JPS63221248A - 癌抗体の測定法 - Google Patents
癌抗体の測定法Info
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- JPS63221248A JPS63221248A JP5492187A JP5492187A JPS63221248A JP S63221248 A JPS63221248 A JP S63221248A JP 5492187 A JP5492187 A JP 5492187A JP 5492187 A JP5492187 A JP 5492187A JP S63221248 A JPS63221248 A JP S63221248A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野）
本発明は癌抗体の測定法、更に詳細には、血清又は体液
中の癌抗体を測定して癌の存在を診断することのできる
免疫学的測定法に関する。
中の癌抗体を測定して癌の存在を診断することのできる
免疫学的測定法に関する。
癌の存在を早期に適確に知ることは、その治療のために
極めて重要である。そして、近年、癌細胞抗原を測定し
て癌を診断する方法が案出されたが、当該抗原を正確に
測定する方法がなく、これが癌の診断を困難にしていた
。特に上咽頭癌については、適確な診断法がなかった。
極めて重要である。そして、近年、癌細胞抗原を測定し
て癌を診断する方法が案出されたが、当該抗原を正確に
測定する方法がなく、これが癌の診断を困難にしていた
。特に上咽頭癌については、適確な診断法がなかった。
斯かる実状において、本発明者は上記欠点を克服せんと
鋭意研究を行った結果、モノクローナル抗イディオタイ
プ抗体を使用して血清又は体液中の癌抗体を測定すれば
、癌の存在を、早期にかつ正確に診断できることを見出
し、本発明を完成した。
鋭意研究を行った結果、モノクローナル抗イディオタイ
プ抗体を使用して血清又は体液中の癌抗体を測定すれば
、癌の存在を、早期にかつ正確に診断できることを見出
し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、血清又は体液を、癌細胞抗原に特
異性を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体と接
触させ、当該モノクローナル抗イディオタイプ抗体に結
合した抗体量を測定することを特徴とする癌抗体の測定
法を提供するものである。
異性を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体と接
触させ、当該モノクローナル抗イディオタイプ抗体に結
合した抗体量を測定することを特徴とする癌抗体の測定
法を提供するものである。
本発明で使用するモノクローナル抗イディオタイプ抗体
は、癌細胞抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体
で免疫したマウスの牌細胞と骨髄腫細胞を融合させてハ
イブリドーマを作製し、該モノクローナル抗体に特異的
に反応するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生
するハイブリドーマを選択、クローニングし、これを無
血清培地中で培養するか又は動物に投与して腹水化し、
培地又は腹水を採取することにより製造される。
は、癌細胞抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体
で免疫したマウスの牌細胞と骨髄腫細胞を融合させてハ
イブリドーマを作製し、該モノクローナル抗体に特異的
に反応するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生
するハイブリドーマを選択、クローニングし、これを無
血清培地中で培養するか又は動物に投与して腹水化し、
培地又は腹水を採取することにより製造される。
特に、上咽頭癌由来の細胞株Ｎ Ｐ Ｃ−２０４の膜表
面抗原に特異的に反応するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体は、矢野間らによフて報告された５−９株をク
ローニングして得たハイブリドーマ７６ＡＣ６−８９株
（第４２回日本癌学会総会）を無血清培地中で培養して
得られる抗ＮＰＣ−２０４モノクローナル抗体から次の
如くして製造される。
面抗原に特異的に反応するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体は、矢野間らによフて報告された５−９株をク
ローニングして得たハイブリドーマ７６ＡＣ６−８９株
（第４２回日本癌学会総会）を無血清培地中で培養して
得られる抗ＮＰＣ−２０４モノクローナル抗体から次の
如くして製造される。
抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４モノクロ一ナル抗体によりＢ Ａ
Ｌ Ｂ ／ ｃマウスを免疫し、抗体価が充分高まっ
たところで免疫マウスの牌臓を摘出して得た牌細胞とマ
ウスの骨髄腫細胞Ｎ５−１又はＰ ３ｕ−１と融合させ
てハイブリドーマを作製する。このハイブリドーマを無
血清培地中で培養しＮ Ｐ Ｃ−２０４株の膜表面抗原
に対する抗イディオタイプ抗体、即ちモノクローナル抗
Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体を産生するハイ
ブリドーマをアルカリフォスファターゼ標識したモノク
ローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を用いる酵素免疫測
定法（Ｅ Ｉ Ａ法）により選択する。効率良く高い力
価のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生ずるバ
