JPH11116500A - 抗体及び診断方法 - Google Patents
抗体及び診断方法Info
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- JPH11116500A JPH11116500A JP9293452A JP29345297A JPH11116500A JP H11116500 A JPH11116500 A JP H11116500A JP 9293452 A JP9293452 A JP 9293452A JP 29345297 A JP29345297 A JP 29345297A JP H11116500 A JPH11116500 A JP H11116500A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 煩雑な抗原の精製工程を経ることなく、か
つ、血液の大量消費の必要もなく、確実な伝染性単核症
の診断を行うことができる方法を提供する。 【解決手段】 ポール・バンネル抗原を特異的に認識す
る抗体及びこれを用いる診断方法。
つ、血液の大量消費の必要もなく、確実な伝染性単核症
の診断を行うことができる方法を提供する。 【解決手段】 ポール・バンネル抗原を特異的に認識す
る抗体及びこれを用いる診断方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、伝染性単核症患者
血清中に存在するポール・バンネル（以下、本明細書中
においては「ＰＢ」ともいう）抗体が認識するＰＢ抗原
を特異的に認識するモノクローナル抗体及びそのモノク
ローナル抗体を用いたヒト体液中のＰＢ抗体の測定、更
にはこのモノクローナル抗体を用いたＰＢ抗原の検出に
関する。
血清中に存在するポール・バンネル（以下、本明細書中
においては「ＰＢ」ともいう）抗体が認識するＰＢ抗原
を特異的に認識するモノクローナル抗体及びそのモノク
ローナル抗体を用いたヒト体液中のＰＢ抗体の測定、更
にはこのモノクローナル抗体を用いたＰＢ抗原の検出に
関する。
【０００２】
【従来の技術】１９３２年にポールとバンネルは、伝染
性単核症の患者血清中にヒツジ赤血球を凝集させる抗
体、いわゆる異好性抗体が存在することを初めて報告
し、伝染性単核症の免疫学的診断の基礎を築いた〔アメ
リカン・ジャーナル・オブ・メデシナル・サイエンス
（Am. J. Med. Sci., ）、１８３巻、９０頁。１９３２
年〕。これ以降、伝染性単核症患者の血清がヒツジ赤血
球を凝集させる反応は、ＰＢ反応と呼ばれるようになっ
た。
性単核症の患者血清中にヒツジ赤血球を凝集させる抗
体、いわゆる異好性抗体が存在することを初めて報告
し、伝染性単核症の免疫学的診断の基礎を築いた〔アメ
リカン・ジャーナル・オブ・メデシナル・サイエンス
（Am. J. Med. Sci., ）、１８３巻、９０頁。１９３２
年〕。これ以降、伝染性単核症患者の血清がヒツジ赤血
球を凝集させる反応は、ＰＢ反応と呼ばれるようになっ
た。
【０００３】しかしながら、ヒツジ赤血球を凝集する異
好性抗体には、伝染性単核症患者血清中に存在するＰＢ
抗体以外にも、フォルスマン抗体やハンガーナッツ−ダ
イヘル抗体（以下、本明細書中では「Ｈ−Ｄ抗体」とい
う）と呼ばれる異好性抗体が知られており、伝染性単核
症の診断にはこれらを区別する必要があった。
好性抗体には、伝染性単核症患者血清中に存在するＰＢ
抗体以外にも、フォルスマン抗体やハンガーナッツ−ダ
イヘル抗体（以下、本明細書中では「Ｈ−Ｄ抗体」とい
う）と呼ばれる異好性抗体が知られており、伝染性単核
症の診断にはこれらを区別する必要があった。
【０００４】１９３５年、デビッドソンはモルモット腎
臓のホモジネートや牛赤血球を用いたフォルスマン抗体
とＨ−Ｄ抗体の吸収試験を考案し、伝染性単核症の血清
学的診断をより確実なものとした〔アメリカン・ジャー
ナル・オブ・クリニカル・パッソロジー（Am. J. Clin.
Pathol., ）、５巻、４５５頁。１９３５年〕。
臓のホモジネートや牛赤血球を用いたフォルスマン抗体
とＨ−Ｄ抗体の吸収試験を考案し、伝染性単核症の血清
学的診断をより確実なものとした〔アメリカン・ジャー
ナル・オブ・クリニカル・パッソロジー（Am. J. Clin.
Pathol., ）、５巻、４５５頁。１９３５年〕。
【０００５】現在では、伝染性単核症はエプスタインバ
ーウイルスによる急性感染症といわれており、発熱・頚
部リンパ節腫脹、肝脾腫・黄疸等に加え、末梢血には異
型リンパ球が増加する等の症状があらわれることが判っ
ている（新小児医学大系、第２０巻Ｃ、９６〜１１４
頁、１９８１年）。
ーウイルスによる急性感染症といわれており、発熱・頚
部リンパ節腫脹、肝脾腫・黄疸等に加え、末梢血には異
型リンパ球が増加する等の症状があらわれることが判っ
ている（新小児医学大系、第２０巻Ｃ、９６〜１１４
頁、１９８１年）。
【０００６】これらの症状は、一般にインフルエンザ・
風疹・肝炎・白血病等でもよく見られるため、その鑑別
診断は重要である。現在、伝染性単核症の確定診断は臨
床的、血液学的及び血清学的な所見に基づいて行われて
いるが、デビッドソンの吸収試験を組み合わせたＰＢ反
応は診断に欠かすことができないものとなっている〔メ
ディカル・テクノロジー(Medical Technology,）、８
巻、６号、４８５頁。１９８０年〕。
風疹・肝炎・白血病等でもよく見られるため、その鑑別
診断は重要である。現在、伝染性単核症の確定診断は臨
床的、血液学的及び血清学的な所見に基づいて行われて
いるが、デビッドソンの吸収試験を組み合わせたＰＢ反
応は診断に欠かすことができないものとなっている〔メ
ディカル・テクノロジー(Medical Technology,）、８
巻、６号、４８５頁。１９８０年〕。
【０００７】伝染性単核症の診断試薬や測定法として
は、これまで種々の方法が開示されている（米国特許第
３９５９４５６号明細書、米国特許第４０５５３９４号
明細書、米国特許第４１３９６０６号明細書、特公昭６
２−６２２９２号公報、米国特許第４２２８１４８号明
細書、米国特許第５０９６８０９号明細書等）。しかし
ながら、そのほとんどは上記のＰＢ反応に基づいてヒツ
ジ・ウマ・ウシ等の動物赤血球を使用しており、何らか
の形でデビッドソンの吸収試験を組み合わせたものとな
っている。
は、これまで種々の方法が開示されている（米国特許第
３９５９４５６号明細書、米国特許第４０５５３９４号
明細書、米国特許第４１３９６０６号明細書、特公昭６
２−６２２９２号公報、米国特許第４２２８１４８号明
細書、米国特許第５０９６８０９号明細書等）。しかし
