＡＴＣＣカタログ収載番号はＡＴＣＣ　ＣＲＬ
−１５８０である。リンパ球と融合パートナ−を融合さ
せてハイブリドーマを産生させた後、このハイブリドー
マ上澄液をスクリーニングして抗ＤＮＡ抗体と反応可能
な存在する抗体を得る。好ましいスクリーニング法はサ
ンドイッチ固相ラジオイムノアッセイ法である。この方
法は抗ＤＮＡ抗体が塗布された固相にハイブリドーマ上
澄液を接触させることからなる（対照として、正常なヒ
ト免疫グロブリンを使用する）。抗ＤＮＡ抗体上の抗原
決定基に結合可能な、ハイブリドーマ上澄液中の抗体は
全て同相に吸着される。最後に、ハイブリドーマにより
産生された抗体上の非イディオタイプ決定基に対して作
用する標識された抗体を固相と接触させ、そして、免疫
゛特異結合の程度を、酵素。

放射性同位元素２発色団、蛍光団等のような標識により
測定できる。イディオタイプ決定基に対して作用する抗
体を含有するバイブリド・−マ上澄液と、抗ＤＮＡ抗体
上のイソタイプおよびアロタイプ決定基に対して作用す
る抗体を含有するハイブリドーマ上澄液を区別するには
、抗ＤＮＡ抗体があらかじめ塗布された同相に免疫特異
的に吸着された標識の量を正常なヒト免疫グロブリン（
対照）があらかじめ塗布された固相に免疫特異的に吸着
された標識の量と比較する。抗ＤＮＡ抗体があらかじめ
塗布された同相に吸着された免疫特異性標識の量の方が
正常なヒト免疫グロブリンがあらかじめ塗布された固相
に吸着された量よりも高いハイブリドーマ上澄液は抗イ
デイオタイプ抗体を含有しているものと考えられる。ま
た、正常なヒト免疫グロブリンがあらかじめ塗布された
固相への標識の吸着量が抗ＤＮＡ抗体があらかじめ塗布
された固相への吸着量とほぼ等しいか、あるいは多い場
合の上澄液は抗イソタイプおよび／または抗アロタイプ
抗体を含有するものと考えられる。抗イデイオタイプ抗
体が共通イディオタイプと反応可能かどうか決定するに
は、少なくとも２個の遺伝的に同一でない個体から得た
抗ＤＮＡ抗体を用いて前記のスクリーニング処理をくり
かえせばよい。２個以上の抗ＤＮＡ抗体との反応性を示
すハイブリドーマ上澄液はヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の
共通イディオタイプと反応可能であると考えられる。従
って、これは本発明の範囲内のものである。

患者血清中のＤＮＡおよび抗生得ＤＮＡからなる循環免
疫複合体を検出できるので、本発明の最も好ましい抗体
はＤＮＡ結合領域外に位置するヒトの抗生得ＤＮＡ抗体
上の共通イディオタイプ決定基と反応可能な抗体である
。この最も好ましい抗体を分泌するハイブリドーマは抗
ＤＮＡ抗体と、抗イデイオタイプ活性物質をあらかじめ
スクリーングしたハイブリドーマ上澄液とを、大過剰量
の遊離ＤＮＡ存在下で１反応させることによって同定で
きる。上澄液中のモノクローナル抗体と抗ＤＮＡ抗体と
の結合が阻害されない場合、このモノクローナル抗体は
ＤＮＡ結合部位でない位置にある抗ＤＮＡ抗体上のイデ
ィオタイプ決定基に対して作用することもできる。推定
上のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体がＤＮＡそれ
自体に結合していないことをさらに実証するために、共
沈降検定法を実施できる。この検定法では、放射性同位
元素一般に　１２！ｉ■で標識されたＤＮＡを抗ＤＮＡ
抗体または負対照とともインキュベーションする。ここ
で使用される好まし−い等ＤＮＡ抗体は高力価の抗ＤＮ
Ａ活性を示すＳＬＥ患者から得られるものであり、また
、好ましい負対照は非ＳＬＥ対照患者から得られるもの
である。放射性同位元素で本標識したｔ−ＤＮＡおよび
抗生得ＤＮＡ抗体の量は沈殿生成をおこさないように選
定される。