イプリドーマを限界希釈法により無血清培地を用いてク
ローニングし、モノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イ
ディオタイプ抗体を産生ずる安定株ＩＶＮ−８３、ＩＶ
Ｐ−４１、Ｉ ＶＮ−４を得た。
Ｌ Ｂ ／ ｃマウスを免疫し、抗体価が充分高まっ
たところで免疫マウスの牌臓を摘出して得た牌細胞とマ
ウスの骨髄腫細胞Ｎ５−１又はＰ ３ｕ−１と融合させ
てハイブリドーマを作製する。このハイブリドーマを無
血清培地中で培養しＮ Ｐ Ｃ−２０４株の膜表面抗原
に対する抗イディオタイプ抗体、即ちモノクローナル抗
Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体を産生するハイ
ブリドーマをアルカリフォスファターゼ標識したモノク
ローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を用いる酵素免疫測
定法（Ｅ Ｉ Ａ法）により選択する。効率良く高い力
価のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生ずるバ
イプリドーマを限界希釈法により無血清培地を用いてク
ローニングし、モノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イ
ディオタイプ抗体を産生ずる安定株ＩＶＮ−８３、ＩＶ
Ｐ−４１、Ｉ ＶＮ−４を得た。
これ等の安定株を無血清培地中に培養するか、動物に投
与して腹水化し、培養物又は腹水を採取すればクラスＩ
ｇＧ型か又はＩｇＭ型のモノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−
２０４イディオタイプ抗体が得られる。
与して腹水化し、培養物又は腹水を採取すればクラスＩ
ｇＧ型か又はＩｇＭ型のモノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−
２０４イディオタイプ抗体が得られる。
斯くして得られるモノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イデ
ィオタイプ抗体は次の如き性状及び生物学的性質を有す
る。
ィオタイプ抗体は次の如き性状及び生物学的性質を有す
る。
（１）物理化学的性状
表１
以下余白
（２）安定性
表２
本発明の血清又は体液中の癌抗体を測定するには、血清
又は体液にモノクローナル抗イディオタイプ抗体を接触
させて、該抗イディオタイプ抗体と癌抗体を免疫反応さ
せることにより行われる。この免疫反応は、従来公知の
ＥＩＡ法、ＲｒＡ法、ラテックス比濁法又はリポソーム
、蛍光標識物質を用いる方法、あるいはマウス、ラット
、モルモット、ウサギ等の動物を介する免疫応答反応（
ＰＣＡ、ＤＴＨ反応等）を利用する方法等によフて行う
ことができる。
又は体液にモノクローナル抗イディオタイプ抗体を接触
させて、該抗イディオタイプ抗体と癌抗体を免疫反応さ
せることにより行われる。この免疫反応は、従来公知の
ＥＩＡ法、ＲｒＡ法、ラテックス比濁法又はリポソーム
、蛍光標識物質を用いる方法、あるいはマウス、ラット
、モルモット、ウサギ等の動物を介する免疫応答反応（
ＰＣＡ、ＤＴＨ反応等）を利用する方法等によフて行う
ことができる。
叙上の如き本発明方法によれば、血清又は体液中の癌抗
体を正確に測定することができ、癌の存在を早期にかつ
適確に診断することができる。
体を正確に測定することができ、癌の存在を早期にかつ
適確に診断することができる。
次に、参考例及び実施例を挙げて説明する。
参考例１
（１）モノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２（１４イディオ
タイプ抗体産生細胞株の作製： Ｎ Ｐ Ｃ−２０４株の膜表面抗原に対するモノクロー
ナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を産生ずるバイプリドー
マ７６ＡＣ６−８９株を無血清培地Ｓ Ｆ Ｍ−１０１
（日水製薬株式会社製）中で培養し、培養上清中より得
た抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を５６℃、３０分温浴中で
反応させたのちコンプリート・フロイント・アジバント
中に混和してＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ ♀マクス６〜
８週令に１００μｇ皮下注射した。初回注射の２週間後
に抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体をインコンプリート・フロ
イント・アジバント中に混和して１００μｇ皮下注射し
た。更に２週間経過後、抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体をＰ
ＢＳ中に溶解して１００μｇマウスの腹腔内に注射し、
３日後に牌臓を摘出して単核牌細胞とした後、８−アザ
グアニン耐性Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマウス骨髄細胞株
ＭＳ−１又はＰ ３ｕ−１と５０％ＰＥＧ（シグマ社製
、分子量４．００（＋１により融合させた。
タイプ抗体産生細胞株の作製： Ｎ Ｐ Ｃ−２０４株の膜表面抗原に対するモノクロー
ナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を産生ずるバイプリドー
マ７６ＡＣ６−８９株を無血清培地Ｓ Ｆ Ｍ−１０１
（日水製薬株式会社製）中で培養し、培養上清中より得
た抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体を５６℃、３０分温浴中で
反応させたのちコンプリート・フロイント・アジバント