ながら、そのほとんどは上記のＰＢ反応に基づいてヒツ
ジ・ウマ・ウシ等の動物赤血球を使用しており、何らか
の形でデビッドソンの吸収試験を組み合わせたものとな
っている。
【０００８】これに対して、ＰＢ反応に関与する赤血球
膜上の抗原を単離・精製し、この精製抗原を用いること
で吸収操作を必要としない、より簡便な測定系の開発も
試みられている。例えば、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー（JOURNAL OF CLINICAL MICR
OBIOLOGY）、１１巻、２５６〜２６２頁、１９８０年に
は、ウシ赤血球膜をアセトン、無水エタノール、７５％
エタノールの順で抽出し、次にこの７５％エタノール分
画をリン酸セルロースのカラムで分離し、更にクロロホ
ルム−メタノール（２：１）とエタノール−エーテル
（１：１）とで抽出し、得られた糖蛋白質をラテックス
粒子に感作し、伝染性単核症患者の診断に用いることが
述べられている。
膜上の抗原を単離・精製し、この精製抗原を用いること
で吸収操作を必要としない、より簡便な測定系の開発も
試みられている。例えば、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー（JOURNAL OF CLINICAL MICR
OBIOLOGY）、１１巻、２５６〜２６２頁、１９８０年に
は、ウシ赤血球膜をアセトン、無水エタノール、７５％
エタノールの順で抽出し、次にこの７５％エタノール分
画をリン酸セルロースのカラムで分離し、更にクロロホ
ルム−メタノール（２：１）とエタノール−エーテル
（１：１）とで抽出し、得られた糖蛋白質をラテックス
粒子に感作し、伝染性単核症患者の診断に用いることが
述べられている。
【０００９】また、特開平８−２８５８４６号公報に
は、ＰＢ抗原をウシ赤血球膜より界面活性剤で抽出し、
ゲルろ過とイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロ
マトグラフィーを組み合わせて精製する方法が開示され
ており、この精製抗原をゼラチン粒子に結合させて凝集
反応を行うことやＥＬＩＳＡプレートに結合してより高
感度に測定する方法があわせて提示されている。これら
の測定系は特異性が高く、吸収操作を全く必要としない
点でも優れたものである。
は、ＰＢ抗原をウシ赤血球膜より界面活性剤で抽出し、
ゲルろ過とイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロ
マトグラフィーを組み合わせて精製する方法が開示され
ており、この精製抗原をゼラチン粒子に結合させて凝集
反応を行うことやＥＬＩＳＡプレートに結合してより高
感度に測定する方法があわせて提示されている。これら
の測定系は特異性が高く、吸収操作を全く必要としない
点でも優れたものである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】上記のような精製抗原
を用いる方法は、確かに吸収操作を必要としないため簡
便で特異性の高い測定系ではあるが、そのためには抗原
の精製という煩雑な過程を経なければならなかった。測
定系の特異性を維持するためにも、不純物としての他の
抗原蛋白質の混入の可能性を常に考慮しなければならな
いないため、抗原を高純度に精製しなければならなかっ
た。また、動物血球からの調製であるため、新鮮な血液
を常に大量に必要とするという欠点も存在していた。
を用いる方法は、確かに吸収操作を必要としないため簡
便で特異性の高い測定系ではあるが、そのためには抗原
の精製という煩雑な過程を経なければならなかった。測
定系の特異性を維持するためにも、不純物としての他の
抗原蛋白質の混入の可能性を常に考慮しなければならな
いないため、抗原を高純度に精製しなければならなかっ
た。また、動物血球からの調製であるため、新鮮な血液
を常に大量に必要とするという欠点も存在していた。
【００１１】本発明は、上記に鑑み、煩雑な抗原の精製
工程を経ることなく、かつ、血液の大量消費の必要もな
く、確実な伝染性単核症の診断を行うことができる方法
を提供することを目的とするものである。
工程を経ることなく、かつ、血液の大量消費の必要もな
く、確実な伝染性単核症の診断を行うことができる方法
を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、吸収操作
や高純度の精製抗原を必要とせず、簡便で特異性の高い
ポール・バンネル抗体測定系を開発することを目的とし
鋭意研究を重ねた結果、ポール・バンネル抗原に対して
特異的なモノクローナル抗体を初めて得ることに成功
し、ポール・バンネル抗体測定にこのモノクローナル抗
体を用いることにより、簡便で特異性の高いポール・バ
ンネル抗体測定方法を提供することに成功し、本発明を
完成した。以下、本発明を詳細に説明する。
や高純度の精製抗原を必要とせず、簡便で特異性の高い
ポール・バンネル抗体測定系を開発することを目的とし
鋭意研究を重ねた結果、ポール・バンネル抗原に対して
特異的なモノクローナル抗体を初めて得ることに成功
し、ポール・バンネル抗体測定にこのモノクローナル抗
体を用いることにより、簡便で特異性の高いポール・バ
ンネル抗体測定方法を提供することに成功し、本発明を
完成した。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明はモノクローナル抗体を取得するこ
とによって初めて完成された発明であるが、本発明の抗
体は、その性質上、モノクローナル抗体のみに限定され
るものではなく、ＰＢ抗原を特異的に認識する抗体であ
れば特に限定されず、例えば、ポリクローナル抗体であ
ってもよい。しかしながら、ＰＢ抗体測定の目的のため
には、モノクローナル抗体であることが好ましい。
とによって初めて完成された発明であるが、本発明の抗
体は、その性質上、モノクローナル抗体のみに限定され
るものではなく、ＰＢ抗原を特異的に認識する抗体であ
れば特に限定されず、例えば、ポリクローナル抗体であ
ってもよい。しかしながら、ＰＢ抗体測定の目的のため
には、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１４】本発明に係るモノクローナル抗体は、例え
ば、ＰＢ抗原を常法にもとづいて動物に免疫し、その抗
体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られるハ
イブリドーマからＰＢ抗原を認識する抗体を産生するハ
イブリドーマを選択し、これを培養して産生されたモノ
クローナル抗体を回収することにより得ることができ