抗イデイオタイプ活性物質をあらかじめスクリーニング
した次の上澄液または対照を添加する。好し ま虻くは、抗イデイオタイプ抗体と同じイソタイプであ
るが、ヒト免疫グロブリンとは非反応性であるモノクロ
ーナル抗体を分泌するマウスの骨髄腫細胞の株から得ら
れる上澄液を添加する。最後に、モノクローナル抗イデ
イオタイプ抗体と抗体対照の両方と反応可能な異種抗血
清を、免疫沈殿を生成させることのできる量だけ添加す
る。沈殿物を洗浄し、そして、放射能の量を測定する。

もし推定上のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体と抗
ＤＮＡ抗体を含有する沈殿の放射能量が対照の放射能量
よりも高い場合、モノクローナル抗体はＤＮＡに直接的
に結合していないと結論を下すことができる。

ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと反応
可能なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを
同定し、そして選別した後２選別されたハイブリドーマ
をクローニングすることができる。好ましいクローニン
グ方法は、ラットの胚線維芽細胞の供給細胞層上のアガ
ロース上に選別ハイブリドーマ細胞を沈着させ、該細胞
を生長させて、ひと固まりの培養物を得、抗イデイオタ
イプ活性について再試験し、そして、最後に、受容動物
の腹膜内に注射し、そして、穿刺して腹水を採取するこ
とからなる。好ましい動物はブリスタン（ｐｒｉｓｔａ
ｎｅ）を投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスである。

多量の抗ＤＮＡ抗体を分泌するＳＬＥ患者は患者自身の
抗ＤＮＡ抗体に対して作用する自己抗体も同様に産生じ
ているものと想像される。このような自己抗体は、ＳＬ
Ｅ患者の血清中の楯環抗ＤＮＡ抗体のレベルを低下させ
るであろうと思われる。血清学的に寛解（軽快）傾向に
ある（即ち。

循環抗生得ＤＮＡ抗体のレベルが低い）ＳＬＥ患者から
得た末梢血液リンパ球・を薬物で標識されたヒトの骨髄
腫細胞と直接に融合させることによって、ヒトの杭生得
ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと反応可能なヒトの
モノクローナル抗体を産生させることができるであろう
。このようにして産生されたバイブリド−、マの上澄液
を次のようなスクリーニング法によってスクリーニング
してヒトのモノクローナル抗イデイオタイプ抗体を得る
。

同相（一般的には微量滴定板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　
ｐｌａｔｅのくぼみ）にヒトに抗ＤＮＡ抗体の精製Ｆａ
ｂ断片を塗布する。正常なヒトの免疫グロブリン精製Ｆ
ａｂ断片が塗布された固相を対照として使用する。ハイ
ブリドーマ上澄液を該同相と接触させ、そして。

吸着されなかった上澄液を洗い流す。最後に、この固相
を、ヒトの免疫グロブリンのＦｃ断片に対して特異的な
標識された異種抗体と接触させる。対照に比べて、ヒト
の抗ＤＮＡ抗体のＦａｂ断片が塗布された同相への標識
の結合量が高い場合、モノイディオタイプと反応可能か
どうが決定するために少なくとも２個の遺伝的に同一で
ない個体がら得られた抗ＤＮＡ抗体を使用して前記スク
リーニング法をくりかえし実施する。少なくとも２個の
抗ＤＮＡ抗体との反応性を示すハイブリドーマ上澄液は
ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと反応
可能であると考えられる。従って。