中に混和してＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ ♀マクス６〜
８週令に１００μｇ皮下注射した。初回注射の２週間後
に抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体をインコンプリート・フロ
イント・アジバント中に混和して１００μｇ皮下注射し
た。更に２週間経過後、抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４抗体をＰ
ＢＳ中に溶解して１００μｇマウスの腹腔内に注射し、
３日後に牌臓を摘出して単核牌細胞とした後、８−アザ
グアニン耐性Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマウス骨髄細胞株
ＭＳ−１又はＰ ３ｕ−１と５０％ＰＥＧ（シグマ社製
、分子量４．００（＋１により融合させた。
融合細胞の選択は無血清培地ＳＦＭ−１０１により行な
った。融合細胞の培養上清についてＥＩＡ法により抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４抗体との結合性を調べ、反応性の高い
ものについて限界希釈法によりクローニングを実施し、
モノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗
体産生株ＩＶＮ−６３、ＩＶＰ−４１、Ｉ ＶＮ−４を
得た。
った。融合細胞の培養上清についてＥＩＡ法により抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４抗体との結合性を調べ、反応性の高い
ものについて限界希釈法によりクローニングを実施し、
モノクローナル抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗
体産生株ＩＶＮ−６３、ＩＶＰ−４１、Ｉ ＶＮ−４を
得た。
（２）抗Ｎ Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体の製造
：（１）で得られたモノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イ
ディオタイプ抗体産生株を無血清培地中で培養し、培養
液をｔ、ｓｏｏｒｐｍで１５分間遠心分離したのち、上
清を更に１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し上清
を得た。この上清を限外ろ過膜Ａｍ１ｃｏｎ Ｄｉａｆ
ｌｏ ＹＭＩＯを用いて１／１０〜１／２０容量まで濃
縮したのち、等容量の飽和硫安を加えて蛋白分画を沈殿
させた。冷所に！後置いたのち１０．（ｌｏＯｒｐａ＋
、 １５分間遠心分離し、得られた沈殿物をＰＢＳ
に溶解した後、０．９９ｇＮａＣｆ液で４８時間透析し
て、それぞれ３種のモノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イ
ディオタイプ抗体を得た。
：（１）で得られたモノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イ
ディオタイプ抗体産生株を無血清培地中で培養し、培養
液をｔ、ｓｏｏｒｐｍで１５分間遠心分離したのち、上
清を更に１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し上清
を得た。この上清を限外ろ過膜Ａｍ１ｃｏｎ Ｄｉａｆ
ｌｏ ＹＭＩＯを用いて１／１０〜１／２０容量まで濃
縮したのち、等容量の飽和硫安を加えて蛋白分画を沈殿
させた。冷所に！後置いたのち１０．（ｌｏＯｒｐａ＋
、 １５分間遠心分離し、得られた沈殿物をＰＢＳ
に溶解した後、０．９９ｇＮａＣｆ液で４８時間透析し
て、それぞれ３種のモノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イ
ディオタイプ抗体を得た。
実施例１（ＥＩＡ・二抗体法）
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解したモノクローナル抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体（ＩＶＮ−６３抗
イディオタイプ抗体）（×１．０００ン１００μｍをＥ
ＩＡ用９用穴６六マイクロプレートり、４℃、２４時間
反応させ、精製水で洗浄後、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ
（−）によりブロッキングを行い、モノクローナル抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体感作プレート（以
下感作プレートと略称）を作製した。続いて、この感作
プレートに血清サンプルを加え、２時間反応後、洗浄し
、血清サンプル中のＮ Ｐ Ｃ−２０４膜抗体存在の有
無をアルカリフォスファターゼ標識した抗ヒトイムノグ
ロブリンにより調べた。その結果、第１図に示した様に
正常人および他癌患者血清に比し、上咽頭癌患者血清で
は明らかな高値を示した。
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体（ＩＶＮ−６３抗
イディオタイプ抗体）（×１．０００ン１００μｍをＥ
ＩＡ用９用穴６六マイクロプレートり、４℃、２４時間
反応させ、精製水で洗浄後、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ
（−）によりブロッキングを行い、モノクローナル抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体感作プレート（以
下感作プレートと略称）を作製した。続いて、この感作
プレートに血清サンプルを加え、２時間反応後、洗浄し