る。
ば、ＰＢ抗原を常法にもとづいて動物に免疫し、その抗
体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られるハ
イブリドーマからＰＢ抗原を認識する抗体を産生するハ
イブリドーマを選択し、これを培養して産生されたモノ
クローナル抗体を回収することにより得ることができ
る。
【００１５】上記工程において、抗原として用いるＰＢ
抗原はジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオ
ロジー（JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY）、１１
巻、２５６〜２６２頁、１９８０年に記載された方法、
又は、特開平８−２８５８４６号公報に記載された方法
により精製することができるし、免疫応答がでる程度に
精製された粗精製抗原であってもよい。
抗原はジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオ
ロジー（JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY）、１１
巻、２５６〜２６２頁、１９８０年に記載された方法、
又は、特開平８−２８５８４６号公報に記載された方法
により精製することができるし、免疫応答がでる程度に
精製された粗精製抗原であってもよい。
【００１６】下記実施例において記述するように、上記
方法に基づき調製したＰＢ抗原と特異的に反応するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、本発
明者らは、合計６種のハイブリドーマを樹立し、それぞ
れ、ハイブリドーマＰＢ２、ハイブリドーマＰＢ１６、
ハイブリドーマＰＢ２３、ハイブリドーマＰＢ２５、ハ
イブリドーマＰＢ２７、及び、ハイブリドーマＰＢＮ２
と命名した。これらのうち、ハイブリドーマＰＢ２及び
ハイブリドーマＰＢ２３は、工業技術院生命工学工業技
術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号（郵便番号３０５−００４６）〕に、ハイブリドー
マＰＢ２は、識別表示ＰＢ２、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６３７０（受託日；平成９年８月６日）として、ハイ
ブリドーマＰＢ２３は、識別表示ＰＢ２３、受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６３７１（受託日；平成９年８月６日）
として寄託した。
方法に基づき調製したＰＢ抗原と特異的に反応するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、本発
明者らは、合計６種のハイブリドーマを樹立し、それぞ
れ、ハイブリドーマＰＢ２、ハイブリドーマＰＢ１６、
ハイブリドーマＰＢ２３、ハイブリドーマＰＢ２５、ハ
イブリドーマＰＢ２７、及び、ハイブリドーマＰＢＮ２
と命名した。これらのうち、ハイブリドーマＰＢ２及び
ハイブリドーマＰＢ２３は、工業技術院生命工学工業技
術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号（郵便番号３０５−００４６）〕に、ハイブリドー
マＰＢ２は、識別表示ＰＢ２、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６３７０（受託日；平成９年８月６日）として、ハイ
ブリドーマＰＢ２３は、識別表示ＰＢ２３、受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６３７１（受託日；平成９年８月６日）
として寄託した。
【００１７】上記ハイブリドーマが産生するモノクロー
ナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体の代表的な一
例に過ぎず、本発明のモノクローナル抗体は、これらの
みに限定されるものではなく、ＰＢ抗原を特異的に認識
するモノクローナル抗体であればいかなるものであって
も本発明の範囲に属するものである。
ナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体の代表的な一
例に過ぎず、本発明のモノクローナル抗体は、これらの
みに限定されるものではなく、ＰＢ抗原を特異的に認識
するモノクローナル抗体であればいかなるものであって
も本発明の範囲に属するものである。
【００１８】本発明のモノクローナル抗体を用いたＰＢ
抗体の測定は、例えば以下のようにして行うことができ
る。まず、上記のような方法により調製したＰＢ抗原に
対するモノクローナル抗体であって、検体中のＰＢ抗体
と競合反応しない抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体を用意
する（以下、本明細書中では「ＰＢ抗体１」ともい
う）。
抗体の測定は、例えば以下のようにして行うことができ
る。まず、上記のような方法により調製したＰＢ抗原に
対するモノクローナル抗体であって、検体中のＰＢ抗体
と競合反応しない抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体を用意
する（以下、本明細書中では「ＰＢ抗体１」ともい
う）。
【００１９】このＰＢ抗体１を、例えばＥＬＩＳＡプレ
ートのウェルの内壁のような固相に結合させ、非特異吸
着部位をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキン
グした後、粗精製のＰＢ抗原と反応させる。一定時間反
応後、洗浄することによって、ＰＢ抗体１を介してＰＢ
抗原のみを固相に結合させることができる。
ートのウェルの内壁のような固相に結合させ、非特異吸
着部位をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキン
グした後、粗精製のＰＢ抗原と反応させる。一定時間反
応後、洗浄することによって、ＰＢ抗体１を介してＰＢ
抗原のみを固相に結合させることができる。
【００２０】検体中のＰＢ抗体を直接測定する場合に
は、次に測定しようとする検体を反応させ、洗浄後、抗
ヒト・イムノブロブリン抗体等を反応させ、更に洗浄し
た後、固相に結合している抗ヒト・イムノブロブリン抗
体等の量を測定することにより検体中のＰＢ抗体の量を
測定することができる。
は、次に測定しようとする検体を反応させ、洗浄後、抗
ヒト・イムノブロブリン抗体等を反応させ、更に洗浄し