このハイブリドーマ上澄液は本発明の範囲内に含まれる
。

本発明の抗体は当業界で周知の様々な方法により、生物
液体中の抗ＤＮＡ抗体の存在を検出するのに使用できる
。これらの全ての方法において。

本発明のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体は抗生得
ＤＮＡ抗体を含有しているであろうと思われる検体と接
触させられ、そして、結合量が測定される。適当な方法
は例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ放射能標識免
疫検定法、固相または液相）、酵素結合免疫検出法（Ｅ
ＬＩＳＡ）、酵素、および放射性同位元素以外の標識を
使用する不均質免疫検定法（競合性および非゛競合性の
両方）、蛍光消光および酵素チャネリング鼾こ基づく均
質免疫検定法、免疫沈降法（放射状免疫拡散法を含む）
。

および肉眼による半定量検出または定量的濁度測定によ
る検出に基づく凝集検定法などである。好ましい実施態
様では、モノクローナル抗イデイオタイプ抗体を液相Ｒ
ＩＡで使用する。即ち、標識されたモノクローナル抗イ
デイオタイプ抗体を検体と反応させ、かくして、免疫複
合体を産生させる。この標識とし２てはｌａｉ　■のよ
うな放射性同位元素または西洋ワサビペルオキシダーゼ
、α−ガラクトシ、ダーゼまたはアルカリ性ホスファタ
ーゼのような酵素を使用できる適当な反応時間が経過し
た後、免疫複合体を沈殿させることのできる薬剤を添加
する。好ましい沈殿化剤は杭生得ＤＮＡ抗体と反応性の
異種抗体である。沈殿物中の標識の量を測定し、そして
、正および負対照と比較する。

次のような必要試薬を含むキットを構成させることがで
きる。

（１）抗生得ＤＮＡ抗体の正および負対照；（１１）標
識されたモノクローナル抗イデイオタイプ抗体； （ｉｉｉ　）杭生得ＤＮＡ抗体とモノクローナル抗イデ
イオタイプ抗体からなる免疫複合体を沈殿させることの
できる薬剤；および （ｉｖ）キットの使用説明書。

別の好ましい実施態様では、ポリスチレン製試軟管の内
壁または微量滴定板のくぼみのような固相に試験検体を
塗布する。吸着されなかった検体を洗い流した後、該同
相を本発明のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体と接
触させる。適当なインキュページ巨ン時間の経過後、未
反応モノクローナル抗体を洗い流す。°最後に、固相を
、酵素または放射性同位元素で標識された異種抗体（こ
の後、未反応の標識つき抗体を洗い流し、そして。

免疫特異的に吸着された標識の量を測定する。このモノ
クローナル抗体がマウスに由来するものである場合、好
ましい放射性同位元素標識つき異種抗体はａｔｔＳ−メ
チオニンで標識されたラットの抗マウスＬ鎖抗体である
。

実施例 抗ＤＮＡ抗体を含有するＳＬＥ患者（Ａ、！ｔ１．）か
ら得た血清１０ｍ１を０　、５ｍｇ／−の濃度で子牛胸
腺ＤＮＡ（タイプ１．ミズーリ州、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ
ｓのＳｉｇｍａＣｈｅ＋ｎ１ｃａ１社製）を含有するｐ
Ｈ６，６の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＱ
と混合した。この混合液を室温で１時間インキュベート
し、続いて、４℃で１６時間インキュベートし、ＤＮＡ
／抗ＤＮＡ抗体からなる複合体を生成させ９次いで、　
０．ＩＭＮａＣｌを含有する０、０１Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，６）で平衡にされたＤｉ−ｓ２カラムにュ
ージャージー州。

Ｃ１１ｆｔｏｎのＷｈａｔ、ｍａｎ社製）　３００ｍＱ
に入れた。この複合体を０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶離し、
８Ｍ尿素で解離させ。

そして、　ＤＨ−５２カラムで再度クロマトグラフし、
生得ＤＮＡを含有しないＩｇＧ系のヒト抗ＤＮＡ抗体の
強化標本を得た。

完全フロインドアジュバント中に乳化させた強化抗ＤＮ
Ａ抗体である免疫原１００μｇを腹腔内に注射すること
によって５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置した。該
マウスにアジュバントを伴わない免疫原を６〜１０週間
にわたり、毎週投与免疫強化を行なった。固相ラジオイ
ムノアッセイ（下記に詳記）により、５匹のマウスのう
ち３匹について、免疫原に対する多量の抗体産生が確認
された。これら３匹の免疫化マウスから得た肺細胞を耐
チオグアニン性で非免疫グロブリン分泌性のマウス骨髄
腫細胞（系統Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合させ、そし
て、９６個のくぼみを有する微量滴定板中に塗布した。