、血清サンプル中のＮ Ｐ Ｃ−２０４膜抗体存在の有
無をアルカリフォスファターゼ標識した抗ヒトイムノグ
ロブリンにより調べた。その結果、第１図に示した様に
正常人および他癌患者血清に比し、上咽頭癌患者血清で
は明らかな高値を示した。
実施例２ （ＰＣＡ反応法）
上咽頭癌患者及び正常人の血清０．１ｍＪＺをモルモッ
ト背部皮内に注射し、１時間後に、モノクローナル抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体（ＩＶＮ−６３抗
イディオタイプ抗体）１０μｇ及び１％エバンスブルー
１ ａｔｌｌを静脈内注射した。その１０分後に、患
者血清注射部位の色素を浸潤の大きさを測定した。その
結果は表３のとおりであり、患者血清の色素浸潤の大き
さは正常人血清のそれに比較して明らかに大きかった。
ト背部皮内に注射し、１時間後に、モノクローナル抗Ｎ
Ｐ Ｃ−２０４イディオタイプ抗体（ＩＶＮ−６３抗
イディオタイプ抗体）１０μｇ及び１％エバンスブルー
１ ａｔｌｌを静脈内注射した。その１０分後に、患
者血清注射部位の色素を浸潤の大きさを測定した。その
結果は表３のとおりであり、患者血清の色素浸潤の大き
さは正常人血清のそれに比較して明らかに大きかった。
表３
第１図は、モノクローナル抗ＮＰＣ−２０４イディオタ
イプ抗体を用いて血清中の癌抗体を測定したときの結果
を示す図である。 以上 第１図 ＯＤ（４９２ｎｍ） 正常人 肺癌 胃癌 上咽頭癌図中の数字は
平均値±ＳＤを示し、＊は正常人の値に比し有意差を示
す（Ｐ＜０．０１）。 手続補正書（自発） 昭和６２年４ 月２２日 ｌ 事件の表示 昭和６２ 年 特 許 願第５４９２１ 号２、発
明の名称 癌抗体の測定法 ３ 補正をする者 ・バ件との関係 出願人 ｒ上 所 名 称 日水製薬株式会社 ４、代理人 氏 名 （６８７０）弁理士 有 ｒ（三 幸住 所
同 上 氏 名 （７７５６）弁理士 高 野 登志雄住所同
上 氏名 （８６３２）弁理士小野信夫 ＆ 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の椙 ７、 補正の内容 （１）明細書中、第１０頁下から第４行「色素を浸潤」
とあるを 「色素浸潤」と訂正する。
イプ抗体を用いて血清中の癌抗体を測定したときの結果
を示す図である。 以上 第１図 ＯＤ（４９２ｎｍ） 正常人 肺癌 胃癌 上咽頭癌図中の数字は
平均値±ＳＤを示し、＊は正常人の値に比し有意差を示
す（Ｐ＜０．０１）。 手続補正書（自発） 昭和６２年４ 月２２日 ｌ 事件の表示 昭和６２ 年 特 許 願第５４９２１ 号２、発
明の名称 癌抗体の測定法 ３ 補正をする者 ・バ件との関係 出願人 ｒ上 所 名 称 日水製薬株式会社 ４、代理人 氏 名 （６８７０）弁理士 有 ｒ（三 幸住 所
同 上 氏 名 （７７５６）弁理士 高 野 登志雄住所同
上 氏名 （８６３２）弁理士小野信夫 ＆ 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の椙 ７、 補正の内容 （１）明細書中、第１０頁下から第４行「色素を浸潤」
とあるを 「色素浸潤」と訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、血清又は体液を、癌細胞抗原に特異性を有するモノ
クローナル抗イディオタイプ抗体と接触させ、当該モノ
クローナル抗イディオタイプ抗体に結合した抗体量を測
定することを特徴とする癌抗体の測定法。 ２、モノクローナル抗イディオタイプ抗体が、上咽頭癌
由来の細胞株ＮＰＣ−２０４の膜表面抗原に特異的に反
応するものである特許請求の範囲第１項記載の癌抗体の
測定法。 ３、動物を介する免疫応答反応により行う特許請求の範
囲第１項記載の癌抗体の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054921A JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054921A JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63221248A true JPS63221248A (ja) | 1988-09-14 |
| JP2553343B2 JP2553343B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=12984080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62054921A Expired - Lifetime JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2553343B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59122951A (ja) * | 1982-12-03 | 1984-07-16 | イエシバ・ユニヴア−シテイ− | ヒトの抗生得ｄｎａ抗体上の共通イデイオタイプと反応可能なモノクロ−ナル抗体 |
-
1987
- 1987-03-10 JP JP62054921A patent/JP2553343B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59122951A (ja) * | 1982-12-03 | 1984-07-16 | イエシバ・ユニヴア−シテイ− | ヒトの抗生得ｄｎａ抗体上の共通イデイオタイプと反応可能なモノクロ−ナル抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2553343B2 (ja) | 1996-11-13 |
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