た後、固相に結合している抗ヒト・イムノブロブリン抗
体等の量を測定することにより検体中のＰＢ抗体の量を
測定することができる。
【００２１】本発明のモノクローナル抗体を用いたＰＢ
抗体の測定は、凝集反応抗原結合粒子へ結合させて行う
方法によっても行うことができる。上記ＰＢ抗体１を、
例えば、ラテックス、ゼラチン粒子、磁性粒子等の通常
用いられる不溶性担体に、通常用いられる方法により担
持させる。このような担持は、例えば、上記ＰＢ抗体１
を含有させた適切な緩衝液を上記不溶性担体の懸濁液に
加え、例えば、適切な温度条件下に攪拌した後、遠心分
離により上清を取り除き、洗浄等の適切な措置の後にＰ
Ｂ抗体１担持不溶性担体を取得することにより行うこと
ができる。
抗体の測定は、凝集反応抗原結合粒子へ結合させて行う
方法によっても行うことができる。上記ＰＢ抗体１を、
例えば、ラテックス、ゼラチン粒子、磁性粒子等の通常
用いられる不溶性担体に、通常用いられる方法により担
持させる。このような担持は、例えば、上記ＰＢ抗体１
を含有させた適切な緩衝液を上記不溶性担体の懸濁液に
加え、例えば、適切な温度条件下に攪拌した後、遠心分
離により上清を取り除き、洗浄等の適切な措置の後にＰ
Ｂ抗体１担持不溶性担体を取得することにより行うこと
ができる。
【００２２】その後、ＰＢ抗原含有緩衝液を加えること
によりＰＢ抗体１担持不溶性担体とＰＢ抗原とを結合さ
せ、適切な方法により洗浄し、乾燥する。上記方法によ
り得られたＰＢ抗原担持不溶性担体は、検体中のＰＢ抗
体と選択的に凝集反応を起こすことができるので、当該
量を測定することにより、検体中のＰＢ抗体の量を測定
することができる。
によりＰＢ抗体１担持不溶性担体とＰＢ抗原とを結合さ
せ、適切な方法により洗浄し、乾燥する。上記方法によ
り得られたＰＢ抗原担持不溶性担体は、検体中のＰＢ抗
体と選択的に凝集反応を起こすことができるので、当該
量を測定することにより、検体中のＰＢ抗体の量を測定
することができる。
【００２３】また、競合反応により検体中のＰＢ抗体の
量を測定することもできる。すなわち上記のようなＰＢ
抗体１を介してＰＢ抗原を結合した固相に対して検体を
反応させる際に、同時に検体中のＰＢ抗体と競合反応す
る抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体（以下、本明細書では
「ＰＢ抗体２」ともいう）を反応させる。洗浄後、ＰＢ
抗体２の固相への結合量を測定することにより、検体中
のＰＢ抗体の量を測定することができる。
量を測定することもできる。すなわち上記のようなＰＢ
抗体１を介してＰＢ抗原を結合した固相に対して検体を
反応させる際に、同時に検体中のＰＢ抗体と競合反応す
る抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体（以下、本明細書では
「ＰＢ抗体２」ともいう）を反応させる。洗浄後、ＰＢ
抗体２の固相への結合量を測定することにより、検体中
のＰＢ抗体の量を測定することができる。
【００２４】ＰＢ抗体を直接測定する場合の抗ヒト・イ
ムノグロブリン抗体等の測定や、競合反応におけるＰＢ
抗体２の測定は、従来より免疫分析の分野において周知
の種々の方法により行うことができる。例えば、これら
の抗体を酵素で標識しておき、発色性の基質又は化学発
光性の基質を用いて行うことができる。また、これらの
抗体にビオチンを結合しておき、このビオチンを標識化
アビジンと反応させて該標識を測定することによっても
行うことができる。
ムノグロブリン抗体等の測定や、競合反応におけるＰＢ
抗体２の測定は、従来より免疫分析の分野において周知
の種々の方法により行うことができる。例えば、これら
の抗体を酵素で標識しておき、発色性の基質又は化学発
光性の基質を用いて行うことができる。また、これらの
抗体にビオチンを結合しておき、このビオチンを標識化
アビジンと反応させて該標識を測定することによっても
行うことができる。
【００２５】更には、これらの抗体に特異的に反応する
標識化抗体を反応させ、該標識を測定することによって
も行うことができる。これらの抗体の標識には、酵素の
代わりに発光色素や放射性物質を用いても良い。なお、
競合反応測定に用いるＰＢ抗体と競合する抗体はいなる
動物種の抗体を用いてもよく、ポリクローナル抗体を用
いることも可能である。
標識化抗体を反応させ、該標識を測定することによって
も行うことができる。これらの抗体の標識には、酵素の
代わりに発光色素や放射性物質を用いても良い。なお、
競合反応測定に用いるＰＢ抗体と競合する抗体はいなる
動物種の抗体を用いてもよく、ポリクローナル抗体を用
いることも可能である。
【００２６】本発明のモノクローナル抗体を用いたＰＢ
抗体測定方法を、ヒト由来の種々の検体に適用すること
により、本発明の伝染性単核症の診断方法を実施するこ
とができる。本発明のモノクローナル抗体を用いた診断
方法においては、診断のための検体としては、ヒト由来
の種々の体液を挙げることができ、例えば、血清及び血
漿等を挙げることができる。
抗体測定方法を、ヒト由来の種々の検体に適用すること
により、本発明の伝染性単核症の診断方法を実施するこ
とができる。本発明のモノクローナル抗体を用いた診断
方法においては、診断のための検体としては、ヒト由来
の種々の体液を挙げることができ、例えば、血清及び血
漿等を挙げることができる。
【００２７】本発明のモノクローナル抗体は、ＰＢ抗原
の測定にも用いることができる。ＰＢ抗原は悪性リンパ
腫、白血病患者の脾組織にも存在し〔ジャーナル・オブ
・イミュノロジー（J. Immun.,）１１９巻、９４５頁、
１９７７年。ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J. I
mmun.,）１２７巻、５頁、１９８１年〕、またメラノー
マ細胞においても存在が認められていることから（Int.
Arch. Allergy appl.Immun., Vol.83, p160, 1987
）、癌をはじめとする各種疾患でＰＢ抗原が増大して
いる可能性が示唆されている。これらの検出にも、本発
明のモノクローナル抗体は有用である。
の測定にも用いることができる。ＰＢ抗原は悪性リンパ
腫、白血病患者の脾組織にも存在し〔ジャーナル・オブ
・イミュノロジー（J. Immun.,）１１９巻、９４５頁、
１９７７年。ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J. I
mmun.,）１２７巻、５頁、１９８１年〕、またメラノー
マ細胞においても存在が認められていることから（Int.