生存しうるハイブリドーマを含有するこれらの培養物か
ら得られた上澄液をスクリーニングし、固相ラジオイム
ノアッセイを゛使用し、精製免疫原と反応性の、クロー
ン産生抗体を検出した。各培養物の上澄液の検体をＳＬ
、Ｅ患者から得た精製抗ＤＮＡ抗体または精製された正
常なヒトの免疫グロブリンのいずれかが、−晩インキユ
ベーションすることによって、あらかじめ塗布されてい
るＩｍｍｕｌｏｎ−ＩＩ（ヴアージニア州のＡｌｅｘａ
ｎｄｒｉａにあるＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｓ、社製）微
量滴定板のくぼみの中で、インキュベートした。塗布さ
れた滴定板を十分に洗浄した後、結合したマウスの免疫
グロブ−リンを、３５Ｓ−メチオニンで標識されたラッ
トの抗マウスカッパＬ鎖抗体を添加することによって検
出した。正常なヒトの免疫グロブリン塗布滴定板に比べ
て抗ＤＮＡ塗布滴定板への放射性同位元素標識の示差的
結合することは、特定のハイブリドーマの培養物上澄液
中における抗ＤＮＡ抗体に対して特異な推定される抗イ
デイオタイプ抗体の存在を証明するものと考えられた。

このような５種類のハイブリドーマは次の表に示される
ようなものとして同定された。

ハイプリドーマ産生抗−イデイオタイプのμ正対照　　
※　　　　　　１５，２２６　　　　　　８．５５４１
８．１９５　　　　　１１．４０２ 対照　※※　　　１３５　　　１２０ １１２　　　　　　　１０９ ハイブリドーマ ３　Ｉ　　　　　　　　　　　　２．１０７　　　　　
　　　１５７１．８８５　　　　　　　　１３５ ９　Ｆ　　　　　　　　　　　　２．２５５　　　　　
　　　１５４１．９４２　　　　　　　　１１４ １７Ａ　　　、　　　　　　　　　３０６　　　　　　
　　１３１３３２　　　　　　　　２１１ ３８　　　　　　　　　　、　　　２２３　　　　　　
　　１２４１９２　　　　　　　　１０２ ９Ｅ　　　　　　　　　　　　　１５２　　　、　　　
　　　１００１６０　　　　　　　　９９ （注） ＊　　１対１００の希釈率で免疫されたマウスから得た
血清××　無関係なハイブリドーマ系統から得た上澄液
強化ＡＷ抗生得ＤＮＡ抗体または対照血清のいずれかを
ポリエチレン製゛のくぼみに吸着させた。

マウス血清またはハイブリドーマ上澄液を添加し。

続いて、放射性同位元素で標識されたラットの抗マウス
Ｌ鎖を添加した。表中には二つの値が示されている。

これらのハイブリドーマから得た細胞をラットの胚線維
芽細胞の供給細胞層上のアガロース中でさらにクローニ
ングした。クローンを集め、生長させて−かたまりの培
養物を得、そして、抗イデイオタイプ活性について再び
試験した。ブリスタン投与ＢＡＬ　Ｂ／ｃマウスの腹腔
内にｌＸｌ０’個のハイブリドーマ細胞を注射した。そ
して、ｌＯ〜１４日間経過した後、腹水液を回収した。

これらのクローンのうちのいずれか１つによって産生さ
れたモノクローナル抗体（以下「３工」と呼ぶ）はさら
に次のような特徴を有していた。

オフテロニー法分析によれば、３Ｉはカッ、（Ｌ鎖を有
するマウスＩｇＧ　、免疫グロブリンであることが示さ
れた。抗ＤＮＡ抗体に対する３Ｈの活性は５倍過剰量の
正常ヒト血清により阻害されなかった。さらに、３Ｉの
抗ＤＮＡ抗体への結合は大過剰量の遊離ＤＮＡを添加し
ても妨げられなかった。