Arch. Allergy appl.Immun., Vol.83, p160, 1987
）、癌をはじめとする各種疾患でＰＢ抗原が増大して
いる可能性が示唆されている。これらの検出にも、本発
明のモノクローナル抗体は有用である。
【００２８】すなわち、本発明のモノクローナル抗体を
用いることにより、免疫化学的方法や免疫組織化学的方
法により、ヒト由来の種々の体液、細胞、組織等におけ
るＰＢ抗原を直接測定することが可能となったのであ
る。また、本発明において、２以上のモノクローナル抗
体を同時に用いるいわゆるサンドイッチアッセイ法を適
用することにより、溶液中のＰＢ抗原を特異的に感度良
く測定できる等の極めて有用な効果を得ることができ
る。
用いることにより、免疫化学的方法や免疫組織化学的方
法により、ヒト由来の種々の体液、細胞、組織等におけ
るＰＢ抗原を直接測定することが可能となったのであ
る。また、本発明において、２以上のモノクローナル抗
体を同時に用いるいわゆるサンドイッチアッセイ法を適
用することにより、溶液中のＰＢ抗原を特異的に感度良
く測定できる等の極めて有用な効果を得ることができ
る。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説
明する。なお、本発明は下記実施例のみに限定されるも
のではない。
明する。なお、本発明は下記実施例のみに限定されるも
のではない。
【００３０】実施例１ 抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマの作製 特開平８−２８５８４６号公報記載の方法に従って精製
したＰＢ抗原を、免疫原として用いた。ＰＢ抗原をフロ
イント完全アジュバントと等量混合し、マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ）の腹腔内に２００μｌ（約４０μｇ／マウス）
投与した。約２週間後、同じくＰＢ抗原をフロイント不
完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗
体価の上昇を確認した後、最終免疫としてＰＢ抗原約４
０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出し
た。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−
ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（大日本製薬社製）
とを３：１の細胞数で混合し、５０％ポリエチレングリ
コール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞はＨＡ
Ｔ（１×１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノ
プテリン、１．６×１０-5Ｍチミジン）及び１０％ウシ
胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁
し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培
養した。
産生ハイブリドーマの作製 特開平８−２８５８４６号公報記載の方法に従って精製
したＰＢ抗原を、免疫原として用いた。ＰＢ抗原をフロ
イント完全アジュバントと等量混合し、マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ）の腹腔内に２００μｌ（約４０μｇ／マウス）
投与した。約２週間後、同じくＰＢ抗原をフロイント不
完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗
体価の上昇を確認した後、最終免疫としてＰＢ抗原約４
０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出し
た。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−
ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（大日本製薬社製）
とを３：１の細胞数で混合し、５０％ポリエチレングリ
コール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞はＨＡ
Ｔ（１×１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノ
プテリン、１．６×１０-5Ｍチミジン）及び１０％ウシ
胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁
し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培
養した。
【００３１】約２週間後、ハイブリドーマが増殖してき
たウェルの培養上清を以下の方法により調べ、ＰＢ抗原
に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイ
ブリドーマを選択した。すなわち、ＰＢ抗原をリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で希釈し、９６穴マイクロアッセイプレ
ートに分注し、４℃で一晩放置して固相に結合させた。
次に、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを分
注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングした。Ｐ
ＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清を各ウェル
に分注し、１時間、３７℃に放置した。続いて同様に洗
浄後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を分注
し、１時間、３７℃に放置した。同様に洗浄した後、Ｐ
ＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温で１
０分間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収
を測定した。
たウェルの培養上清を以下の方法により調べ、ＰＢ抗原
に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイ
ブリドーマを選択した。すなわち、ＰＢ抗原をリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で希釈し、９６穴マイクロアッセイプレ
ートに分注し、４℃で一晩放置して固相に結合させた。
次に、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを分
注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングした。Ｐ
ＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清を各ウェル
に分注し、１時間、３７℃に放置した。続いて同様に洗
浄後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を分注
し、１時間、３７℃に放置した。同様に洗浄した後、Ｐ
ＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温で１
０分間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収
を測定した。
【００３２】陽性ウェルの細胞を選択し、限界希釈法に
てクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞
上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養し、Ｐ
Ｂ抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマＰＢ２、ハイブリドーマＰＢ１６、ハイブリド
ーマＰＢ２３、ハイブリドーマＰＢ２５、ハイブリドー
マＰＢ２７、及び、ハイブリドーマＰＢＮ２を樹立し
た。これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル
抗体を、それぞれ、モノクローナル抗体ＰＢ２、モノク
ローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナル抗体ＰＢ２３、
モノクローナル抗体ＰＢ２５、モノクローナル抗体ＰＢ
２７、及び、モノクローナル抗体ＰＢＮ２と命名した。
てクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞
上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養し、Ｐ
Ｂ抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマＰＢ２、ハイブリドーマＰＢ１６、ハイブリド
ーマＰＢ２３、ハイブリドーマＰＢ２５、ハイブリドー
マＰＢ２７、及び、ハイブリドーマＰＢＮ２を樹立し
た。これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル
抗体を、それぞれ、モノクローナル抗体ＰＢ２、モノク
ローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナル抗体ＰＢ２３、
モノクローナル抗体ＰＢ２５、モノクローナル抗体ＰＢ
２７、及び、モノクローナル抗体ＰＢＮ２と命名した。
【００３３】実施例２ 抗体のサブクラスの決定 実施例１で作製したハイブリドーマが産生するモノクロ
ーナル抗体のサブクラスを、マウス・モノクローナル抗
体アイソタイピングキット（アマシャム社製）を用いて
調べた結果、ＰＢＮ２はＩｇＧ2b（κ）、その他のモノ
クローナル抗体はＩｇＧ1 （κ）であった。
ーナル抗体のサブクラスを、マウス・モノクローナル抗
体アイソタイピングキット（アマシャム社製）を用いて
調べた結果、ＰＢＮ２はＩｇＧ2b（κ）、その他のモノ