常用のミリポアフィルタ−検定法で測定したところ、３
Ｉは抗ＤＮＡ抗体を含有していなかった。

（１２５Ｉで標識されたＤＮＡは、抗ＤＮＡ抗体を含有
すると思われる血清希釈液と反応する。免疫複合体を０
．４５μｍフィルターで捕集し１次いで、放射能を計数
する。）さらに、ウサギの抗マウス抗体と結合させた場
合、３Ｈ抗体は、患者の血清から得た抗ＤＮＡ抗体と共
に放射性同位元素標識化ＤＮＡを予備インキュベーショ
ンしたときに限って、該放射性同位元素標識化ＤＮＡを
沈殿させることができた。最後に、３Ｉは抗ＤＮＡ抗体
のＦａｂ断片に結合することが確認された。

これらのデータから、３Ｈ抗体は抗イデイオタイプであ
り、また、患者ＡＷから得た抗ＤＮＡ抗体の種について
存在するイディオタイプに特異的であると結論を下した
。さらに、３Ｈ抗体は抗ＤＮＡ抗体の抗原結合部位に対
して作用しない。なぜなら、抗ＤＮＡ抗体への結合は過
剰量のＤＮＡを添加しても妨げられな°いし、さらに、
３Ｈ抗体はＤＮＡ／抗ＤＮＡ抗体複合体へ結合するから
である。

現にＳＬＥに罹患している患者から得た血清および正常
な健康供血者から得た血清を固相ラジオイムノアッセイ
により試験し、３Ｉとの反応性を測定した。この検定法
では、リン酸塩で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）で１０倍
に希釈された血清をＩｍｍｕｌｏｎ　−ｕ微量滴定板の
くぼみの中で４℃で一晩インキユベーションした。この
滴定板をＰＢＳで３回洗浄し２次いで、５シ／Ｖ％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳと共に１時
間インキュベーションした。培養物上澄液または３■を
含有する腹水の５０倍希釈液を各穴に添加した。

室温で９０分間インキュベーションした後、０．５％Ｔ
ｗｅｅｎ　２０（非イオン界面活性剤）　、　０．１５
Ｍ　ＮａＣ１および２％ＢＳＡを含有する洗浄液（ｐＨ
８，３）で滴定板を洗浄した。３５３−メチオニンで標
識されたラットのモノクローナル抗マウスカッパＬ鎖抗
体（クローン１８７．１　、　ＡＴＣＣ−）ＩＢ５８）
を添加し、そして。

この滴定板を室温で９０分間さらにインキユベーシミン
した。前記洗浄液で十分に洗浄した後、シンチレーショ
ンカウンターで各くぼみ中の結合の程度を測定した。

抗ＤＮＡ抗体を多量に有することがあらかじめわかって
いた。現にＳＬＥに罹患している患者の９人のうち８人
までが３■との有意な反応性を示した。さらに、抗ＤＮ
Ａ抗体に関するミリポアフィルタ−検定法では有意な反
応性を示さなかった現にＳＬＥに罹患している患者９人
のうち４人までが３１と反応した。これらのＳＬＥ患者
から得応した。これに対して、１０人の正常な供血者で
その血清が３■と有意な反応性を示したものは皆無であ
った。

現に病気が進行中の患者および臨床的に寛解傾向にある
患者１３人から血清検体を得た。全ての患者から得た寛
解血清はミリポアフィルタ−検定法では抗生得ＤＮＡ抗
体を喪失していることが示された。これらの寛解血清の
うち６個は、同時に。

固相ラジオイムノアッセイにおいて、３Ｉとの反応性を
喪失していることが示された。しかし、残りの７個の寛
解血清は３■との反応性がほとんどあるいは全く変化し
ていなかった。これら７個の血清と３１との継続的反応
性は、抗生得ＤＮＡ抗体は存在するが、ミリポアフィル
タ−検定法ではＤＮＡとの反応が阻止されたことを示唆
している。