クローナル抗体はＩｇＧ1 （κ）であった。
【００３４】実施例３ 抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体
の調製 実施例１で樹立したハイブリドーマＰＢ２、ハイブリド
ーマＰＢ１６、ハイブリドーマＰＢ２３、ハイブリドー
マＰＢ２５、ハイブリドーマＰＢ２７、ハイブリドーマ
ＰＢＮ２のそれぞれの細胞１×１０7 個を、プリスタン
０．５ｍｌ投与後２週間のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内
投与した。約１０日後、マウス腹腔内に貯留した腹水を
採取した。この腹水を、２５ｍＭ モルフォリンエンタ
ンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）（ｐＨ４．０）で４倍以
上に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）で平衡化
したベーカーボンドＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔベーカー社
製）に吸着させ、５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含む
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）によるグラジ
エントで溶出し、モノクローナル抗体を精製した。
の調製 実施例１で樹立したハイブリドーマＰＢ２、ハイブリド
ーマＰＢ１６、ハイブリドーマＰＢ２３、ハイブリドー
マＰＢ２５、ハイブリドーマＰＢ２７、ハイブリドーマ
ＰＢＮ２のそれぞれの細胞１×１０7 個を、プリスタン
０．５ｍｌ投与後２週間のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内
投与した。約１０日後、マウス腹腔内に貯留した腹水を
採取した。この腹水を、２５ｍＭ モルフォリンエンタ
ンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）（ｐＨ４．０）で４倍以
上に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）で平衡化
したベーカーボンドＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔベーカー社
製）に吸着させ、５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含む
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）によるグラジ
エントで溶出し、モノクローナル抗体を精製した。
【００３５】実施例４ 抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体
の反応性 （１）ウエスタンブロットによる反応性の確認 特開平８−２８５８４６号公報記載の方法に従ってＰＢ
抗原を精製した。試料希釈液として６０％グリセリン、
３％ＳＤＳ、３０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、３％
２−メルカプトエタノール溶液（以下、本明細書中では
「試料希釈液」という）を調製した。精製ＰＢ抗原と、
１／２量（Ｖ／Ｖ）の試料希釈液とを混合し、沸騰水中
で加熱した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、更にニトロセルロース
膜に転写した。転写膜を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ）でブロッキングした後、実施例３で精
製したモノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体
ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナ
ル抗体ＰＢＮ２を、それぞれ同緩衝液で１μｇ／ｍｌと
なるように希釈し、それぞれ室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴによる洗浄後、１０００倍希釈したＰＯＤ標識
抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）と室温で１時
間反応させた。更にＰＢＳＴによる洗浄を行った後、Ｐ
ＯＤ不溶性基質（４−クロロナフトール−過酸化水素
系）を加えて、１５分間発色させた。
の反応性 （１）ウエスタンブロットによる反応性の確認 特開平８−２８５８４６号公報記載の方法に従ってＰＢ
抗原を精製した。試料希釈液として６０％グリセリン、
３％ＳＤＳ、３０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、３％
２−メルカプトエタノール溶液（以下、本明細書中では
「試料希釈液」という）を調製した。精製ＰＢ抗原と、
１／２量（Ｖ／Ｖ）の試料希釈液とを混合し、沸騰水中
で加熱した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、更にニトロセルロース
膜に転写した。転写膜を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ）でブロッキングした後、実施例３で精
製したモノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体
ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナ
ル抗体ＰＢＮ２を、それぞれ同緩衝液で１μｇ／ｍｌと
なるように希釈し、それぞれ室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴによる洗浄後、１０００倍希釈したＰＯＤ標識
抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）と室温で１時
間反応させた。更にＰＢＳＴによる洗浄を行った後、Ｐ
ＯＤ不溶性基質（４−クロロナフトール−過酸化水素
系）を加えて、１５分間発色させた。
【００３６】結果を図１に示す。分子量５０ｋＤａ、３
５ｋＤａ、２０ｋＤａ付近に、同時に行ったゲルの銀染
色による蛋白質バンドと一致したバンドを生じた。これ
により、モノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗
体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ１６及びモノクロ
ーナル抗体ＰＢＮ２がＰＢ抗原を特異的に認識すること
を確認した。
５ｋＤａ、２０ｋＤａ付近に、同時に行ったゲルの銀染
色による蛋白質バンドと一致したバンドを生じた。これ
により、モノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗
体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ１６及びモノクロ
ーナル抗体ＰＢＮ２がＰＢ抗原を特異的に認識すること
を確認した。
【００３７】（２）ＥＬＩＳＡによる反応性の確認 実施例４−（１）で精製したＰＢ抗原をＰＢＳで１００
ｎｇ／ｍｌに希釈し、マイクロアッセイプレートに１０
０μｌ／ウエルで加え、４℃で一晩放置することにより
固相に結合させ、更にＰＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡ−
ＰＢＳでブロッキングした。実施例３で精製したモノク
ローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モ
ノクローナル抗体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ２
５、モノクローナル抗体ＰＢＮ２を、それぞれ１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈して、この
ＰＢ抗原結合プレートに１００μｌ／ウエルで加え、室
温で１時間反応させ、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１０００
倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダ
コ社製）を１００μｌ／ウエルで加え、更に室温で１時
間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＯＤ基質（Ａ
ＢＴＳ−過酸化水素系）を１００μｌ／ウエルで加え、
１０分間発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結
果を表１に示す。
ｎｇ／ｍｌに希釈し、マイクロアッセイプレートに１０
０μｌ／ウエルで加え、４℃で一晩放置することにより
固相に結合させ、更にＰＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡ−
ＰＢＳでブロッキングした。実施例３で精製したモノク
ローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モ
ノクローナル抗体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ２
５、モノクローナル抗体ＰＢＮ２を、それぞれ１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈して、この
ＰＢ抗原結合プレートに１００μｌ／ウエルで加え、室
温で１時間反応させ、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１０００
倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダ
コ社製）を１００μｌ／ウエルで加え、更に室温で１時
間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＯＤ基質（Ａ
ＢＴＳ−過酸化水素系）を１００μｌ／ウエルで加え、
１０分間発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結
果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例５ 抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体
の認識部位 （１）シアリダーゼ消化ＰＢ抗原と抗ＰＢ抗原モノクロ
ーナル抗体の反応性 実施例４−（１）で精製したＰＢ抗原に、１μｇ当たり
１５ｍＵのシアリダーゼ（Arthrobactor Ureafaciens由
来、ナカライ社製）を加え、３７℃で３時間消化した
後、実施例４−（２）と同様の方法に従ってマイクロア
ッセイプレートに結合させた。このシアリダーゼ消化Ｐ
Ｂ抗原結合プレートを用い、実施例４−（２）に記載し
た方法により実施例３で精製したモノクローナル抗体Ｐ
Ｂ２、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナル抗
体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ２５及びモノクロ
ーナル抗体ＰＢＮ２の反応性を測定した。結果を表２に
示す。モノクローナル抗体ＰＢ２、及び、モノクローナ
ル抗体ＰＢＮ２は、シアリダーゼ消化したＰＢ抗原と反
応しなかったことから、ＰＢ抗原上の糖鎖を認識してい
ると判断した。
の認識部位 （１）シアリダーゼ消化ＰＢ抗原と抗ＰＢ抗原モノクロ
ーナル抗体の反応性 実施例４−（１）で精製したＰＢ抗原に、１μｇ当たり
１５ｍＵのシアリダーゼ（Arthrobactor Ureafaciens由
来、ナカライ社製）を加え、３７℃で３時間消化した
後、実施例４−（２）と同様の方法に従ってマイクロア
ッセイプレートに結合させた。このシアリダーゼ消化Ｐ
Ｂ抗原結合プレートを用い、実施例４−（２）に記載し
た方法により実施例３で精製したモノクローナル抗体Ｐ
Ｂ２、モノクローナル抗体ＰＢ１６、モノクローナル抗
体ＰＢ２３、モノクローナル抗体ＰＢ２５及びモノクロ
ーナル抗体ＰＢＮ２の反応性を測定した。結果を表２に
示す。モノクローナル抗体ＰＢ２、及び、モノクローナ
ル抗体ＰＢＮ２は、シアリダーゼ消化したＰＢ抗原と反
応しなかったことから、ＰＢ抗原上の糖鎖を認識してい
ると判断した。
【００４０】
【表２】
【００４１】（２）プロテアーゼ消化ＰＢ抗原と抗ＰＢ
抗原モノクローナル抗体の反応 実施例４−（１）で精製したＰＢ抗原に、１／２００量
（Ｗ／Ｗ）のエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（Pseudomo
nas fragi 変異株由来、タカラ社製）を加え、３７℃で
一晩消化した後、実施例４−（２）に記載した方法に従
ってマイクロアッセイプレートに結合させた。このエン
ドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ消化ＰＢ抗原結合プレートを
用い、実施例４−（２）に記載した方法に実施例３で精
製したモノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体
ＰＢ１６、モノクローナル抗体ＰＢ２３及びモノクロー
ナル抗体ＰＢＮ２の反応性を測定した。結果を表３に示
す。表３に示すように、モノクローナル抗体ＰＢ２３
は、ＰＢ抗原とは反応するが、エンドプロテアーゼＡｓ
ｐ−Ｎで消化したＰＢ抗原とは反応しなかった。よっ
て、モノクローナル抗体ＰＢ２３はＰＢ抗原のペプチド
部分を認識していると判断した。
抗原モノクローナル抗体の反応 実施例４−（１）で精製したＰＢ抗原に、１／２００量
（Ｗ／Ｗ）のエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（Pseudomo
nas fragi 変異株由来、タカラ社製）を加え、３７℃で
一晩消化した後、実施例４−（２）に記載した方法に従
ってマイクロアッセイプレートに結合させた。このエン
ドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ消化ＰＢ抗原結合プレートを
用い、実施例４−（２）に記載した方法に実施例３で精
製したモノクローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体
ＰＢ１６、モノクローナル抗体ＰＢ２３及びモノクロー
ナル抗体ＰＢＮ２の反応性を測定した。結果を表３に示
す。表３に示すように、モノクローナル抗体ＰＢ２３
は、ＰＢ抗原とは反応するが、エンドプロテアーゼＡｓ
ｐ−Ｎで消化したＰＢ抗原とは反応しなかった。よっ
て、モノクローナル抗体ＰＢ２３はＰＢ抗原のペプチド
部分を認識していると判断した。
【００４２】
【表３】
【００４３】実施例６ 競合反応による伝染性単核症患
者血清のＰＢ抗体の測定 （１）酵素標識抗体の作製 実施例３で精製したモノクローナル抗体ＰＢ２を吉武等
の方法（Eur.J.Biochem.,101,395-399,1979)に従ってＰ
ＯＤで標識し、以下の実施例に用いた。
者血清のＰＢ抗体の測定 （１）酵素標識抗体の作製 実施例３で精製したモノクローナル抗体ＰＢ２を吉武等
の方法（Eur.J.Biochem.,101,395-399,1979)に従ってＰ
ＯＤで標識し、以下の実施例に用いた。
【００４４】（２）至適抗体結合量の決定 抗体の結合濃度を以下のように決定した。すなわち、モ
ノクローナル抗体ＰＢ２３を１、２、５、１０、２０、
８０μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、マイクロ
アッセイプレートに１００μｌ／ウェルで加え，４℃で
一晩放置して結合させた。ＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで２ｎｇ／ｍｌに希釈したＰＢ抗原を１０
０μｌ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。ＰＢ
ＳＴで３回ウェルを洗浄後、実施例６−（１）で作製し
たＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＰＢ２を１％ＢＳＡ−
ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルで
加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回ウェル
を洗浄後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え、１
０分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。この結
果、結合時の抗体濃度は２０μｇ／ｍｌ以上であれば充
分にＰＢ抗原を測定できることが確認できた。以下、モ
ノクローナル抗体のプレートへの結合は２０μｇ／ｍｌ
にて行った。
ノクローナル抗体ＰＢ２３を１、２、５、１０、２０、
８０μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、マイクロ
アッセイプレートに１００μｌ／ウェルで加え，４℃で
一晩放置して結合させた。ＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄
し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで２ｎｇ／ｍｌに希釈したＰＢ抗原を１０
０μｌ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。ＰＢ
ＳＴで３回ウェルを洗浄後、実施例６−（１）で作製し
たＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＰＢ２を１％ＢＳＡ−
ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルで
加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回ウェル
を洗浄後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え、１
０分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。この結
果、結合時の抗体濃度は２０μｇ／ｍｌ以上であれば充
分にＰＢ抗原を測定できることが確認できた。以下、モ
ノクローナル抗体のプレートへの結合は２０μｇ／ｍｌ
にて行った。
【００４５】（３）競合反応による測定 伝染性単核症患者血清を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２５、
７５、２２５、６７５、２０２５、６０７５、１８２２
５倍に希釈し、実施例６−（１）で作製したＰＯＤ標識
モノクローナル抗体ＰＢ２を同緩衝液で１μｇ／ｍｌに
希釈し、それぞれ等量ずつ混合した。実施例６−（２）
に記載の方法で、モノクローナル抗体ＰＢ２３を結合さ
せたマイクロアッセイプレートに、２ｎｇ／ｍｌに希釈
したＰＢ抗原を加え、室温で２時間反応した後、ＰＢＳ
Ｔで３回洗浄した。このプレートに上記の血清−ＰＯＤ
標識モノクローナル抗体ＰＢ２混合液を１００μｌ／ウ
ェルで加え、室温で１時間反応させた。、ＰＢＳＴで３
回洗浄後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え２０
分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。その結果
を図２に示す。
７５、２２５、６７５、２０２５、６０７５、１８２２
５倍に希釈し、実施例６−（１）で作製したＰＯＤ標識
モノクローナル抗体ＰＢ２を同緩衝液で１μｇ／ｍｌに
希釈し、それぞれ等量ずつ混合した。実施例６−（２）
に記載の方法で、モノクローナル抗体ＰＢ２３を結合さ
せたマイクロアッセイプレートに、２ｎｇ／ｍｌに希釈
したＰＢ抗原を加え、室温で２時間反応した後、ＰＢＳ
Ｔで３回洗浄した。このプレートに上記の血清−ＰＯＤ
標識モノクローナル抗体ＰＢ２混合液を１００μｌ／ウ
ェルで加え、室温で１時間反応させた。、ＰＢＳＴで３