従って、３Ｉを試薬として使用する。血清検体中の抗生
得ＤＮＡの検出方法は従来技術の抗生得ＤＮＡの検定法
よりも高い診断学的有用性および予後有用性を有する。

３Ｉを分泌するハイブリドーマはブダペスト条約の規定
に従い、　Ｍａｒｙｌａｎｄ州のＲｏｃｋｖｉｌｌｅに
あるＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１−１ｅｃｔｉｏｎに寄託されており、また、そのカ
タログ収載番号はＡＴＣＣＨＢ　８３７６である。

特許出願人　イエシバ・ユニヴアーシティー代理人　弁
理士　　松　井　政　広（外１名）第１頁の続き 優先権主張　＠１９８３年１１月１６日［相］米国（Ｕ
Ｓ）■５５２２９０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒトの抗生骨ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプ
   と反応可能なモノクローナル抗体。 ２、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体で
   あって、抗生後ＤＮＡ抗体のＤＮＡ結合部位でないとこ
   ろに位置するヒトの抗生後ＤＮＡ上のイディオタイプと
   反応可能であるモノクローナル抗体。 ３、　特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
   であって、マウスに由来するものであるモノクローナル
   抗体。 ４、　特許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体
   であって、　１ｍｅｒｉ、ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
   ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−七ｊ、ｏｎに寄託され、　ＡＴ
   ＣＣＨＢ　８３７６号のカタログ番号がつけられている
   ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体。 ５、特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体で
   あって。 （ｉ）抗生後ＤＮＡ抗体に対して特異的に感作されたリ
   ンパ球を得る工程； （１１）このリンパ球を融合パートナ−と融合させてハ
   イブリドーマを生成する工程； （ｉｉｉ　）ヒトの抗生骨ＤＮＡ抗体上の峰イディオタ
   イプ決定基と反応可能な抗体を分泌するハイブリドーマ
   を、少なくとも二つの遺伝的に同一でない個体から選択
   する工程； （１ｖ）選択されたハイブリドーマを所望によりクロー
   ニングする工程；および （ｖ）ヒトの抗生後ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプ
   と反応可能なモノクローナル抗体を回収する工程； からなる工程により製造されるモノクローナル抗体。 ６、特許請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体で
   あって、前記工程（１）が動物をヒトの抗ＤＮＡ抗体で
   免疫し、そして、該動物から肺細胞を単離することから
   なるモノクローナル抗体。 ７．　特許請求の範囲第６項記載のモノクローナル抗体
   であって、該動物がマウスであるモノクローナル抗体。 ８、特許請求の範囲第６項記載のモノクローナル抗体で
   あって、該ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体が、ＤＮＡとヒトの
   抗ＤＮＡ抗体からなる免疫複合体を解離させることによ
   って得られるモノクローナル抗体。 ９、　特許請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体
   であって、ヒトの抗ＤＮＡ抗体が全身性紅斑性狼疹の患
   者から得られるモノクローナル抗体。 １０、特許請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体
   であって、融合パートナ−が骨髄腫細胞であるモノクロ
   ーナル抗体。 １１、特許請求の範囲第１０項記載のモノクローナル抗
   体であって、該骨髄腫細胞がＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
   ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されて
   おり、　ＣＲＬ−１５８０の番号でカタログに収載され
   ている。　Ｘ６３Ａｇ８．６５３であるモノクローナル
   抗体。 １２、液状検体中に存在すると思われるヒトの抗生得Ｄ
   ＮＡ抗体の検出方法であって。 ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと結合
   可能なモノクローナルな抗イデイオタイプ抗体と液状検
   体を接触させることからなる検出方法。 １３、特許請求の範囲第１２項記載の検出方法であって
   。 （１）ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプ
   と結合可能な、標識づけしたモノクローナルな抗イデイ
   オタイプ抗体と前記検体を接触させることによって反応
   混合物を調製し。 （１１）免疫化学反応をおこさせて、標識づけした抗体
   の一部に抗生得ＤＮＡ抗体との免疫複合体を形成させ、
   そして、別の部分は遊離状態にしておき； （ｉｉｉ　）遊離状態の標識づけ抗体と免疫複合体とを
   分離し； （１ｖ）部分のうちの１つのなかの標識を測定し。 そして。 （Ｖ）測定された標識の量を検体中にはじめから存在し
   ていたヒトの杭生得ＤＮＡの量と関連づける； ことからなる方法。 １４、特許請求の範囲第１３項記載の方法であって。 前記分離工程（ｉｉｉ　）が免疫複合体を沈殿させるこ
   とのできる薬剤を前記反応混合物に添加することからな
   る方法。 １５、特許請求の範囲第１４項記載の方法であって。 該沈殿化剤は前記抗生得ＤＮＡ抗体と反応可能な異種抗
   体である方法。 １６、特許請求の範囲第１３項記載の方法であって。 標識が放射性同位元素、酵素２発色団または蛍光団であ
   る方法。 １７、特許請求の範囲第１６項記載の方法であって。 該放射性同位元素が１２５　■である方法。 １Ｂ、特許請求の範囲第１６項記載の方法であって。 該酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ、α−ガラクトシ
   ダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼである方法。 １９、特許請求の範囲第１２項記載の方法であって。 （１）検体を固相と接触させ、かくして、杭生得ＤＮＡ
   抗体を該同相に吸着させ； （ｊｌ）抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと反
   応可能なモノクローナルな抗イデイオタイプ抗体と前記
   固相を接触させ、かくして、該同相上に免疫複合体を形
   成させ； （ｉｉｉ）該固相を、該免疫複合体のモノクローナル抗
   体と反応可能な標識づけ抗体と接触させ；（１ｖ）該同
   相に吸着された標識の量を測定し；そして。 （Ｖ）該検体中にはじめに存在していた杭生得ＤＮＡの
   量に標識の量を関連づけることからなる方法。 ２、特許請求の範囲第１９項記載の方法であって。 該固相が微量滴定板のくぼみである方法。 ２、特許請求の範囲第１９項記載の方法であって。 該標識−づけ抗体はラットの標識づけされた抗−（マウ
   スＬ鎖）抗体である方法。 ２、特許請求の範囲第２１項記載の方法であって。 該標識は放射性同位元素、酵素２発色団または蛍光団で
   ある方法。 ２、特許請求の範囲第２２項記載の方法であって。 該標識は３５Ｓである方法。 ２、特許請求の範囲第２２項記載の方法であって。 該酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ、α−ガラクトシ
   ダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼである方法。 ２５、（ｉ）抗生得ＤＮＡ抗体正および負対照；（ｉｉ
   　）ヒトの抗生得ＤＮＡ抗体上の共通イディオタイプと
   反応可能な、標識されたモノクローナル抗イデイオタイ
   プ抗体； （ｉｉｉ　）抗生得ＤＮＡ抗体およびモノクローナル抗
   イデイオタイプ抗体からなる免疫複合体を沈殿させるこ
   とのできる薬剤；および （ｉｖ　）キットの使用説明書； からなる、液状検体中に存在すると思われるヒトの抗生
   得ＤＮＡ抗体の量を測定するためのキット。 ２、特許請求の範囲第２５項記載のキットであって、該
   標識が放射性同位元素、酵素２発色団または蛍光団であ
   るキット。 ２、特許請求の範囲第２６項記載のキットであって、該
   放射性同位元素が１２５１であるキット。 ２、特許請求の範囲第２６項記載のキットであって、該
   酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ、α−ガラクトシダ
   ーゼまたはアルカリ性ホスファターゼであるキット。 ２、特許請求の範囲第２５項記載のキットであって、該
   薬剤はヒト生得ＤＮＡ抗体と反応可能な異種抗体である
   キット。 ３０、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
   　Ｃｏ１１ｅｃｔ＋ｉｏｎ　　に寄託され、そして、　
   ＡＴＣＣＨ８８３７６号の番号でカタログに収載されて
   いるハイブリドーマまたはその突然変異体。