回洗浄後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え２０
分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。その結果
を図２に示す。
【００４６】健常人１例と伝染性単核患者８例の血清を
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで７５倍に希釈し、実施例６−
（１）で作製したＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＰＢ２
を同緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈して等量混合し、上記
実施例６−（２）に記載の方法でＰＢ抗体を検出した。
その結果を表４に示す。モノクローナル抗体ＰＢ２を用
いた競合反応により、伝染性単核患者血清中のＰＢ抗体
を測定することができた。
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで７５倍に希釈し、実施例６−
（１）で作製したＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＰＢ２
を同緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈して等量混合し、上記
実施例６−（２）に記載の方法でＰＢ抗体を検出した。
その結果を表４に示す。モノクローナル抗体ＰＢ２を用
いた競合反応により、伝染性単核患者血清中のＰＢ抗体
を測定することができた。
【００４７】
【表４】
【００４８】実施例７ 直接測定による伝染性単核症患
者血清のＰＢ抗体の測定 実施例６−（２）に記載の方法に従って、モノクローナ
ル抗体ＰＢ１６及びモノクローナル抗体ＰＢ２３をそれ
ぞれプレートに結合し、ＰＢ抗原と反応させた後、１％
ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００、９０００、２７０００、８
１０００倍に希釈した伝染性単核症患者血清を１００μ
ｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ
で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈し
たＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＭ（タゴ社製）を１００μｌ／
ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３
回洗浄した後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え
２０分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。結果
を表５に示す。表５に見られるようにモノクローナル抗
体ＰＢ１６及びモノクローナル抗体ＰＢ２３結合固相に
おいて血清希釈倍率に依存した発色が認められた。
者血清のＰＢ抗体の測定 実施例６−（２）に記載の方法に従って、モノクローナ
ル抗体ＰＢ１６及びモノクローナル抗体ＰＢ２３をそれ
ぞれプレートに結合し、ＰＢ抗原と反応させた後、１％
ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００、９０００、２７０００、８
１０００倍に希釈した伝染性単核症患者血清を１００μ
ｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ
で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈し
たＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＭ（タゴ社製）を１００μｌ／
ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３
回洗浄した後、ＰＯＤ基質を１００μｌ／ウェルで加え
２０分間発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。結果
を表５に示す。表５に見られるようにモノクローナル抗
体ＰＢ１６及びモノクローナル抗体ＰＢ２３結合固相に
おいて血清希釈倍率に依存した発色が認められた。
【００４９】
【表５】
【００５０】実施例８ 組織中のＰＢ抗原の検出 ウシ赤血球膜は、特開平８−２８５４６号公報記載の方
法に従って調製し、ウシ副腎、脾臓、肝臓、甲状腺、膵
臓は、組織重量当たり５倍量のＰＢＳを加え、氷中、１
０分間ホモジナイズし、不溶性の残渣をガーゼで濾して
調製した。試料は、１／２量（Ｖ／Ｖ）の試料希釈液を
加え、沸騰水中で２分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、ニトロセルロース膜に転写した。この転写膜を用
い、実施例４−（１）に記載した方法に従って、モノク
ローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体ＰＢ２３によ
るウエスタンブロットによる検出を行った。結果を表６
に示す。
法に従って調製し、ウシ副腎、脾臓、肝臓、甲状腺、膵
臓は、組織重量当たり５倍量のＰＢＳを加え、氷中、１
０分間ホモジナイズし、不溶性の残渣をガーゼで濾して
調製した。試料は、１／２量（Ｖ／Ｖ）の試料希釈液を
加え、沸騰水中で２分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、ニトロセルロース膜に転写した。この転写膜を用
い、実施例４−（１）に記載した方法に従って、モノク
ローナル抗体ＰＢ２、モノクローナル抗体ＰＢ２３によ
るウエスタンブロットによる検出を行った。結果を表６
に示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】
【発明の効果】本発明の抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体
は、ＰＢ抗原に高い特異性を示すため、このモノクロー
ナル抗体を用いたＰＢ抗体の測定方法は、伝染性単核症
診断の際にＰＢ抗原の高純度な精製の必要がなく、かつ
吸収操作なしにホルスマン抗原、Ｈ−Ｄ抗原由来の反応
を除外することができ、伝染性単核症患者のスクリーニ
ングに有効である。それのみならず、生体中の微量なＰ
Ｂ抗原の検出にも有効である。
は、ＰＢ抗原に高い特異性を示すため、このモノクロー
ナル抗体を用いたＰＢ抗体の測定方法は、伝染性単核症
診断の際にＰＢ抗原の高純度な精製の必要がなく、かつ
吸収操作なしにホルスマン抗原、Ｈ−Ｄ抗原由来の反応
を除外することができ、伝染性単核症患者のスクリーニ
ングに有効である。それのみならず、生体中の微量なＰ
Ｂ抗原の検出にも有効である。
【図１】本発明の抗ＰＢ抗原モノクローナル抗体を用い
て、ウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
て、ウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図２】伝染性単核症患者及び健常人の血清により、抗
ＰＢ抗原モノクローナル抗体に対する競合阻害を行った
結果を示す図である。
ＰＢ抗原モノクローナル抗体に対する競合阻害を行った
結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/02 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 谷本 徹二 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 ポール・バンネル抗原を特異的に認識す
ることを特徴とする抗体。 - 【請求項２】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１に記載の抗体。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の抗体を用いること
を特徴とするポール・バンネル抗体測定方法。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の抗体を用いること
を特徴とする伝染性単核症の診断方法。 - 【請求項５】 請求項１又は２記載の抗体を用いること
を特徴とするポール・バンネル抗原検出方法。 - 【請求項６】 モノクローナル抗体が、モノクローナル
抗体ＰＢ２である請求項２記載の抗体。 - 【請求項７】 モノクローナル抗体が、モノクローナル
抗体ＰＢ２３である請求項２記載の抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9293452A JPH11116500A (ja) | 1997-10-09 | 1997-10-09 | 抗体及び診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9293452A JPH11116500A (ja) | 1997-10-09 | 1997-10-09 | 抗体及び診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11116500A true JPH11116500A (ja) | 1999-04-27 |
Family
ID=17794951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9293452A Pending JPH11116500A (ja) | 1997-10-09 | 1997-10-09 | 抗体及び診断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11116500A (ja) |
-
1997
- 1997-10-09 JP JP9293452A patent/JPH11116500A/ja active Pending
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